Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

אקסונים CNS נפצעו מצליחים להתחדש ולעתים קרובות לחזור ממקום הפציעה. האקסונים חסכו מהפגיעה הראשונית עשויים מאוחר יותר לעבור ניוון axonal המשני. חוסר היווצרות חרוט צמיחה, התחדשות, ואובדן של תחזיות axonal myelinated נוספות בחוט השדרה מאוד מגביל התאוששות נוירולוגית בעקבות פציעה. כדי להעריך איך מרכזי האקסונים myelinated של חוט השדרה מגיבים לפציעה, שפיתחנו vivo לשעבר המתגורר מודל חוט השדרה ניצול עכברים הטרנסגניים המבטאים חלבון צהוב ניאון באקסונים ומוקדים ופגיעה בחוט השדרה נגרם-לייזר לשחזור מאוד לתעד את גורלם של האקסונים והמיאלין (צבע ניאון lipophilic הנילוס אדום) לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות עירור שני פוטונים. תהליכים דינמיים כגון פגיעה חריפה axonal, הכחשה axonal, וניוון המיאלין נלמדים הטובים ביותר בזמן אמת. עם זאת, האופי הלא-המוקד של פציעות המבוססת על חבלה וחפצי תנועה נתקל בבמהלך in vivo איפור הדמיה חוט השדרה הבחנה תגובות פציעת axonal ראשוניות ומשנית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה מאתגר. לשעבר מודל חוט השדרה vivo המתואר כאן מחקה כמה היבטים של חבלה / פתולוגיות axonal מושרה דחיסה רלוונטיות קליני כוללים נפיחות axonal, היווצרות אליפטית, חיתוך רוחב axonal, ופרי-axonal נפיחות מתן מודל שימושי ללמוד תהליכים הדינמיים אלה בזמן אמת. יתרונות עיקריים של מודל זה הם ברזולוציה spatiotemporal מצוינת המאפשרת הבחנה בין העלבון העיקרי שפוגע ישירות אקסונים ומנגנוני פציעה משניים; עירוי מבוקר של חומרים כימיים ישירות לרחצת perfusate הכבל; שינויים מדויקים של הסביבה הסביבתית (למשל, סידן, יוני נתרן, תורמים ידועים לפציעת axonal, אבל כמעט בלתי אפשרית לתפעל in vivo); ומודלים עכבריים מציעים גם יתרון כפי שהם מספקים הזדמנות לחזות ולתפעל אוכלוסיות תאים מזוהות מבחינה גנטית ומבני subcellular. כאן אנו מתארים כיצד לבודד ותמונת חוט השדרה חי מעכברים כדי ללכוד דינמיקה של פגיעת axonal חריפה.

Introduction

ניוון של אקסונים הוא סיבה בולטת של תחלואה פורש כמה תנאי נוירולוגיות כוללים neurotrauma, שבץ, אוטו-אימוניות, ומחלות ניווניות. בניגוד למערכת העצבים ההיקפי (PNS), מערכת עצבים מרכזית יש אקסונים (CNS) קיבולת מוגבלת להתחדש נפצע פעם הן בשל חסמים פנימיים וחיצוניים (כלומר, מולקולות מעכבות לצמיחת axonal הופקה במהלך היווצרות צלקת ושחררה במהלך ניוון המיאלין) 1 -7. למרות שכמה ממחסומים אלה נחקרו בהרחבה, התערבויות טיפוליות שמטרתה למנוע ניוון axonal CNS, לקדם התחדשות axonal חזקה, ולשחזר connectively הפונקציונלי, תישאר מוגבל.

האקסונים מופרדים מפעם אחת סומה לעבור תהליך של הניוון סטריאוטיפי הידוע כניוון Wallerian המתאפיין בנפיחות axonal, היווצרות אליפטית ופיצול סופו של דבר (שנסקר ב8). בלעומת זאת, הגדם הפרוקסימלי שנותר ברציפות עם סומה של האקסון היקפי transected, יוצר נפיחות בקצה שלה, מת חזרה לצומת הקרובה ביותר ל Ranvier, ולאחר מכן יכול ליזום היווצרות חרוט צמיחה, תנאי חיוני נחוץ להתחדשות axonal הבאה 9-11. בניגוד לכך, הסופים axonal הפרוקסימלי של אקסונים רבים מרכזיים יוצרים "endbulbs" אופייני או נורות הכחשה, לא מצליחים ליצור קונוסים צמיחה, ובמקום לחזור ממקום הפציעה שם הם נמצאים במשך חודשים לאחר פציעת 12-15. בנוסף לפציעת axonal העיקרית, נזק / הפסד axonal נוסף עלול להתרחש גם לאקסונים שנחסכו במידה רבה מהפגיעה הראשונית. אובדן axonal עיכוב זה של אקסונים בתחילה חסכו מכונה ניוון axonal המשני כ. תגובה טבעית זו של האקסונים במערכת העצבים המרכזית לפגיעה הופכת התחדשות axonal תפקודית קשה עוד יותר להשיג את המטרה במוח ובחוט השדרה.

למרות חהllmarks פציעה axonal (למשל, היווצרות אליפטית, נורות הכחשה) מתאפיינת גם מרקמות שלאחר המוות ומודלים ניסיוניים של ניוון axonal, הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים הדינמיים אלה הוגבלה. רוב המחקרים האלה הסתמכו על תצפיות נקודת סיום סטטי שמטבעם לא הצליחו ללכוד תגובות axonal בודדות לאורך זמן. למרות אקסוגני מיושם קליעים נותבים axonal היו מועילים להבהיר תגובות axonal מסעיפי סטטי ובמהלך ההדמיה חיה, את הזמינות של סמני axonal מקודד גנטי השתפרה מאוד את היכולת שלנו לדמיין האקסונים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ואכן, דו"ח זרע מKerschensteiner והעמיתים סיפק ראיות ישירות של ניוון והתחדשות axonal הראשון in vivo באמצעות עכברי Thy1 -GFP-S שמקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק בתת קבוצות של תאי עצב ששולחים תחזיות שלהם בעמודות הגב של עמוד השדרהכבל 16. הדמיה חיה גישות באמצעות שתי מיקרוסקופיה פוטון סריקת לייזר (TPLSM) וסימון חלבון פלואורסצנטי הגנטי של תאי העניין ממשיך לספק ראיות ישירות ותובנה מכניסטית לרבים תהליכים דינמיים מגוונים כגון ניוון axonal, Ca 2 + איתות, התחדשות axonal, פיזיולוגיה astrocyte, פיזיולוגיה microglial, ותגובה לפציעה 17-25.

