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Neuroscience

アン Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

負傷CNSの軸索が再生し、多くの場合、離れて、損傷部位から退避に失敗する。最初の損傷から免れる軸索は、後に二次的軸索変性を受けることができる。脊髄内の追加髄軸索投射の成長円錐の形成の欠如、再生、および損失が大幅に損傷後の神経学的回復を制限します。脊髄の髄軸索が傷害に応答するかを中央評価するために、我々は、軸索に黄色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いたex vivoでの生活脊髄モデルとの運命を文書化するための焦点と再現性の高いレーザー誘起脊髄損傷を開発二光子励起タイムラプス顕微鏡を用いて軸索と時間をかけてミエリン（親油性蛍光色素ナイルレッド）。そのような急性の軸索損傷、軸索退縮、およびミエリン変性などの動的プロセスは、最高のリアルタイムで研究されている。しかし、挫傷ベースの怪我や運動アーチファクトの非焦点性質が遭遇in vivoでの脊髄撮影時の挑戦的な高解像度の顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化する。ここで説明するex vivoでの脊髄モデルは軸索腫脹、回転楕円体の形成、軸索切断し、リアルタイムでこれらの動的過程を研究するために有用なモデルを提供して腫れ周囲の軸索を含む臨床的に関連する挫傷/圧縮によって誘発される軸索の病態のいくつかの側面を模倣。このモデルの主な利点は、直接軸索と二次的損傷のメカニズムを傷つける主要侮辱間の区別を可能にする優れた時空間分解能である。直接灌流液入浴コードへの試薬の制御注入。環境環境（ 例えば、カルシウム、ナトリウムイオン、軸索損傷に対する既知の貢献者が、 生体内で操作することが不可能に近い）の正確な変化は、それらは可視化する機会を提供したように、マウスモデルも利点を提供遺伝的に同定された細胞集団および細胞内構造を操作します。ここでは、急性の軸索損傷のダイナミクスをキャプチャするためにマウスから住んで脊髄を分離して画像にする方法について説明します。

Introduction

軸索の変性は神経外傷、脳卒中、自己免疫、および神経変性疾患を含むいくつかの神経学的状態にまたがる罹患率の顕著な原因である。末梢神経系（PNS）、中枢神経系とは異なり（CNS）の軸索は、一度による内因性および外因性障壁（ すなわち、ミエリン変性時の瘢痕形成の間に生成され、遊離した軸索成長の阻害分子）1の両方に負傷再生する限られた能力を有している-7。これらの障害のいくつかは、広く調査されてきたが、CNS軸索変性を防ぐ頑強な軸索再生を促進し、機能的な連結的に復元することを目的とした治療的介入は、限定されるもので残る。

一度彼らの相馬から分離軸索は軸索腫脹、回転楕円体の形成及び（8にレビュー）最終的な断片化することを特徴とするウォーラー変性として知られている変性のステレオタイプのプロセスを経る。で対照的に、離断周辺軸索の細胞体との連続性に残る近切り株は、その端部に腫脹を形成し、バックランヴィエの最も近いノードに死亡した後、その後の軸索再生のために必要な成長円錐の形成、重要な前提条件を開始することができます9-11。対照的に、多くの中央軸索の軸索近位末端は、特徴的な「endbulbs」または後退電球を形成成長円錐を形成し、その代わりに離れて、それらが損傷した後に12〜15ヶ月のままで、損傷部位から後退させることができない。主要な軸索損傷に加えて、追加の軸索損傷/損失も大幅に最初の損傷から免れた軸索に発生する可能性があります。最初は免れる軸索のこの遅延軸索損失は、二次的軸索変性と呼ばれている。傷害にCNSの軸索のこの固有の応答は、機能的な軸索再生の脳や脊髄に達成するために、さらに困難な目標をレンダリングします。

haであるが軸索損傷（ 例えば、回転楕円体の形成、後退電球）のllmarksがよく、死後組織と軸索変性の実験モデルから特徴づけられている、これらの動的プロセスの根底にある分子メカニズムの解明が制限されています。これらの研究のほとんどは、本質的に時間をかけて、個々の軸索の応答を捕捉するために失敗した静的なエンドポイントでの観察に依存していた。しかし、外因的に軸索トレーサーは静的セクションから、ライブイメージング中の軸索の応答を解明する有用であった適用、遺伝的にコードされた軸索マーカーの可用性が大幅に蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで軸索を可視化する当社の能力を向上させた。実際、ケルシェンシュタイナーや同僚からの精液報告書は、第一脊髄の背側の列に自分の予想を送るニューロンのサブセットで緑色蛍光タンパク質をコードしてはThy1 -GFP-Sのマウスを用いたin vivoでの軸索変性と再生の直接的な証拠を提供したコード16。ライブイメージングは、2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）を使用して接近し、関心のある細胞の遺伝的蛍光タンパク質標識は、軸索変性のような多くの多様な動的プロセスへの直接的な証拠と機構的洞察を提供し続けたCa 2+シグナル伝達、軸索再生、星状細胞生理学、ミクログリア生理学、傷害17-25への応答。