בניגוד לאקסונים, מעט מאוד ידוע של תגובות מיאלין לפציעה בזמן אמת. מיאלין הוא רכיב חיוני של חומר לבן המופק ומתוחזק על ידי oligodendrocytes בתאי מערכת העצבים המרכזית ושוואן בPNS. המיאלין מבודד 99% מהשטח של אקסונים ועל ידי כך מספק גבוהה התנגדות, כיסוי מגן נמוך קיבול התומך בהתפשטות מהירה ויעילה קופצנית דחף, נבדקה לאחרונה על ידי Buttermore et al. 26. כדי ללכוד את התגובה הדינמית של מיאלין לפציעתם אנו משתמשים solvatochromic, lipophilicצבע פלואורסצנטי הנילוס אדום 27. מאפייני solvatochromic של כתם חיוני זה מאפשרים משמרות רפאים של ספקטרום הפליטה שלה, כי הוא תלוי בסביבה הפיסיקלית הכימית 28,29. מאפיינים אלה הם שימושיים כדי לקבל תובנה מנגנונים של פגיעת axomyelinic וניתן דמיינו באמצעות dichroics כראוי נבחר ומסנני פליטה או נפתרו באמצעות מיקרוסקופ רפאים 27. לדוגמא, ספקטרום הפליטה של הנילוס האדום הוא בסביבות פחות קוטביות, שומנים בדם עשיר כמו אלה שנמצאו בתאי שומן והמיאלין במערכת העצבים המרכזית נורמלי (פליטת שיא ~ 580-590 ננומטר) 27 העבירו כחול. בניגוד לכך, פסגות ספקטרום פליטה של צבע חיוני זה ב ~ 625 nm בendbulbs נוצר כהאקסונים עוברות dieback axonal 27. למרות שהמנגנון המדויק שבסיס משמרות הרפאים האלה במיוחד בendbulbs לעומת המיאלין נורמלי עדיין אינו ברור, שינויי רפאים כזה עשויים לחשוף שינויים הבסיסיים בהצטברות חלבון או חוסר ארגון מוביל לחשיפה של אתרי קישור הידרופובי 27.

בעוד ההדמיה in vivo הוא המדד האולטימטיבי להתבוננות דינמיקת פציעת axonal חוט השדרה בסביבה הטבעית שלהם, זה מאתגר מבחינה טכנית ודורש מומחיות כירורגית משמעותית, ולעתים קרובות חוזרים ניתוחים לחשוף את העמודה הגבית שעשויה להציג את ממצאי ניסוי (למשל, דלקת וצלקת היווצרות). בנוסף, ציוד יקר יש צורך לעתים קרובות כדי לאפשר השעיה ומיצוב של בעלי חיים שלמים תחת העדשה האובייקטיבית מיקרוסקופ. בעלי החיים צריכים להיות במעקב צמוד וכן כדי להבטיח שהם יישארו חמים, כדי להבטיח נוזלים מתחדשות, ועל מנת להבטיח אין סימנים של חוסר חמצן בגלל ממושכת פגישות הדמיה בהרדמה. האחרון הוא חשוב מאוד כאקסונים והמיאלין בהחלט דורשים זלוף קבוע ורמות חמצן נאותות להישאר בת קיימא. עם זאת, זו היא לעתים קרובות לא דווחה או במעקב ברוב במחקרי vivo לתאריך. בנוסף, חפצי תנועה בשל קצב לב ונשימה (isoflurane מורדמים עכבר מבוגר: ~ 300-450 פעימות לדקה (BPM) היא אופטימליות כדי לשמור על 97-98% רוויון חמצן (שיעור ~ 632 BPM הרגיל) ו~ 55-65 נשימות לדקה (קצב נורמלי הוא ~ 163 נשימות לדקה), בהתאמה)) 30 נתקלו במהלך in vivo איפור הדמיה חוט השדרה הבחנה תגובות פציעת axonal ראשוניות ומשנית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה מאתגרים כמו גם סריקות הלייזר המהירות ביותר באופן בלתי נמנע כפופים לתנועה הבאות חפצים. התקדמות בסורקי התהודה ultrafast בשילוב עם חלון השדרה נוקשה מושתל ממוסגר עשויים לאפשר הדמיה של עמוד השדרה העכברית בבעלי חיים ער, אבל פעמים סריקה מהירה יותר באופן בלתי נמנע להפחית את האות לאיכות תמונה משפילה יחס רעש. שיפורים נוספים בטכניקות הדמיה חוט השדרה הכמשמשים כיום להדמיה מוחית יכולים להתגבר על מכשולים רבים של אלה ולהגביל את הבלבול פוטנציאלי שהוצג על ידי inaזלוף הרקמה dequate, למשל, 31-33.

הרבה ממה שידוע על פיזיולוגיה חומר לבנה ומנגנונים של פגיעה בחומר לבנה כבר נקבע באמצעות במבחנה או תכשירי vivo לשעבר של חומר לבן מעצב ראייה, עצבים היקפיים, ורצועות של חומר לבן בחוט השדרה 34-41. הכנות אלה ימשיכו לקדם את הידע של מנגנוני פציעה בחומר לבנים שלנו מאחר שהם מאפשרים מבוקרים שינויים בגורמים סביבתיים, יישום מבוקר של תרופות וחומרים כימיים, הערכות תפקודיות באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ותצפיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות של אקסונים והמיאלין ברקמה חי. ובכל זאת, כמה גישות קודמות להתבונן האקסונים מרצועות עמודה הגבי חוט השדרה או רצועות חומר לבנים הגחון בלתי נמנע לפגוע האקסונים פני השטח במהלך שלב הסילוק שעשוי להשפיע על התגובה של אקסונים התנגדו באופן הדוק. כדי לנצל את מניפולציות ניסוי לעיל ולמנוע נזק לveסיבי ר"י תחת חקירה, אנו משתמשים במודל כבל vivo לשעבר צוואר רחם השדרה כפי שהוא מונע מגע ישיר של ההיבט הגבי של החוט. לפיכך, את הארכיטקטורה של מאטר פיא ואקסונים טור גב שטחי סמוכים להישאר קיימא ומוטרד בבידוד.

כאן אנו מתארים גישה פשוטה יחסית, המאפשרת הדמיה ישירה של אקסונים myelinated המרכזיים כפי שהם באופן דינמי להגיב לפציעת מוקד בזמן אמת עד 8 - 10 + שעות לאחר פציעה. פגיעה בחוט השדרה המודל מושרה הלייזר (LiSCI) מאפשר הבחנה בין מנגנונים הראשוניים ומשניים פציעת axonal כנגע הראשוני (אתר אבלציה) נותר מוגבלים במרחב לאורך זמן. חדר ההדמיה פתוחה האמבטיה נגיש להתערבות טיפולית, משלוח מגיב, ומניפולציות סביבתיות. סוכני מגן axomyelinic משוערים ניתן להעריך במהירות בזמן אמת על ידי תצפיות ישירות לעומת ניסויים ממושכים ויקרים הכרוכים בתהליך הרקמהing, חתך, immunostaining, לכידת תמונה, וניתוח, ולכן מספק מודל פונדקאית שימושי כדי להעריך את תגובות חריפות ומניפולציות מגן לפני בדיקת הסוכנים הניסיוניים בבעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: נהלי כל החיה בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה לואיוויל, הקפדה על תקנות הפדרליות.

1. הכנת נמוכה Ca 2 + 2 מ"מ וCa 2 + מלאכותי נוזל השדרתי (aCSF) Perfusates

  1. הכן 2 + (0.1 מ"מ) חיץ 2x Ca הנמוך Stock C, Ca 2 + 2x הרגיל (2 מ"מ) במלאי חיץ, ו2x Stock B חיץ כפי שמתואר בטבלה 1. פתרונות המניות הבודדים מאפשרים שינוי של תוכן יון (למשל, נמוך או אפס Ca 2 +) ויכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
  2. לזלוף intracardiac במהלך נתיחה, להוסיף של 2x הנמוך Ca 2 + Stock C 100 מ"ל ושל 2x Stock B 100 מיליליטר לבקבוק פלסטיק כדי להפוך את Ca הנמוך 1x 2 + aCSF. לערבב ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס או לבצע טרי.
  3. לטפטוף של חוט השדרה vivo לשעבר במהלך מתאר לעצמיing, להוסיף 500 מיליליטר של נורמלי Ca 2 + Stock 2x ו -500 מיליליטר של 2x Stock B לתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר לייצר aCSF 1x. לערבב ולאחסן את הלילה בטמפרטורת חדר או לבצע טרי.
  4. התאם את ה- pH של מאגרי aCSF ל -7.4. תוך שמירה על aCSF בטמפרטורת חדר, למקם את Ca 2 + aCSF הנמוך על קרח ולאחר מכן בועת שני מאגרי גז carbogen (95% O 2; 5% CO 2) במשך 30 דקות לפני שימוש ורציף במהלך זלוף.

2. הכנת Ex Vivo הדמיה קאמרית

  1. לעטוף בשמיכת חימום (אין לכבות אוטומטי) סביב בקבוק aCSF ולהתאים חום להגדרה נמוכה / בינונית.
  2. הכנס קו זלוף aCSF ייעודי לבקבוק מחובר למשאבת זלוף ובאונליין דוד הנשלט על ידי בדיקה טמפרטורת בקר הטמפרטורה ומשוב דו קוטבית כפי שמוצגת באיור 1 א.
  3. צרף להוסיף במה מיקרוסקופ השטוח (152 x 102 מ"מ) לעירור / conf 2-הפוטוןהבמה מיקרוסקופ ocal מצוידת במכל לשפוך.
  4. הנח תא זלוף פתוח אמבטיה גדולה (H W x L x; 12 x 24 x 8 מ"מ) לתוך המכל לשפוך כדי להתאים ולספק זרימה רציפה של aCSF מחומצן הטרי לחוט השדרה לשעבר vivo (ראה איור 1 ב ללשעבר מתאים vivo הדמיה עיצוב תא).
  5. חבר יציאת פלט המתכת של התנור באונליין לחדר ההדמיה vivo לשעבר באמצעות צינורות מתאימים. הנח כרית סופגת דקה מתחת לחדר ההדמיה vivo לשעבר כדי לעזור לשמור על הטמפרטורה של החיץ / הרקמות במהלך הדמיה.
  6. לדבוק חדר ההדמיה vivo לשעבר לתחתית של להכניס את המכל לשפוך / שלב באמצעות סימון דביק נשלף. גמישות של נקודת סימון הדביקה תאפשר הקאמרית להיות מותאמת לפי צורך כדי להבטיח נתיב האור של המטרה הוא בניצב למשטח הרקמה. במידת צורך, להשתמש ברמת מרכז המטרה להתאים את החדר.
  7. Secureבדיקה באונליין משוב מחמם טמפרטורה ליד הכניסה הקאמרית הנוזל וצינור יניקת נירוסטה מחובר לקו ואקום ביציאה מהתא. מחזיקי סרט מגנטי וmicropipette המתאים שימושיים בהקשר זה. הפעל את מקור הוואקום.
  8. הפעל את משאבת זלוף להתחיל למלא את חדר ההדמיה עם aCSF מחומצן. הגדר את משאבת זלוף ל1.5-2 מיליליטר לדקה.
  9. לשלוט בעוצמת הקול של aCSF בחדר ההדמיה על ידי התאמת קו הוואקום. חשוב שיהיו מספיק aCSF בחדר ההדמיה כדי לכסות את קטע חוט השדרה ולאפשר מרחק עבודה מספיק בין מטרת טבילה במים ועל פני השטח הרקמות. המיאלין והאקסונים יכולים להיות מושפעים לרעה אם מגזר הרקמה לא טבל לחלוטין בaCSF מחומצן הטרי מוביל חפצים לניסוי מושרים.
  10. התאם את בקר טמפרטורת התנור באונליין, כך שטמפרטורת perfusate בחדר ההדמיה היא טמפרטורת החדר ליד.
<class = "jove_title" p> 3. Dissection של חוט השדרה למבוגרים Murine צוואר הרחם