軸索とは対照的に、ほとんどリアルタイムで負傷ミエリン反応知られている。ミエリンは、PNSにおけるCNSおよびシュワン細胞におけるオリゴデンドロサイトによって生成され、維持白質の重要なコンポーネントです。ミエリンは、軸索の表面の99％を絶縁し、そうすることによって、最近Buttermore らによる審査、迅速かつ効率的な跳躍インパルス伝播をサポートする高抵抗、低容量保護カバーを提供しています。26。傷害に対するミエリンの動的応答をキャプチャするために、我々はソルバ、親油性を使う蛍光染料ナイルレッド27。この生体染色のソルバトクロミック特性は、物理化学的環境28,29に依存し、その発光スペクトルのスペクトルシフトを可能にする。これらの特性は、axomyelinic損傷のメカニズムへの洞察を得るために有用であり、適宜選択ダイクロイックおよび発光フィルターを用いて可視化またはスペクトル顕微鏡27を使用して解決することができる。例えば、ナイルレッドの発光スペクトルは、ブルーシフトなどの脂肪細胞と正常なCNSミエリン（発光ピーク〜580から590 nm）の27に見られるような極性の低い、脂質の豊富な環境である。対照的に、〜625nmの軸索として形成endbulbsであるこの生体染色色素の発光スペクトルのピークは、軸索立ち枯れ27を受ける。通常のミエリンに対するendbulbsで特異的にこれらのスペクトルシフトの基礎となる正確なメカニズムは不明であるが、このようなスペクトルの変化は、タンパク質の蓄積や組織崩壊につながる基礎となる変化を明らかにすることができる疎水性結合部位27の露出。

in vivoイメージングは、それらのネイティブ環境で脊髄軸索損傷のダイナミクスを観察するための究極の測定基準であるが、それは技術的に困難であり、かなりの外科専門知識を必要とし、多くの場合、実験の成果物（ 例えば、炎症や傷跡を導入することが脊柱を露出するために手術を繰り返す形成）。また、高価な機器は、多くの場合、顕微鏡対物レンズ下で無傷動物の懸濁液及び位置決めを可能にするために必要とされる。動物は慎重に、彼らは、流体が補充されることを確認するために、そして長引く麻酔をイメージングセッションに低酸素症の兆候がないことを確認するために、温かいまま確保するためにも監視する必要がある。軸索とミエリンは絶対生存したまま一定灌流および適切な酸素レベルを必要とする後者は非常に重要である。しかし、これは、しばしばin vivo研究ほとんどの報告または監視されていない日付。による心拍数及び（イソフルラン麻酔成体マウスの呼吸に加えて、動きアーチファクト：〜毎分300〜450ビート（BPM）は、97から98パーセントの酸素飽和度（通常レート〜632 BPM）および〜55-65呼吸を維持するために最適であるでも最速のレーザースキャンが避けられないこれらの動きを受けますように、生体内の脊髄イメージング中に発生した））は、それぞれ、（通常のレートは毎分〜163呼吸である）毎分30は、挑戦的な高解像度の蛍光顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化するアーティファクト。移植可能な剛性椎フレームウィンドウと組み合わせる超共鳴スキャナの進歩は、覚醒動物におけるマウス脊髄のイメージングを可能にすることができるが、より速いスキャン時間が必然的に画質を劣化させる信号対雑音比を減少させる。 、現在、脳イメージングに使用脊髄イメージング技術の更なる改善は、これらの障害の多くを克服し、伊那によって導入ポテンシャル交絡を制限することができるdequate組織灌流、 例えば、31-33。

白質生理学および白質損傷のメカニズムについては知られていることの多くは、 インビトロまたは視神経、末梢神経、および脊髄白質34-41のストリップからの白質のエクスビボ調製物において使用して決定されている。これらの製剤は、彼らが環境要因で制御さの変化、薬剤や試薬の制御された適用、電気生理学を用いて機能の評価、および生体組織における軸索とミエリンの直接の蛍光顕微鏡観察を可能にするように白質傷害メカニズムの知識を進めるために続けている。しかし、脊髄後カラムストリップまたは腹側白質ストリップから軸索を観察するためにいくつかの以前のアプローチは、不可避的に密接に反対した軸索の応答に影響を与える可能性が除去段階で表面軸索を傷つける。上記の実験操作を活用し、VEのへの損傷を避けるため、それはコードの背側面の直接接触を防止するように、調査中のryの繊維は、我々は、ex vivoで頸髄モデルを使用する。このように、軟膜と隣接する表面的な脊柱軸索のアーキテクチャでは、単離の間生存可能で、非摂動残る。