  1. להרדים Thy1 מבוגר 6-10 שבוע ישן -YFP עכבר מהונדס (זן מתאים לשימוש שיש ביטוי חלבון פלואורסצנטי בנוירונים גנגליון שורש הגבי) על ידי הזרקה מנת יתר של נתרן pentobarbital הרדמה (200 מ"ג / קילוגרם) באמצעות הזרקת intraperitoneal.
  2. ברגע שמתחת לרמה הנאותה של הרדמה (למשל, אין תגובה לקמצוץ הבוהן ואובדן רפלקס מצמוץ), לגלח את העור שמעל חוט השדרה והמוח עם קוצץ כירורגית בזהירות. לטהר את העור באמצעות בטאדין ורפידות אתנול 70%.
  3. תרסיס חזה / אזור בטן עם אתנול 70%, תנקב את הנושא transcardially באמצעות Ca הנמוך מצונן, בועות-carbogen 2 + aCSF. (ראה תרשים 1C לספסל נתיחה הציע להקים עליון).
  4. הכבד מחוויר, לאבטח את מחט זלוף אל הלב באמצעות קליפ קטן. הפוך את הנושא כדי לגשת לצד הגב המגולח שלהנושא ולנגב את האזור המגולח עם אתנול 70%.
  5. לעשות חתך עור גב לאורך קו האמצע מתחיל מהאף לירך באמצעות מספריים לנתיחה כדי לחשוף את המוח ועמוד השדרה (איור 2 א). לאבטח את ההכנה על ידי הצבת סיכות באף ובירך.
  6. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה מנקודה זו ואילך, לחתוך בחוזקה על פני השטח הגבי של הגולגולת ברמה של נורות חוש הריח. הכנס אחד הטיפים המספריים לקצוות לרוחב של החתך וחתך בשולי הכיפה ילטרלי עד המוח הקטן.
    הערה: אל תחתכי לגמרי הכיפה כפי שנדרש מאוחר יותר כדי להרים את הרקמות שמעליה מחוט השדרה לאורך דיסקציה (ראה איור 2).
  7. הרם את הכיפה כדי לחשוף את המוח. בעדינות לחתוך את הקצוות שמאליים וימניים של עצם interparietal (הממוקם במוח הקטן) ולמשוך אותו חזרה caudally לחשוף את גזע המוח / חוט השדרה (איור 2 ג
  8. השתמש במספריים דקים שקצהו נערכו בזווית של 45 מעלות למשטח השולחן ולחתוך את החוליות דו-צדדי רק נחותות שורשי עצבים האחוריים.
    הערה: יש להימנע ממגע עם עמודות גב לבן הבוהקות. סיבים אלו הם אלה שיהיו צילמו (איור 2 ד) ויכול להיפגע בקלות.
  9. הרם את פני השטח כיפה וגב של עמוד השדרה עם מלקחיים קנס היטה, משייכתו בעדינות את הרקמה שמעליה בחתיכה אחת כמו קיצוצים נעשים כדי לחשוף את חוט השדרה. תמשיך לחתוך חוליות למפלס העליון של בית החזה כדי לבודד קטע 1-2 סנטימטר של חוט צוואר הרחם להדמיה הבאה (איור 2E).
  10. השתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה המקבילה / עצם עמוד השדרה והרקמות ברורות מתחת לעמודה. לבצע חתכים אלה כרמה ככל האפשר. זה מאוד חשוב כי הרקמה מונחת ישר בחדר, כך שהכבל היא רמה להדמיה.
  11. השתמש באזמל # 11 ויחצה את גזע המוח (בעברסיום של סיבי fasciculus החינניים) והן ברמת בית החזה העליונה לבודד את קטע חוט השדרה הצווארי (ראה תרשים 2F). השתמש במספריים לחיתוך ברקמה / עצם באותו שתי נקודות הללו. הרקמה המבודדת צריכה להכיל 2/3 של עמוד השדרה המקיף את גזע המוח הזנב, הרחבת צוואר רחם, וחוט השדרה החזי עליון (איור 2G).
  12. הנח את עמוד השדרה המבודד לצלחת פטרי של, Ca הנמוך המקורר-מבעבע carbogen 2 + aCSF. במידת צורך, לחתוך את הרקמה מתחת לעמוד השדרה עד שמונח ישר בצלחת.
  13. העבר את עמוד השדרה המבודד לvivo לשעבר חדר ההדמיה ולהגדיל בהדרגה את טמפרטורת perfusate מעל 1 שעה ל36-37 מעלות צלזיוס. לשמור על טמפרטורה זו במהלך הדמיה.

4. מיקום של כבל Ex Vivo השדרה להדמיה קאמרית והמיאלין תיוג עם הנילוס אדום

  1. לאבטח היטב את עמוד השדרה בiתא maging עם הפרוסה הולמת מתאימה החזק שונה עם פלטפורמת רשת אנכית המורכבת מנושאי לייקרה משובחים (להסיר אשכולות אמצע פלטפורמת רשת כדי לאפשר מקום לחוט השדרה, ראה איור 3 א).
  2. להפשיר aliquot של Red הנילוס (5 מניות מ"מ DMSO ו0.22 מיקרומטר המסונן; יכול להיות מאוחסן במשך חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס, או 6 חודשים ב -20 ° C בחושך). רק לפני הוספת הנילוס האדום לחדר ההדמיה, להפחית את הזרימה של משאבת זלוף ולהתאים את קו הוואקום כדי להבטיח את הנוזל בתא תמיד מכסה את חוט השדרה.
  3. הוספת פתרון מניות 5-10 μl הנילוס האדום לחדר ההדמיה לקראת סוף הזנב של הכבל (איור 3). השתמש פיפטה 1 מיליליטר לערבב בעדינות הנילוס אדום ברחבי החדר. לאפשר הנילוס האדום להישאר בחדר במשך 1-2 דקות, ואז למקם את קו ואקום אחורי ולהתאים משאבת זלוף ל1.5-2 מיליליטר לדקה לינקב בחוט השדרה ברציפות.
  4. להעלות את הבמה מיקרוסקופ בזהירותוליישר את המטרה עם המרכז של מגזר חוט השדרה ומדיאלית על עמודות הגב עד אובייקטיבי טבילה במים הוא כ -10 מ"מ מפני שטח של aCSF בתא. השתמש בגלגל פוקוס מזנקי מיקרוסקופ כדי להביא את המטרה לאט למטה עד שנוגע בעדינות את פני השטח של aCSF. השתמש במקור אור epifluorescent להתמקד עמודות הגב לשדה הראייה (איור 3 ג).

5. Ex Vivo הדמיה של כבל עכבר השדרה עם TPLSM וחוט השדרה מושרה לייזר פגיעה (LiSCI)

הערה: הווריד האחורי מספק סמן שימושי כדי למרכז את הרקמה כסיבי fasciculus החינניים (מקורן גוף תא של גרעיני שורש הגבי ולעלות מT6 ומתחת לאורך קו האמצע של חוט השדרה) במקביל לכלי דם זה. + תחזיות עבות YFP צוואר רחם גב השורש גם מספקות סמן שימושי כמו Ascend הסיבים ויורדות רוחבי לYסיבי FP + fasciculus החינני שהם קטנים יותר בקוטר.

  1. ברגע שרקמת חוט השדרה מיושרת כראוי, עבור למצב סריקת לייזר לבצע הדמיה בסיסית של סיבי myelinated fasciculus החינני עולים. כדי לעורר את שני YFP והנילוס האדום, להשתמש במקור לייזר שני פוטונים מכוון לגל 950 nm (~ 17 mW נמדד ביציאה של 25x, 1.1 אובייקטיבי NA) וdichroics המתאים (DM) ומסנני bandpass לבודד את פליטת הניאון של fluorophores (אנו משתמשים DM560 525/50, 600/60 DM640, ו685 / 70, להפריד YFP, והנילוס אדום לצהוב-כתום, וערוצים אדומים מורחבים, בהתאמה).
    1. אם יותר מ -3% מהאקסונים להראות spheroids axonal במהלך ההדמיה בסיס (30-60 דקות), לבטל את ההכנה בשל ממצאים הנוצרים על-הנסיין.
  2. לגרום LiSCI על ידי מגדלת שדה הראייה ל30.3X (כדי ליצור ~ 20 מיקרומטר אבלציה קוטר). Tune הלייזר עד 800 ננומטר, ולהגדיל את כוחו של הלייזר ל~ 110 mW בהמדגם. הרשה 5 תחום סריקות לייזר תצוגה מלא כדי להבטיח סיבי transected לחלוטין.
  3. לאשר LiSCI על ידי שינוי הגדרות בלייזר בחזרה להגדרות הדמיה (950 ננומטר, 17 mW במדגם, 2.08X) ולסרוק את הרקמות כדי להמחיש את אבלציה. ודא בקוטר של אבלציה ושהאקסונים מלוטשים הראשוניים transected לחלוטין (ראה איור 3D). השתמש בהגדרות הזמן לשגות במיקרוסקופ בשילוב עם לכידת z כדי להקליט את התגובה הדינמית של אקסונים ומיאלין לפציעה עד 8-10 + שעות לאחר פציעה.
    הערה: אם אבלציה אינה שלמה (כלומר, חיתוך רוחב שלם של סיבים), לבטל את ההכנה, כקביעת מנגנוני פציעה ראשוניות ומשניים יהיה מבולבלות. בנוסף, ניתן הדמיה מגזרי חוט השדרה מבודדת עד 24 שעות לאחר LiSCI עם רק קל עד בינוני נזק לרקמות LiSCI-עצמאית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרטים של מעבדה מתאימה להגדיר צורך לבודד, לשמור על כדאיות, ותמונה בעמוד השדרה vivo לשעבר מוצגים באיור 1. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד בליזר מתכונן פעם femtosecond, dicroics המתאים ומסנני פליטה, ומים טבילת עדשה אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה (≥1.0). כדי להבטיח יכולת קיום של חוט השדרה במהלך הניתוח, ההליך צריכה להתבצע בנוכחות aCSF 2 + Ca הצונן מחומצן הנמוך המאפשרת מספיק Ca 2 + לממברנות axonal המבודדות לאטום 42. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לניזק axomyelinic כוללים הפרדה של מיאלין מaxolemma והיווצרות אליפטית axonal נראית בבירור במהלך הדמיה בסיסית. נציג תמונות של התהליך לנתיחה ובידוד של חוט השדרה vivo לשעבר מוצגת באיור 2. בידוד בעקבות הכדאיות של חוט השדרה היא מ 'aintained ידי זלוף הרציף של aCSF מחומצן אשר נשמר ב36-37 C °. לאחר מכן ניתן להוסיף את כתם המיאלין הנילוס האדום 27,43 לתא זלוף, והקלטות בסיס של fasciculus החינני האקסונים myelinated יכולים להתחיל (איור 3).