損傷後の10+時間 - ここでは、それらが動的に最大8リアルタイムで局所損傷に反応するように、中央髄軸索の直接可視化を可能にする比較的単純なアプローチを説明します。レーザー誘起脊髄損傷（LiSCI）モデルが空間的に時間をかけて拘束されたままに原発巣（アブレーション部位）などの一次および二次軸索損傷メカニズムの間の区別を可能にします。オープンバス撮像チャンバは、治療的介入、試薬送達、および環境の操作にアクセス可能である。推定上のaxomyelinic保護剤は、迅速に組織プロセスを伴う長くて費用のかかる実験に対して直接観察によりリアルタイムで評価することができる、る、免疫染色、画像キャプチャ、および分析を区画ため、生きた動物で実験的なエージェントをテストする前に急性応答および保護の操作を評価するための有用な代理モデルを提供します。

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Protocol

注：すべての動物の手順は、連邦規則に付着し、ルイビル大学の施設内動物管理使用委員会によって設定されたガイドラインの下で行った。

ローのCa 2+および2mMのCa 2+人工脳脊髄液（aCSFの）の調製灌流液

  1. 表1に記載されるように2倍低いのCa 2+（0.1 mm）株価Cバッファー、2倍、通常のCa 2+（2 mm）株価バッファ、および2X証券Bバッファを準備します。個々の原液をイオン含有量の変更を許可（ 例えば、低いまたはゼロのCa 2+）及び1ヶ月まで4℃で保存することができる。
  2. 解剖時の心臓内灌流のため、1倍低いのCa 2+ aCSFのを作るためにプラスチック製のボトルに2倍低いのCa 2+証券Cの100ミリリットルと2倍株式Bの100ミリリットルを追加します。混合し、4℃で一晩保存したり、新鮮作る。
  3. 虚部の間にex vivoでの脊髄の灌流のためのINGは、1X aCSFのを生成するために、1リットルのガラスボトルに2倍、通常のCa 2+株式Aの500ミリリットルと2倍株式Bの500ミリリットルを追加します。混合し、室温で一晩保存したり、新鮮作る。
  4. 7.4にaCSFのバッファのpHを調整する。室温でのaCSFを維持しながら、氷上で低Ca 2+のaCSFのを配置し、気泡カルボゲンガスとの両方のバッファ（95％O 2、5％CO 2）で30分間前に、灌流中に連続的に使用する。

生体外イメージング商工の調製

  1. aCSFのボトルの周りに加熱ブランケット（なし自動シャットオフ）をラップし、低/中の設定に熱を調整します。
  2. 灌流ポンプ及び図1Aに示すように、バイポーラ温度コントローラ及びフィードバック温度プローブによって制御されているインラインヒータに接続されたボトルに、専用のaCSF灌流ラインを挿入する。
  3. 2光子励起/ confにフラット顕微鏡ステージインサート（152 X 102ミリメートル）を取り付け流出コンテナを装着しOCALの顕微鏡ステージ。
  4. （適切なEXについては、図1（b）参照 ex vivoでの脊髄に新鮮な酸素のaCSFの連続的な流れに対応し、提供するために、流出容器に、大規模なオープン浴灌流チャンバー（12×24×8ミリメートル幅×長さ×H）を配置）チャンバ設計を撮像する体内 。
  5. 適切なチューブを使用してex vivoでのイメージング室にインラインヒータの金属出力ポートに接続します。撮影時のバッファ/組織の温度を維持するのを助けるためのex vivoイメージング室の下に薄い吸収パッドを配置します。
  6. 取り外し可能な粘着性のタックを使用して流出コンテナ/ステージインサートの底にex vivoでのイメージング室を接着。目的の光路は、組織表面に対して垂直であることを確認するために、必要に応じて粘着性の粘着性の可鍛性は、チャンバが調整されることを可能にする。必要に応じて、チャンバを調整するブルズアイレベルを使用する。
  7. 確保するチャンバの流体入口およびチャンバ出口での真空ラインに接続されたステンレス製の吸引チューブの近くにインラインヒータフィードバック温度プローブ。磁気テープ、適切なマイクロピペットホルダは、この点で有用である。真空源をオンにします。
  8. 酸素化aCSFの持つイメージングチャンバーを充填開始する灌流ポンプをオンにします。毎分1.5〜2ミリリットルに灌流ポンプを設定します。
  9. 真空ラインを調整することにより、撮像チャンバ内のaCSFの音量を制御する。これは、十分なaCSFの脊髄セグメントをカバーし、水浸漬対物レンズと組織表面との間に十分な作動距離を可能にするために、撮像チャンバ内に存在することが重要である。組織セグメントは完全に実験者によって誘発されるアーティファクトをリードする新鮮な酸素aCSFの内に浸漬されていない場合、ミエリンと軸索は悪影響を受けることができます。
  10. 撮像チャンバー内の灌流液の温度が室温付近になるように、インラインヒータ温度制御を調整する。
<Pクラス= "jove_title"> 3。アダルトマウス頸部脊髄の解剖