נציג תמונות של אקסונים fasciculus myelinated החינניים מוצגות באיור 4. בתנאים בסיסיים הקלטות TPLSM timelapse לחשוף + אקסונים YFP מיושר מקבילים ensheathed במיאלין (הנילוס האדום) בקטרים ​​במידה רבה קבועים לאורכו של האקסון. spheroids axonal כמה או סימנים מורפולוגיים אחרים של ניוון axonal נמצאים. בשל מאפייני solvatochromic של הנילוס אדום ותוכן שומנים והחלבונים המיאלין, מיאלין מוכתם כתום-צהובה ואילו שורות של גופי תא oligodendrocyte המשוער מופיעות כתומות כהה (איור 4 א). יכולים גם להיפתר פרטים קטנים כגון צמתים של Ranvier (למשל, חיצים ב

בשעת 10 בדקות הבאות LiSCI, האקסונים transected מייד (פציעה ראשונית) ממוקמים מקורי ואת הזנב לאתר אבלציה מתחילים לחזור ממקום הפציעה ויוצרים סלילים דמויי sigmoidal בתוך המיאלין התופח הנפוח. המיאלין ensheathing האקסונים מרחוק לאבלציה מופיע ללא שינוי נקודה זו בזמן. ב -40 דקות שלאחר LiSCI האקסונים העיקריים ביותר transected והאקסונים עוברים ניוון המשני (כלומר בתחילה חסך מהעלבון אבל המנוון מאוחר יותר) יוצר endbulbs האופייני כפי שהם לחזור בו מאתר הנגע (איור 4). כשליש מהאקסונים transected אלה לעבור פאן-פיצול שבו הגלים הראשונים המקטע הפרוקסימלי, יוצר spheroids axonal, וסופו של דבר חתכי האקסון לכמה אורכים סדירים של האקסון 43. הפרדה של מיאלין מאקסונים (פרי-axonal נפיחות) וניוון לפוחי של המיאלין ניכר גם. במשך זמן טראן, יסודי והתיכוניהאקסונים sected ממשיכים לחזור בי ממקום הנגע, האקסונים איגוף אתר אבלציה מייד עוברים ניוון משני, ונפיחות פרי axonal הופכת בולטת יותר, כמו גם המיאלין נפיחות וניוון לפוחי (איור 4D-G, ראה גם 43). הבדל ברור בהיקף נסיגת axonal מתברר בין גדמים הפרוקסימלי axonal (הזנב לנגע) והמגזרים שלהם דיסטלי (מקורי לנגע) שמיועדים לעבור ניוון Wallerian (איור 4D-G). האקסונים בתחילה חסך על ידי LiSCI לעבור ניוון מתעכב המשני (איור 4H). ניסוי שליטת נציג בלי LiSCI, מצביע על כך שפגישות הדמיה ארוכות (עד 13 שעות לאחר בידוד כבל בדוגמא זו) הן אפשריות מבלי לגרום לתופעות לוואי לשלמות חומר לבנה (איור 4I, J).

גבוה reso נציגתמונות-פתרון של שינויי axomyelinic לאחר LiSCI מוצגות באיור 5.

על ידי 3 שעות לאחר LiSCI, כמה אקסונים הפרוקסימלי (הזנב) שחזרו ממקום הנגע שם הם נמצאים בתוך צינורות המיאלין הנפוחים שנפרדו מהאקסון. endbulbs axonal אחר להיראות כתרים על ידי המיאלין (איור 5 א). האקסונים סמוכים לאתר אבלציה לעבור ניוון המשני ואילו אחרים מופיעים מושפעים. שלפוחית ​​YFP נמוכה / שלילית משוערת (בצבע תכלת) בתוך האקסון וendbulbs axonal גם בהווה. בניגוד לcaudally חוזר בי סיבים, רוב endbulbs rostrally חוזר בי axonal וspheroids ב -3 שעות שלאחר LiSCI הם מאוד שכותרתו עם הנילוס האדום (פחות כחול עבר) מעיד על שינוי סביבתי בתוך האקסון (איור 5). הכותרת אדומה הנילוס אזורים בתוך אקסונים באופן פעיל חוזרים בי מופיעים להקיף או כובע ליבת axonal בעיקר. למרות המיקום וIDE המדויקיםntity של מבנים שכותרתו אדום הנילוס תוך axonal אלו אינם ידועים כיום, הם עשויים לייצג הצטברות שלפוחית ​​צפופה באמצעות תחבורת axonal ו / או חלבונים ביקעו חשיפת הליבה הידרופובי שלהם 27. המיאלין שכותרת הנילוס האדום נשאר בעיקר כתום צהובה במיאלין מופיע נורמלי. בהבחנה, הנילוס האדום חקר המיאלין לפוחי מופיע צהוב (כלומר כחול עבר) מעיד על שינויים סביבתיים בתוך מבנים אלו. ב -7 שעות לאחר האקסונים LiSCI להמשיך חוזרים בי ממקום הנגע; עם זאת, זה בולט יותר במקורי (איור 5D) לעומת הזנב endbulbs (איור 5 ג). אקסונים אחרים לעבור התפוררות מלאה או חלקית עוזבת צינור המיאלין ריק או גבעול דק כמה מיקרונים מהמגזר המנוון. יישום מושהה של הנילוס אדום לאחר LiSCI מגלה תיוג axonal דומה כמו לפני יישום של הנילוס אדום מרמז כי אבלציה כשלעצמם ואפקטים תרמיים פוטנציאליים על denaturation חלבון הואסביר אחראי למשמרות הנילוס האדום רפאים במיאלין ואקסונים לאחר פציעה (איור 5E, F).

באופן קולקטיבי, נתונים אלה ממחישים את התועלת של מודל LiSCI vivo לשעבר לחקות מנגנונים ידועים עדיין אינו מובן כהלכה פציעה axomyelinic האקוטית בזמן אמת. המודל עשוי אפוא להיות שימושי כדי לקדם את הידע של הפתופיזיולוגיה של פגיעה בחומר לבנה שלנו, ולחשוף מטרות מולקולריות מפתח לשמירה על שלמות חומר לבנה.

איור 1
איור 1: סקירה כללית של ההתקנה לנתיחה והדמיה. (א) הציע הגדרה להדמית vivo לשעבר של חוט השדרה. הציוד העיקרי הנחוץ כולל קו גז (2 CO 2/5% 95% O) carbogen לחמצן aCSF, משאבת זלוף, כדי לספק את carbogen-bubדימם aCSF באמצעות מכשיר באונליין בקר דוד / טמפרטורה מצויד בבדיקת משוב טמפרטורה, ומצויד במקור ואקום חדר הדמיה נועדה פתוחה אמבטיה. (ב) ההגדלה גבוהה יותר של חדר האמבטיה ההדמיה מוצגת. (C) הציעה הגדרה לזלוף ונתיחה של חוט השדרה vivo לשעבר. Ca הנמוך המקורר 2 + aCSF הוא מחומצן עם carbogen ומשמש כדי לשמור על יכולת קיום של חוט השדרה במהלך לנתיחה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. בידוד של חוט השדרה להדמיה () תחת מצונן Ca הרציף, מחומצן הנמוך 2 + זלוף skullcap חשוף. (ב) מבצעת חתך דרך פני השטח הגבי של הגולגולת ברמה של נורות חוש הריח (קו מקווקו). לאחר מכן נעשו חתכים דו-צדדיים (C) דרך הגבולות לרוחב של הכיפה עד שזה יכול להיות בעדינות הרים ומשך את caudally (בכיוון החץ) כדי לחשוף את גזע המוח. (ד) המשך חתכים דו-צדדיים עם מספריים עדינים היטה לחתוך את ההיבטים הרוחביים של החוליות ולחשוף את העמודות הגבי (ראש חץ). (E) נחשף גזע המוח והרחבת צוואר רחם כולו למגזר החזה העליון של חוט השדרה מוצגים. (F) שני חתכים בסכין 11-אזמל מספר עשויים לבודד את חוט השדרה בגזע המוח, מעבר להפסקות החינניות axonal fasciculus ומפלס העליון של בית חזה ( קווים מקווקווים). (G) בחוט השדרה המבודד הוא הועבר לאחר מכן לצלחת פטרי המכילה Ca 2 + הנמוך המצונן aCSF מבעבע עםגז carbogen. שורשי גב צוואר רחם (למשל, ראשי חץ), גנגליון שורש הגבי, ואת חוט השדרה ממגזר החזה העליון לגזע המוח (~ 15-20 מ"מ) נותרים ללא פגע. בר סולם בG:. 2 מ"מ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. הדמיה חוט השדרה לשעבר vivo (א) ממוקם ברגע שבתא, רקמת חוט השדרה היא מאובטח באמצעות רקמה / הפרוסה שונה החזק את מצוידת בנושאי לייקרה כתם המיאלין (B) הנילוס האדום מתווספת ישירות ל. חדר ההדמיה. (ג) מטרת טבילה במים הוא שקוע לתוך aCSF וממוקם מעל סיבי fasciculus החינניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. מודל LiSCI של פגיעת האקסון myelinated המרכזית TPLSM שימש כדי ללכוד את הדינמיקה של תגובות האקסון והמיאלין הבאים LiSCI (*). נציג תמונות מוצגות כתחזיות בעוצמה מקסימלית של חמש 1 מיקרומטר סעיפים אופטיים עבים שנתפסו ב0.24 מיקרומטר / פיקסל עם מיקרוסקופ + multiphoton / confocal Nikon A1RMP מצויד ב25x; NA: 1.1; WD: המטרה של טבילה במי 2 מ"מ. סטנדרטי dichroics ומסנני פליטה שמשו להפרדת YFP + אקסונים (DM560 525/50, מוצגים בכחול) וצבע ניאון lipophilic solvatochromic הנילוס Red לקצר יותר (600/60 DM640, מוצג בירוק) ועוד (685/70 ננומטר, שמוצג באדום) ערוצי פליטה. שני שילובי המסנן האחרונים הם יתרון כפי שהם ללכוד משמרות רפאים הידועות של הנילוס האדום בסביבות פיסיקליות כימיות שונות. (א) באקסונים תנאי בסיס (YFP +, כחול) והמיאלין (NR, כתום-צהוב) מופיע בדרך כלל מכוון עם כמה spheroids או סימנים אחרים של פגיעת axomyelinic. שורות של גליה עם מורפולוגיה אופיינית oligodendrocytes חומר הלבנה (NR, כתום כהה, למשל ראשי חץ) הם גם נראים (חלק מסומן לבהירות), ומבנים עדינים כגון צמתים של Ranvier גם נפתרים (למשל חיצים). (ב) בשעה 10 דקות לאחר LiSCI, האקסונים transected ממוקמים מקורי ואת הזנב לנגע ​​מתחילים לחזור ממקום הפציעה ויוצרים סלילים (חיצים) sigmoidal-כמו במיאלין הנפוח. המיאלין ensheathing האקסונים מרוחקים מאבלציה מופיע ללא שינוי נקודה זו בזמן. (C) Bהאקסונים y 40 דקות לאחר LiSCI העיקרי ביותר transected והאקסונים עוברים endbulbs אופייני צורת ניוון משנית כפי שהם לחזור בו מאתר הנגע (ראשי החץ). גם כמה אקסונים transected יוצרים spheroids לאורך האקסונים (חיצים). הפרדה של מיאלין מהאקסון (נפיחות פרי axonal) וניוון לפוחי של המיאלין ניכר גם (+). (DG). במשך זמן, האקסונים נפצעו ראשוניים ומשניים ממשיכים לחזור בי ממקום הנגע, וכפי שמוצג על ידי תחזיות YZ של LiSCI, האקסונים בתחילה חסכו איגוף אתר אבלציה עוברים עכבו ניוון המשני (H, לוח שמאלי לפני LiSCI, פנל באמצע 10 דקות לאחר LiSCI, ופנל 7 שעות מייד אחרי LiSCI; נקודות לבנות לסמן LiSCI הראשוני, נקודות אדומות מצביעות הפסד של אקסונים ב -10 דקות ונקודות ירוקות מצביע על ידי 7 שעות המידה של ניוון משני מעוכב של אקסונים). נפיחות פרי-axonal הופכת בולטות יותר בנקודות זמן מאוחר יותר לאחר LiSCI. O במידההכחשה axonal f ומורפולוגיה של endbulbs axonal בין גדמי האקסון הפרוקסימלי והמגזרים הדיסטלי שלהם גם מתבררת (ראה גם איור 5 לתמונות בהגדלה גבוהות יותר). בר סולם:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. תמונות ברזולוציה גבוהה נציג של שינויי axomyelinic לאחר LiSCI TPLSM היה משמש ללכידת פרטים מורכבים של האקסון והמיאלין משנה הזנב (A, C) ומקורי (B, D) לפגיעה בשעה 3 (A, B) ו 7 שעות (C, D) הבא LiSCI. נציג תמונות מוצגות