  1. 腹腔内注射によって麻酔を、ペントバルビタールナトリウム（200 mg / kgを）の過剰摂取を注入することによって（後根神経節ニューロンにおける蛍光タンパク質の発現を有し、適切な株を使用する）、成人6-10週齢THY1 -YFPトランスジェニックマウスを安楽死させる。
  2. 一度麻酔の適切なレベル（つま先のピンチとまばたき反射の消失に例えば、無反応）の下で、慎重に手術用バリカンで脊髄と脳を覆う皮膚を剃る。ベタジンおよび70％エタノールパッドを使用して皮膚を清潔。
  3. その後冷やし、カーボゲン-バブリング低Ca 2+のaCSFのを使用して経心件名を灌流、70％エタノールで胸/腹部領域をスプレーします。 （推奨解剖ベンチについては、図1Cは 、トップのセットアップを参照）。
  4. 肝臓は見劣りとして、小さなクリップを使用して心臓に灌流針を固定します。の毛を剃っ背側にアクセスするための主題を裏返し被写体と70％エタノールで剃毛面積を拭く。
  5. 脳と脊柱（ 図2A）を露出するために解剖ハサミを使用して、腰に鼻から始まる正中線に沿って背側皮膚切開を行います。鼻とハンチでピンを配置することで準備を固定します。
  6. この点から、解剖顕微鏡を用いて、しっかりと嗅球のレベルで頭蓋骨の背側表面を横切る。切開の側縁にはさみのヒントの1を挿入し、小脳まで両側性タツナミソウの縁に沿ってカット。
    注：それは（ 図2Bを参照）解剖を通して脊髄から上にある組織を持ち上げるために、後に必要とされるように完全にスカルキャップを切除しないでください。
  7. 脳を公開するスカルキャップを持ち上げます。 図2C（静かに（小脳に位置する）interparietal骨の左右の端をカットし、脳幹/脊髄を露出させるために尾戻ってそれを引っ張る
  8. テーブル面に対して45°の角度で保持細い先端ハサミを使用して、後部神経根への二国間だけで劣る椎骨をカット。
    注：明るい白背側の列との接触を避ける。これらの繊維は、（ 図2D）画像化され、簡単に破損することができるものです。
  9. カットが脊髄を露出させているように優しくワンピースでその上の組織を引っ張って、細かい傾いて鉗子で脊柱のスカルキャップと背側表面を持ち上げます。その後のイメージングのため頸髄（ 図2E）1-2センチセグメントを分離するために、上部胸椎レベルに脊椎カットし続けます。
  10. 脊柱と列の下に明確な組織への組織/骨の並列をカットするはさみを使用してください。できるだけ水平これらのカットを行います。これは、コードがイメージング用のレベルになるように組織がチャンバ内に平らにすることが非常に重要である。
  11. 過ぎて（脳幹を横断するために＃11メスを使用してくださいGRACILE束繊維の終了）と頸髄セグメントを分離するために、上部胸椎レベルで（ 図2Fを参照してください）。これらの同じ2つの点での組織/骨をカットするはさみを使用してください。孤立した組織は、尾側脳幹、子宮頸拡大し、上部胸髄（ 図2G）を網羅する脊柱の2/3を含める必要があります。
  12. カルボゲン-バブリング、チルド低いのCa 2+のaCSFのシャーレに孤立した脊柱を置きます。必要であればそれは皿に平らになるまで、脊柱の下に組織をトリミング。
  13. ex vivoでのイメージング室に孤立した脊柱を転送し、徐々に36に1時間かけて灌流液の温度を上げる- 37℃。撮像中にこの温度を維持する。

ナイルレッドとイメージング商工およびミエリンの標識に生体外脊髄の4の配置

  1. 慎重に私に脊柱を確保適切なフィッティングスライスとmaging室が（; 図3Aを参照してください脊髄用の領域を確保するために、グリッドプラットフォームの真ん中のスレッドを削除します）細かいライクラ糸からなる垂直グリッドプラットフォームで修飾された押し続けます。
  2. （DMSO中に5 mMストックし、ろ過し、0.22μmのは、4℃、または暗闇の中で-20℃で6ヶ月で1ヶ月間保存することができます）ナイルレッドのアリコートを解凍する。単に撮像チャンバーにナイルレッドを添加する前に、灌流ポンプの流量を減少させ、チャンバ内の流体は、常に脊髄を覆うことを確認するために真空ラインを調整する。
  3. コード（ 図3B）の尾終わり近くイメージング室に5〜10μlのナイルレッド原液を追加します。優しく室全体にナイルレッドを混合するために1ミリリットルピペットを使用してください。ナイルレッドが戻って真空ラインを配置し、継続的に脊髄を灌流する毎分1.5〜2ミリリットルに灌流ポンプを調整した後、1〜2分間チャンバー内に滞在することを許可する。
  4. 慎重に顕微鏡ステージを上げる水浸対物レンズは、チャンバー内のaCSFの表面から約10mmになるまでと背側の列の上に脊髄セグメントの中心とし、内側に目標を合わせます。それは優しくaCSFの表面に触れるまでゆっくりと目的を持って来るために顕微鏡ノーズピースフォーカスホイールを使用してください。視野（ 図3C）に後柱をフォーカスする落射光源を用いる。

TPLSMとレーザ誘起脊髄損傷マウス脊髄の5 例vivoイメージング（LiSCI）

注：後部静脈がGRACILE束繊維のような組織を中央に有用なマーカーを提供していますが、（後根神経節の細胞体に由来し、T6から上昇し、下に脊髄の正中線に沿って）この血管平行に走る。繊維はYに横方向に昇降などの厚いYFP +頚椎後根の予測も有用なマーカーを提供FP +直径が小さい薄束束繊維。

  1. 脊髄組織を適切に位置合わせされると、昇順薄束束有髄線維のベースラインイメージングを実行するためにレーザ走査モードに切り替える。両方YFP及びナイルレッドを励起し、蛍光発光を分離するために950nmの波長（〜25X、1.1 NA対物レンズの出口で測定された17 mW）とし、適切な色性（DM）とバンドパスフィルタに同調二光子レーザー光源を使用フルオロフォアの（我々は黄橙色、および拡張赤チャンネル、それぞれにYFP、ナイルレッドを分離するために、50分の525のDM560、60分の600のDM640、および70分の685を使用します）。
    1. 軸索の3％以上がベースラインイメージング（30〜60分）の間に軸索スフェロイドを示した場合は、原因実験者によって誘発されるアーティファクトに準備を捨てる。
  2. 30.3Xに視野を拡大しLiSCIを誘導する（〜20μmの直径アブレーションを作成するため）。曲が800nm​​のレーザー、および少なくとも〜110ミリワットのレーザーのパワーを増加させるサンプル。繊維が完全に離断されていることを確認するために、ビューのレーザースキャンの5完全なフィールドを許可します。
  3. （サンプル、2.08Xで950 nmの、17 MW）をイメージングの設定に戻ってレーザーの設定を変更することでLiSCIを確認し、アブレーションを可視化する組織をスキャンします。アブレーションの直径を確認して、主要なアブレーションされた軸索が完全に離断していること（ 図3Dを参照）。損傷後の8-10 +時間までの損傷に軸索とミエリンの動的応答を記録するために、Zキャプチャと組み合わせる顕微鏡タイムラプス設定を使用します。
    注：切除が不完全である場合（ すなわち 、繊維の不完全な離断）、一次および二次損傷機構の判定が混同されるように、調製物を捨てる。さらに、単離された脊髄セグメントはLiSCI非依存組織損傷を緩和するために軽度に24時間後LiSCIまで撮像することができる。

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Representative Results

単離生存能力を維持するために必要な設定の適切な研究室の詳細、および画像エキソビボ脊髄は、 図1に示されている。顕微鏡は波長可変パルスフェムト秒レーザー、適切dicroicsおよび発光フィルター、および水を装備する必要がある高開口数の対物レンズを浸漬（≥1.0）。解剖時に脊髄の生存を確保するために、手順42を封止する、単離された軸索の膜のための十分なのCa 2+を可能にする冷蔵低酸素のCa 2+ aCSFの存在下で行われるべきである。これを怠ると、軸索鞘からミエリンを分離すると、ベースライン撮像中にはっきりと見える軸索スフェロイド形成を含むaxomyelinic損傷を引き起こす可能性があります。代表的な解剖プロセスの画像および単離ex vivoでの脊髄は、 図2に示されている。単離後、脊髄の生存率をm36〜37℃に維持されている酸素のaCSFの連続灌流によりaintained。ミエリン染色ナイルレッド27,43は、その後、潅流チャンバーに添加することができ、薄束束有髄軸索のベースラインの記録（ 図3）を開始することができる。

GRACILE束髄軸索の代表的な画像を図4に示す。ベースライン条件の下でタイムラプスTPLSMの記録は軸索の長さに沿ってほぼ一定の直径を有するミエリン（ナイルレッド）に鞘で覆わ並列に整列YFP +軸索を明らかにする。少数の軸索スフェロイドまたは軸索変性の他の形態学的兆候が存在している。推定されるオリゴデンドロサイト細胞体の行は暗いオレンジ色（ 図4A）が表示され、一方によりナイルレッドのソルバトクロミック特性やミエリンの脂質とタンパク質のコンテンツに、ミエリンは黄橙色に染色されている。そのようなランビエ絞輪など細部にも（ 例えば、矢印で解決することができます

LiSCI以下の10分の時点で、すぐに横に切断軸索（プライマリ傷害）は、アブレーションサイトに吻側および尾側に位置して離れて損傷部位から後退すると腫れバルーニングミエリン内のS字型のようなコイルを形成し始める。アブレーションにリモート軸索を鞘ミエリンは、この時点で変わらず表示されます。これらは、損傷部位（ 図4B）から退避として40分後にLiSCI最も主要離断軸索と二次変性を受けた軸索ことで（ すなわち最初は侮辱が、後に縮退から免れる）が特徴的endbulbsを形成する。これらの離断軸索の約1/3がどこ近位セグメント最初のうねりの汎フラグメンテーションを受け、軸索スフェロイドを形成し、最終的には軸索43のいくつかの不規則な長さに軸索を横断する。軸索（ペリ軸索腫脹）およびミエリンの小胞の変性からミエリンの分離も明らかである。時間が経つにつれて、プライマリとセカンダリのトラン開腹軸索が離れて、損傷部位から後退を続け、すぐに切除部位に隣接する軸索は二次変性を受け、周囲の軸索腫脹が腫れミエリンおよび水疱性変性症と同様に、より顕著になる（ 図4D-G、また43を参照）。軸索退縮の程度の明確な違いは、近位軸索切り株（病変に尾）とウォラー変性（ 図4D-G）を受ける運命にある遠位セグメント（病変への吻側）との間で明らかになります。最初はLiSCIによって免れる軸索は受ける遅延二次変性（ 図4H）。 LiSCIなしの代表的対照実験は、（最大13時間、この例では、コード分離後の）長いイメージングセッションは白質の整合性への悪影響を引き起こすことなく可能であることを示唆している （ 図4I、J）。

代表高RESOLiSCI後axomyelinic変化のリュー画像は、 図5に示されている。

LiSCI 3時間後では、いくつかの近位（尾）軸索は離れて、彼らが離れて軸索から分離している腫れミエリンチューブ内にとどまる病変部位から後退している。他の軸索endbulbsは、ミエリン（ 図5A）でキャップされているようである。他の人が影響を受けない現れるのに対し、切除部位に隣接する軸索は、二次変性を受ける。 YFP軸索内の低/負の推定小胞（淡い青）と軸索endbulbsも存在する。後退繊維を尾側とは対照的に、3時間後にLiSCIでの過半数の吻側に後退軸索endbulbsとスフェロイドが強く軸索内の環境変化（ 図5B）を示す（より少ない青がシフト）ナイルレッドで標識されている。積極的に後退させる軸索内のナイルレッド標識領域は主に軸索コアを囲むまたはキャップに見える。正確な位置とIDEもののこれらの内の軸索ナイルレッドで標識された構造のntityは現在不明であり、これらは、軸索輸送および/ ​​またはそれらの疎水性コア27を露出する切断されたタンパク質を介して緻密小胞の蓄積を表してもよい。ナイルレッドラベルミエリンは主に正常に見えるミエリンで黄橙色のまま。区別では、ナイルレッド、水疱性ミエリンをプロービングし、これらの構造内の環境変化を示す（すなわち青がシフト）黄色表示されます。 7時間によってLiSCIの軸索は病変部位から離れて後退続けた後で、しかしながら、これは、尾側（ 図5C）endbulbsに対して吻側（ 図5D）においてより明白である。他の軸索は、空のミエリン管や数ミクロン離れて変性セグメントから細い茎を残して完全または部分的な崩壊を受ける。 LiSCI後のナイルレッドの遅延アプリケーションは、ナイルレッドの事前のアプリケーションと同様の軸索の標識は、切除自体とタンパク質の変性に対する潜在的な熱効果があることを示唆して明らかにし損傷後のミエリン及び軸索におけるナイルレッドスペクトルシフト（ 図5E、F）の責任は低い。

まとめると、これらのデータは、リアルタイムでの急性axomyelinic損傷のよく知られているが、十分に理解メカニズムを模倣するエキソビボ LiSCIモデルの有用性を示している。モデルは、したがって、白質傷害の病態生理学の知識を促進するのに有用である、と白質の整合性を保持するために重要な分子標的を発見することがあります。

図1
図1：解剖とイメージングセットアップの概要。 （A）Aは、脊髄のex vivoイメージングのためのセットアップを示唆した。必要な主要機器は、カルボゲン、バブを配信するaCSFの、灌流ポンプを酸素化するためにカルボゲン（95％O 2/5％CO 2）ガスラインを含む温度フィードバックプローブを備えたインラインヒータ/温度制御装置、及び真空源を装備したオープンバスに設計された撮像チャンバーを通してaCSFの採血。（B）は、撮像浴室の高倍率が示されている。（C）灌流およびex vivoでの脊髄の解剖のために提案されセットアップ。チルド低いのCa 2+のaCSFはカルボゲンで酸素化し、解剖時に脊髄の生存能力を維持するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2：イメージングのための脊髄の単離（A）連続冷蔵下では、酸素、低Caがskulを灌流2+LCAPが露出している。（B）切開嗅球（破線）のレベルで頭蓋骨の背側表面を介して行われる。それは緩やかにすることができるまで（C）両側切開次いで、タツナミソウの横方向の境界を介して行われる持ち上げ、脳幹を露出させ（矢印の方向に）尾側に引っ張ら。（D）椎骨の横方向の側面をカットし、背側の列（矢じり）を露出するために細かい傾いてハサミとの二国間の切開を継続します。（E）が露出脊髄の上胸部セグメントに脳幹全体子宮頸拡大が示されている。（F）番号11-メスの刃を持つ2つの切開がGRACILE束の軸索の終端と上胸部レベル（を超えて、脳幹で脊髄を分離するために行われる破線）。（G）、単離された脊髄その後冷蔵低カルシウムを含むペトリ皿に移し2+のaCSFをバブリングカルボゲンガス。脳幹（〜15〜20ミリメートル）に胸部上部セグメントから子宮頸部背側根（ 例えば、矢印）、後根神経節、および脊髄がそのまま残されている。 G中のスケールバー：2ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3： エキソビボ脊髄イメージング（A）一旦チャンバーに入れは、脊髄組織を改変組織/スライスライクラ糸を取り付けた押したまま使用して固定されている（B）ミエリン染色ナイルレッドに直接添加する。撮像チャンバ（C）水浸対物レンズをaCSFの中に沈め、薄束束繊維の上に配置される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4：中央ミエリン化軸索損傷 TPLSM のLiSCIモデルは LiSCI（*）は、以下の軸索及びミエリンの応答のダイナミクスを捕捉するために使用した。代表的な画像は、25Xを搭載したニコンA1RMP +多光子/共焦点顕微鏡で0.24ミクロン/ピクセルで撮影さ5厚さ1μmの光学切片の最大強度の予測として表示されます。 NA：1.1。 WD：2ミリメートル水浸対物レンズ。ダイクロイックと発光フィルタの標準は、YFP +軸索（50分の525のDM560、青で示されている）とソルバトクロ親油性蛍光色素ナイルRを分離するために使用された短い（緑色で表示60分の600 DM640、）にED及びより長い（70分の685 nmの、赤で表示）発光チャンネル。後者の二つのフィルタの組み合わせは、それらが異なる物理化学的環境におけるナイルレッドの既知のスペクトルシフトを取り込むよう有利で ​​ある。ベースライン条件軸索において（A）（YFP +、青）およびミエリン（NR、黄橙色）は、通常、いくつかのスフェロイドまたはで配向見えるaxomyelinic損傷の他の徴候。白質オリゴデンドロサイト（NR、濃いオレンジ色、 例えば矢印）の特徴的な形態とグリアの行は、（いくつかは、明確にするためにマークされている）にも表示され、そしてそのようなランビエ絞輪などの微細構造はまた、（ 例えば矢印）を解決されます。（B）10時LiSCI分後、病変への吻側および尾側に位置し離断軸索が離れて損​​傷部位から後退すると腫れミエリン内のS字型のようなコイル（矢印）を形成し始める。アブレーションからリモート軸索を鞘ミエリンは、この時点で変わらずに表示されます。（C）BYこれらは、損傷部位（矢印）から退避などの二次変性フォーム特性endbulbsを受けて40分後にLiSCI最も主要横に切断軸索と軸索。いくつかの離断軸索は、それらの軸索（矢印）の長さに沿ってスフェロイドを形成する。軸索（ペリ軸索腫脹）からミエリンの分離とミエリンの小胞の変性も（+）は明らかである。（DG）。時間が経つにつれて、一次および二次損傷軸索はYZ予測で示すように、離れて病変部位から後退、および継続白いドットが初期LiSCI、赤いドットが示すマークし、切除部位に隣接する最初は免れる軸索は二次変性症（H、LiSCI前に左側のパネル、中央のパネルは10分後にLiSCI、右のパネルLiSCI後の7時間遅れて受けるLiSCI、の10分であり、緑のドットによる軸索の損失）は7時間による軸索の遅延二次変性の程度を示す。ペリ-軸索腫脹が後の時点ポストLiSCIでより顕著になる。エクステントOF軸索退縮と近位軸索切り株と、それらの遠位セグメント間の軸索endbulbsの形態がまた明らかになった（また、高倍率の画像については、図5を参照）。スケールバー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5：LiSCI TPLSM 後axomyelinic変化の代表的な高解像度画像が 3時間目に損傷を尾（A、C）および吻側（B、D）を変更軸索及びミエリンの複雑な詳細を捕捉するために使用した（A、B）とLiSCI次の7時間後（C、D）。代表的な画像は31μm厚の光学切片の最大強度の予測として表示されますニコンA1RMP +多光子/共焦点顕微鏡を用いて0.0832ミクロン/ピクセルで撮影さ。腫れミエリンチューブ内LiSCI（*）、いくつかの軸索（青）病変部位から離れて後退している（大矢印）（黄橙色に（A）尾）軸索endbulbから離れて分離していること。アブレーション部位に隣接するいくつかの軸索は、他の人が影響を受けない現れるのに対し、二次変性症（小さな矢印）を受ける。軸索と軸索endbulbs内（淡い青）YFP低い/負の推定小胞は、（矢印）が存在する。ランヴィエの中央ノード（n）は、このイメージング及び標識技術を使用してもはっきりと見える。（B）繊維を後退させる尾側とは対照的には、3時間後LiSCIで吻側後退軸索endbulbsとスフェロイドの大部分が強くナイル川で標識されているレッド（ピンク）。後退軸索におけるナイルレッド標識領域は主にラベル軸索（青、大矢じり）を囲むまたはキャップYFPように見える。これらのナイルレッド標識の性質ものの編構造は現在のところ不明であるが、それらは、それらの疎水性コアを露出させ、軸索輸送および/または切断されたタンパク質を介して緻密小胞の蓄積を表してもよい。区別では、ナイルレッドは、前者の中で、推定環境の変化を示す水疱ミエリン（矢印）黄色の正常なミエリン（黄橙色）に比べて（すなわちスペクトルがシフトした青である）が表示されて、ラベル。ペリ-軸索腫脹も明らか（小矢印）です。 LiSCI後7時間で、軸索は病変部位から離れて後退し続ける。しかしながら、これは、尾（C）endbulbs対吻側（D） ​​においてより明白である。いくつかの軸索はそれぞれ、（Dの小さな矢印）変性セグメントから数ミクロン離れて空のミエリンチューブ（Cの矢印）または薄い茎を残して完全または部分的な崩壊を受ける。ナイルレッドの遅延適用は吻側中央髄軸索（EとF対尾側で同様のスペクトルシフトを生成（C、D）のように。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2X証券A（2のCa 2+） 試薬 mMの
NaClを 252
塩化カリウム 6
のCaCl 2•2H 2 O 4
2X証券B のNaH 2 PO 4 2.5
MgSO 4を 4
のNaHCO 3 52
ブドウ糖（D-グルコース） 20
2X低Ca 2+の証券C（0.1のCa 2+） NaClを252
塩化カリウム 6
のMgCl•6H 2 O 3.8
のCaCl 2•2H 2 O 0.2

表1：人工脳脊髄液（aCSFの）バッファ。

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

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References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
  3. McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
  4. Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
  5. Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
  6. Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
  7. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  8. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  9. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
  10. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
  11. Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
  12. Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
  13. Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
  14. McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
  15. Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
  16. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  17. Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
  18. Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
  19. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
  20. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
  22. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  23. Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
  24. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  25. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
  26. Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
  27. Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
  28. Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
  29. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  30. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
  31. Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
  32. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
  33. Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
  34. Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
  35. Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
  36. Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
  37. Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
  38. Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
  39. Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
  40. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
  41. Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
  42. Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
  43. Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).

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ニューロサイエンス、93号、脊髄損傷、軸索、ミエリン、2光子励起顕微鏡、ナイルレッド、軸索変性、軸索の枯死、軸索退縮
アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために
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Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

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