כתחזיות בעוצמה מקסימלית של שלוש 1 מיקרומטר סעיפים אופטיים עביםנתפס ב.0832 מיקרומטר / פיקסל עם + multiphoton / מיקרוסקופ confocal Nikon A1RMP. () הזנב לLiSCI (*), כמה אקסונים (הכחול) (ראשי חץ גדולים) הם חוזרים בי ממקום הנגע בתוך צינורות המיאלין נפוחים (כתום-צהוב ) שמופרד מendbulb axonal. האקסונים חלק סמוכים לאתר אבלציה לעבור ניוון המשני (ראשי חץ קטנים) ואילו אחרים מופיעים מושפעים. שלפוחית ​​YFP נמוכה / שלילית משוערת (חיוורת כחולה) בתוך האקסון וendbulbs axonal נמצאים (חיצים). צומת של Ranvier (n) מרכזית היא גם נראה בבירור באמצעות טכניקת הדמיה ותיוג זה. (ב) בניגוד לcaudally חוזר בי סיבים, רוב endbulbs axonal rostrally חוזר בי וspheroids ב -3 שעות שלאחר LiSCI הם מאוד שכותרתו עם הנילוס אדום (ורוד). אזורי שכותרתו האדום הנילוס באקסונים חוזרים בי מופיעים להקיף בעיקר או כובע YFP אקסונים שכותרתו (כחולה, ראשי חץ גדולים). למרות שהטבע של הנילוס האדום-תווית אלהמבני ed אינם ידוע כרגע, הם עשויים לייצג הצטברות שלפוחית ​​צפופה באמצעות תחבורת axonal ו / או חלבונים ביקעו חשיפת הליבה הידרופובי שלהם. בהבחנה, הנילוס האדום שכותרתו מיאלין לפוחי (חיצים) מופיע צהוב (ספקטרום כלומר הוא כחול עבר) בהשוואה ל( כתום-צהוב) המיאלין נורמלי, מעיד על שינויים סביבתיים המשוערת בתוך לשעבר. נפיחות פרי-axonal היא גם (ראשי חץ קטנים) ניכר. בשעת 7 שעות לאחר LiSCI, האקסונים להמשיך חוזרים בי ממקום הנגע; עם זאת, זה בולט יותר במקורי (D) לעומת הזנב endbulbs (C). האקסונים חלק לעבור התפוררות מלאה או חלקית עוזבת צינור ריק המיאלין (חץ בC) או גבעול דק כמה מיקרונים מהמגזר המנוון (חיצים קטנים בD), בהתאמה. יישום מושהה של הנילוס אדום מייצר משמרות רפאים דומות בזנב לעומת האקסונים myelinated מרכזיים מקורי (E ו- F (C, D). בר סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2x במלאי (2 מ"מ Ca 2 +) מֵגִיב מ"מ
NaCl 252
KCl 6
CaCl 2 • 2H 2 O 4
2x Stock B לאא 2 PO 4 2.5
4 MgSO 4
NaHCO 3 52
דקסטרוז (D-גלוקוז) 20
2x Ca 2 + נמוכים Stock C (0.1 מ"מ Ca 2 +) NaCl 252
KCl 6
MgCl • 6 שעות 2 O 3.8
CaCl 2 • 2H 2 O 0.2

טבלת 1: נוזל השדרתי מלאכותי מאגרים (aCSF).

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
  3. McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
  4. Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
  5. Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
  6. Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
  7. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  8. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  9. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
  10. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
  11. Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
  12. Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
  13. Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
  14. McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
  15. Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
  16. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  17. Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
  18. Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
  19. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
  20. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
  22. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  23. Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
  24. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  25. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
  26. Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
  27. Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
  28. Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
  29. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  30. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
  31. Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
  32. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
  33. Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
  34. Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
  35. Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
  36. Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
  37. Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
  38. Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
  39. Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
  40. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
  41. Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
  42. Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
  43. Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).

Tags

Neuroscience גיליון 93 פגיעה בחוט השדרה האקסון מיאלין מיקרוסקופיה עירור שני פוטונים הנילוס אדום ניוון axonal dieback axonal הכחשה axonal
<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okada, S. L. M., Stivers, N. S.,… More

Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter