Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ل Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

فشلت محاور CNS المصابين إلى تجديد وغالبا ما تتراجع بعيدا عن موقع الإصابة. محاور تنج من الإصابة الأولية قد يخضع لاحقا انحطاط محواري الثانوي. عدم تشكيل مخروط النمو، والتجديد، وفقدان التوقعات محور عصبي مياليني إضافية داخل الحبل الشوكي يحد بشكل كبير الانتعاش العصبية التالية الإصابة. لتقييم مدى أهمية myelinated محاور عصبية من الحبل الشوكي تستجيب للإصابة، وضعنا على فيفو السابقين الذين يعيشون نموذج الحبل الشوكي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين أصفر فلوري في المحاور والوصل واستنساخه للغاية إصابات الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لتوثيق مصير محاور والمايلين (محبة للدهون صبغة الفلورسنت النيل الأحمر) مع مرور الوقت باستخدام اثنين من الفوتون الإثارة الوقت الفاصل بين المجهري. العمليات الديناميكية مثل الإصابة الحادة محور عصبي، تراجع محور عصبي، وانحطاط المايلين هي أفضل درس في الوقت الحقيقي. ومع ذلك، فإن الطبيعة غير المحورية لإصابات القائم على كدمة والتحف واجهت الحركةخلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة المجهر تحديا. وفيفو السابقين نموذج الحبل الشوكي هو موضح هنا يحاكي جوانب عديدة من كدمة / التي يسببها ضغط الأمراض محور عصبي ذات الصلة سريريا بما في ذلك تورم محور عصبي، وتشكيل كروي، transection محور عصبي، وشبه محواري تورم تقديم نموذجا مفيدا لدراسة هذه العمليات الدينامية في الوقت الحقيقي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج هي قرار الزماني المكاني الممتاز الذي يسمح التمايز بين إهانة الأولية أن يجرح مباشرة محاور وآليات الإصابة الثانوية؛ ضخ تسيطر عليها من الكواشف مباشرة إلى الاستحمام سائل الإرواء الحبل. التعديلات دقيقة من الوسط البيئي (على سبيل المثال، والكالسيوم، أيونات الصوديوم، والمساهمين المعروف أن الإصابة محور عصبي، ولكن بالقرب من المستحيل التلاعب في الجسم الحي)؛ ونماذج الفئران كما تقدم ميزة لأنها توفر فرصة لتصور والتلاعب السكان الخلية التي تم تحديدها وراثيا والهياكل التحت خلوية. هنا، نحن تصف كيفية عزل وصورة الحبل الشوكي الحية من الفئران لالتقاط ديناميات إصابة محور عصبي حاد.

Introduction

انحطاط المحاور هو سبب بارز للمراضة والتي تمتد عدة شروط العصبية بما في ذلك رضح عصبي والسكتة الدماغية وأمراض المناعة الذاتية، والأمراض العصبية. وخلافا للنظام العصبي المحيطي (السندات الإذنية)، والجهاز العصبي المركزي (CNS) محاور لديها قدرة محدودة على التجدد أصيب مرة واحدة على حد سواء بسبب الحواجز الجوهرية وخارجي (أي الجزيئات المثبطة لنمو محور عصبي أنتجت خلال تشكيل ندبة وحررت خلال انحطاط المايلين) 1 -7. على الرغم من أن العديد من هذه الحواجز قد تم استكشافها على نطاق واسع، والتدخلات العلاجية التي تهدف لمنع CNS انحطاط محور عصبي، وتعزيز تجدد المحاور قوي، واستعادة connectively وظيفية، تظل محدودة.

محاور مرة واحدة وفصلها عن سوما على الخضوع لعملية النمطية للانحطاط المعروفة باسم ولري انحطاط التي تتميز تورم محور عصبي، وتشكيل كروي والتفتت في نهاية المطاف (استعراضها في 8). فيالنقيض من ذلك، الجدعة الداني أن يبقى في الاستمرارية مع سوما من محور عصبي محيطي مقطوع، يشكل تورم في نهايته، يموت العودة إلى أقرب عقدة رانفييه، ومن ثم يمكن بدء تشكيل مخروط النمو، وهو شرط أساسي حيوي ضروري لتجدد المحاور لاحق 9-11. في المقابل، فإن النهايات محور عصبي القريبة من العديد من المحاور المركزية تشكل "endbulbs" سمة أو المصابيح التراجع، تفشل في تشكيل مخاريط النمو، وبدلا من التراجع بعيدا عن موقع الإصابة حيث تبقى لأشهر بعد الإصابة 12-15. بالإضافة إلى إصابة محور عصبي الأولية، قد تحدث إضافية محور عصبي الضرر / الخسارة أيضا إلى المحاور التي نجت إلى حد كبير من الإصابة الأولية. ويشار إلى هذا تأخر فقدان محور عصبي من المحاور يدخر في البداية إلى انحطاط محور عصبي الثانوي. هذا الرد المتأصلة من المحاور CNS إلى إصابة يجعل تجدد المحاور وظيفية هدفا أكثر صعوبة لتحقيق في الدماغ والحبل الشوكي.

وعلى الرغم من هكتارllmarks الإصابة محور عصبي (على سبيل المثال، وتشكيل كروي، والمصابيح تراجع) اتسمت جيدا من الأنسجة بعد الوفاة ونماذج تجريبية من انحطاط محور عصبي، وقد تم تقييد توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات الديناميكية. تعتمد معظم هذه الدراسات على الملاحظات نقطة النهاية الثابتة التي فشلت بطبيعتها لالتقاط الردود محور عصبي الفردية مع مرور الوقت. على الرغم من تطبيقها خارجيا كانت استشفاف محور عصبي مفيد لتوضيح الردود محواري من أقسام ثابتة وخلال التصوير الحي، وتوافر علامات محور عصبي المشفرة وراثيا قد تحسنت كثيرا قدرتنا على تصور محاور في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر مضان. في الواقع، قدمت تقريرا المنوي من Kerschensteiner وزملاؤه أول دليل مباشر على انحطاط محور عصبي والتجديد في الجسم الحي باستخدام Thy1 -GFP-S الفئران التي تكود البروتين الفلوري الأخضر في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية التي ترسل توقعاتهم في الأعمدة الظهرية من العمود الفقريالحبل 16. تصوير حي النهج باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) ويستمر الجيني وضع العلامات بروتين فلوري الخلايا التي تهم تقديم أدلة مباشرة والبصيرة الميكانيكية في العديد من العمليات الحيوية المختلفة مثل التنكس محور عصبي، كاليفورنيا 2+ الإشارات، تجدد المحاور، نجمية علم وظائف الأعضاء، علم وظائف الأعضاء دبقية، واستجابة لإصابات 17-25.

وعلى النقيض من محاور عصبية، لا يعرف إلا القليل جدا من الردود المايلين الاصابة في الوقت الحقيقي. المايلين هو مكون أساسي من مكونات المادة البيضاء المنتجة والتي تحتفظ بها قليلة التغصن في خلايا الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي شوان في. المايلين يعزل 99٪ من سطح محاور وبذلك يوفر عالية المقاومة ومنخفضة السعة أغطية واقية التي تدعم نشر دفعة قفزي السريع والفعال، استعرض مؤخرا من قبل Buttermore وآخرون. 26. للقبض على الاستجابة الديناميكية المايلين إلى إصابة نستخدم solvatochromic، محبة للدهونصبغة الفلورسنت النيل الأحمر 27. خصائص solvatochromic هذا وصمة عار الحيوية تسمح التحولات الطيفية من الطيف الانبعاثات التي تعتمد على البيئة الفيزيائية والكيميائية 28،29. هذه الخصائص هي مفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة آليات الإصابة axomyelinic ويمكن تصور استخدام dichroics اختيار مناسب والمرشحات الانبعاثات أو حلها باستخدام المجهر الطيفي 27. على سبيل المثال، النيل الأحمر طيف الانبعاث هو الأزرق تحول في بيئات غنية بالدهون أقل القطبية مثل تلك الموجودة في الخلايا الشحمية وطبيعية CNS المايلين (الانبعاثات ذروة ~ 580-590 نانومتر) 27. في المقابل، قمم طيف الانبعاث هذه الصبغة الحيوية في في ~ 625 نانومتر في endbulbs كما شكلت محاور تخضع السقم محور عصبي 27. على الرغم من أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذه التحولات الطيفية تحديدا في endbulbs مقابل المايلين طبيعيا لا تزال غير واضحة، قد مثل هذه التغييرات الطيفية تكشف عن التعديلات الأساسية في تراكم البروتين أو الفوضى مما أدى إلىتعرض مواقع الربط مسعور 27.

بينما التصوير في الجسم الحي هو المقياس النهائي لمراقبة الحبل الشوكي ديناميات إصابة محور عصبي في بيئتهم المحلية، فمن الصعب فنيا ويتطلب خبرة جراحية كبيرة، وغالبا ما يكرر عملية جراحية لفضح العمود الظهري التي قد يعرض القطع الأثرية التجريبية (على سبيل المثال، والتهاب وندبة التأسيس). وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان هناك حاجة إلى معدات مكلفة للسماح للتعليق وتحديد المواقع حيوان سليمة تحت المجهر عدسة موضوعية. تحتاج الحيوانات التي يتعين رصدها بعناية وكذلك لضمان أنها لا تزال دافئة، لضمان تجديد السوائل، وضمان عدم وجود علامات نقص الأكسجين بسبب جلسات التصوير تخدير لفترة طويلة. وهذا الأخير هو في غاية الأهمية كما المحاور والمايلين تتطلب تماما نضح المستمر ومستويات الأكسجين الكافية لتبقى قابلة للحياة. ومع ذلك، وهذا هو في كثير من الأحيان لم يبلغ عنها أو رصدها في معظم الدراسات المجراة لالتاريخ. وبالإضافة إلى ذلك، والتحف الحركة نظرا لمعدل ضربات القلب والتنفس (الأيزوفلورين تخدير الماوس الكبار: ~ 300-450 نبضة في الدقيقة (BPM) هو الأمثل للحفاظ على 97-98٪ تشبع الأكسجين (المعدل الطبيعي ~ 632 BPM) و ~ 55-65 الأنفاس لكل دقيقة (المعدل الطبيعي هو ~ 163 نفسا في الدقيقة)، على التوالي)) 30 واجهتها خلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة مضان المجهر تحدي حتى أسرع المسح الضوئي الليزر هي حتما تخضع لهذه الحركة التحف. التقدم في فائق السرعة الماسحات الضوئية الرنانة جنبا إلى جنب مع جامدة الفقري نافذة زرع مؤطرة قد يسمح التصوير من الحبل الشوكي الفئران في الحيوانات المستيقظة، ولكن مرات أسرع المسح الضوئي حتما يقلل من إشارة إلى نسبة الضوضاء جودة الصورة المهينة. المزيد من التحسينات في تقنيات التصوير الحبل الشوكي تستخدم حاليا لتصوير الدماغ قد التغلب على كثير من هذه العقبات وتحد يفند المحتملة التي أدخلتها ماننضح الأنسجة dequate، على سبيل المثال، 31-33.

وقد تم تحديد معظم ما هو معروف عن البيض علم وظائف الأعضاء وآليات الإصابة المادة البيضاء مسألة استخدام في المختبر أو خارج الحي الاستعدادات من المادة البيضاء من العصب البصري، الأعصاب الطرفية، وشرائح من الحبل الشوكي المادة البيضاء 34-41. استمرت هذه التحضيرات لدفع معرفتنا آليات إصابة المادة البيضاء، التي تسمح تسيطر التغيرات في العوامل البيئية، وتطبيق رقابة من الأدوية والكواشف، وتقييمات الوظيفية باستخدام الكهربية، والملاحظات مضان المجهر مباشرة من المحاور والميلين في الأنسجة الحية. ومع ذلك، وبعض الأساليب السابقة لمراقبة محاور عصبية من الحبل الشوكي شرائط العمود الظهري البطني أو شرائط المادة البيضاء حتما تجرح محاور السطح خلال مرحلة إزالة التي قد تؤثر على استجابة من المحاور تعارض بشكل وثيق. للاستفادة من التلاعب التجريبية أعلاه وتجنب الأضرار التي لحقت هاءالألياف راي قيد التحقيق، ونحن نستخدم نموذج الحبل الشوكي العنقي خارج الحي كما أنه يمنع الاتصال المباشر من الجانب الظهري للحبل. وهكذا، فإن بنية الأم الحنون والمجاورة محاور العمود الظهري سطحية لا تزال قابلة للحياة ورابط الجأش أثناء العزلة.

نحن هنا وصف نهج بسيط نسبيا التي تسمح التصور المباشر لmyelinated محاور عصبية مركزية كما أنها تستجيب بشكل ديناميكي لإصابة تنسيق في الوقت الحقيقي يصل إلى 8 - 10+ ساعة بعد الإصابة. إصابة الحبل الشوكي (LiSCI) نموذج الليزر التي يسببها يسمح التفريق بين آليات إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية والآفة الأولية (الموقع الاجتثاث) ما زال مقيدا مكانيا مع مرور الوقت. غرفة التصوير حمام مفتوح يمكن الوصول إلى التدخل العلاجي، والتسليم الكاشف، والتلاعب البيئية. وكلاء واقية axomyelinic المفترضة يمكن تقييم بسرعة في الوقت الحقيقي من خلال الملاحظات المباشرة مقابل تجارب طويلة ومكلفة تنطوي عملية النسيججي، باجتزاء، المناعية، والتقاط الصور، والتحليل، وبالتالي تقدم نموذجا بديل مفيد لتقييم الردود الحادة والتلاعب وقائية قبل اختبار وكلاء التجريبية في الحيوانات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية في إطار المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة لويزفيل، والتمسك اللوائح الاتحادية.

1. إعداد منخفضة الكالسيوم 2+ و 2 ملي كا 2+ السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) Perfusates

  1. إعداد 2X منخفضة الكالسيوم 2+ (0.1 ملم) سهم C العازلة، 2X الكالسيوم الطبيعي 2+ (2 ملم) سهم منطقة عازلة، و2X المالية B عازلة كما هو موضح في الجدول 1. الحلول الأسهم الفردية تسمح تعديل المحتوى أيون (على سبيل المثال، منخفضة أو الصفر الكالسيوم 2+) ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. لنضح داخل القلب أثناء تشريح، إضافة 100 مل من 2X منخفضة الكالسيوم 2+ سهم C و 100 مل من 2X المالية B في زجاجة من البلاستيك لجعل الكالسيوم منخفض 1X 2+ ACSF. خلط وتخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو جعل الطازجة.
  3. لنضح من خارج الحي الحبل الشوكي أثناء ايماججي، إضافة 500 مل من 2X العادي الكالسيوم 2+ المالية وو 500 مل من 2X المالية B في زجاجة 1 لتر لتوليد 1X ACSF. خلط وتخزين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو جعل الطازجة.
  4. ضبط درجة الحموضة من مخازن ACSF إلى 7.4. مع الحفاظ على ACSF في درجة حرارة الغرفة، ووضع منخفض الكالسيوم 2+ ACSF على الجليد ثم فقاعة كلا مخازن بالغاز كربوجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام وبشكل مستمر خلال نضح.

2. إعداد فيفو السابقين غرفة التصوير

  1. التفاف بطانية للتدفئة (أي اغلاق التلقائي) حول زجاجة ACSF وضبط الحرارة إلى منخفض / الإعداد المتوسط.
  2. إدراج ACSF خط نضح مخصص في زجاجة متصلة مضخة نضح وتمشيا سخان التي تسيطر عليها وحدة تحكم في درجة الحرارة وردود الفعل مسبار درجة الحرارة ثنائي القطب كما هو مبين في الشكل 1A.
  3. إرفاق مرحلة المجهر شقة إدراج (152 X 102 مم) إلى 2 الفوتون الإثارة / أسيوطocal مرحلة المجهر مزودة حاوية التسرب.
  4. ضع غرفة كبيرة نضح حمام مفتوح (ث ل س س ح و 12 × 24 × 8 ملم) في وعاء تسرب لاستيعاب وتوفير تدفق مستمر من ACSF الاوكسيجين الطازجة إلى الحبل الشوكي خارج الجسم الحي (انظر الشكل 1B لمناسبة السابق فيفو التصوير تصميم غرفة).
  5. ربط المعادن منفذ إخراج سخان على خط إلى خارج الحي غرفة التصوير باستخدام أنابيب مناسبة. وضع وسادة ماصة رقيقة تحت غرفة التصوير فيفو السابقين للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت / الأنسجة أثناء التصوير.
  6. الالتزام غرفة التصوير خارج الحي في الجزء السفلي من إدراج الحاويات تسرب / المرحلة باستخدام تك لزجة قابلة للإزالة. فإن سهولة تشكيل تك لزجة تسمح للغرفة الى تعديلها حسب الحاجة لضمان مسار الهدف في ضوء هو عمودي على سطح الأنسجة. إذا لزم الأمر، استخدم مستوى بولس لضبط الغرفة.
  7. تأمينفي خط ردود الفعل سخان مسبار درجة الحرارة بالقرب من مدخل السائل غرفة وغير القابل للصدأ أنبوب الشفط الصلب متصلة خط فراغ عند مخرج القاعة. أصحاب الشريط المغناطيسي وممص مكروى المناسب والمفيد في هذا الصدد. بدوره على مصدر فراغ.
  8. بدوره على مضخة نضح لبدء ملء غرفة التصوير مع ACSF المؤكسج. ضبط مضخة نضح إلى 1.5-2 مل لكل دقيقة.
  9. التحكم في حجم ACSF في غرفة التصوير عن طريق ضبط خط فراغ. من المهم أن يكون هناك ما يكفي من ACSF في غرفة التصوير لتغطية جزء الحبل الشوكي والسماح مسافة العمل كافية بين هدف غمس الماء وسطح الأنسجة. المايلين ومحاور عصبية يمكن أن تتأثر ضارا إذا لم يتم المغمورة قطاع النسيج تماما في ACSF الاوكسيجين الطازجة الرائدة التحف التي يسببها المجرب ل.
  10. ضبط تحكم في درجة الحرارة سخان في الخط بحيث درجة حرارة سائل الإرواء في غرفة التصوير هي درجة حرارة الغرفة القريب.
<ص الطبقة = "jove_title"> 3. تشريح الكبار الفئران عنق الرحم الحبل الشوكي

  1. الموت ببطء بالغ 6-10 أسبوع thy1 القديمة -YFP الماوس المعدلة وراثيا (استخدام سلالة المناسب الذي لديه الفلورسنت التعبير البروتين في الخلايا العصبية الجذرية الظهرية العقدة) عن طريق حقن جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال التخدير (200 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
  2. مرة واحدة تحت المستوى المناسب من التخدير (على سبيل المثال، أي رد فعل لقرصة أخمص قدميها، وفقدان طرفة رد الفعل)، حلاقة بعناية الجلد المغطي للنخاع الشوكي والدماغ مع كليبرز الجراحية. تطهير الجلد باستخدام بتدين و 70٪ منصات الايثانول.
  3. رش الصدر / منطقة البطن مع الايثانول 70٪، ثم يروي هذا الموضوع transcardially باستخدام المبرد،-فقاعات كربوجين الكالسيوم منخفض 2+ ACSF. (انظر الشكل 1C لمقاعد البدلاء اقترح تشريح وضع أعلى متابعة).
  4. كما تتضاءل الكبد، وتأمين إبرة نضح في القلب باستخدام مقطع صغير. تحويل الموضوع على الوصول إلى الجانب الظهري حلق لهذا الموضوع، ومسح منطقة حلق مع 70٪ من الإيثانول.
  5. وجعل شق الجلد الظهرية على طول خط الوسط ابتداء من الأنف إلى الورك باستخدام مقص تشريح لفضح الدماغ والعمود الفقري (الشكل 2A). تأمين إعداد من خلال وضع دبابيس في الأنف والكفل.
  6. باستخدام مجهر تشريح من هذه النقطة، وقطع بقوة عبر السطح الظهري من الجمجمة على مستوى بصيلات الشم. إدراج واحدة من النصائح مقص في الحواف الجانبية للشق وقطع على طول حواف قلنسوة ثنائيا حتى المخيخ.
    ملاحظة: لا المكوس تماما قلنسوة كما هو مطلوب في وقت لاحق لرفع الأنسجة المغطي من الحبل الشوكي في جميع أنحاء تشريح (انظر الشكل 2B).
  7. رفع قلنسوة لفضح الدماغ. خفض بلطف الحواف اليسرى واليمنى من العظم الجداري (الموجود في المخيخ) وتسحبه إلى الوراء نحو caudally لفضح الدماغ / الحبل الشوكي (الشكل 2C
  8. استخدام مقص يميل غرامة عقدت في زاوية 45 درجة إلى سطح الطاولة وقطع فقرات ثنائيا فقط أقل شأنا من الجذور الخلفية العصبية.
    ملاحظة: تجنب الاتصال مع الأعمدة الظهرية بيضاء مشرقة. هذه الألياف هي تلك التي سيتم تصويرها (الشكل 2D) ويمكن أن تتلف بسهولة.
  9. رفع قلنسوة والظهرية سطح العمود الفقري مع ملقط يميل غرامة، وسحب بلطف النسيج المغطي في قطعة واحدة كما يتم إجراء تخفيضات لفضح الحبل الشوكي. مواصلة خفض فقرات إلى المستوى الصدري العلوي لعزل شريحة 1-2 سم من الحبل عنق الرحم للتصوير لاحقة (الشكل 2E).
  10. استخدام مقص لقطع بالتوازي الأنسجة / العظام إلى العمود الفقري والانسجة واضحة تحت العمود. جعل هذه التخفيضات عن مستوى ممكن. من المهم جدا أن الأنسجة تكمن مسطحة في غرفة بحيث الحبل هو مستوى للتصوير.
  11. استخدام مشرط رقم 11 لالقطع جذع الدماغ (الماضيإنهاء ألياف الحزمة النواة الناحلة) وعلى مستوى الصدري العلوي لعزل جزء الحبل الشوكي العنقي (انظر الشكل 2F). استخدام المقص لقطع الأنسجة / عظم في هذه نفس نقطتين. وينبغي أن يتضمن الأنسجة المعزولة 2/3 العمود الفقري يشمل الدماغ الذيلية، وتوسيع عنق الرحم، والجزء العلوي من الحبل الشوكي الصدري (الشكل 2G).
  12. وضع العمود الفقري معزولة في طبق بتري من-فقاعات كربوجين، الكالسيوم منخفض المبردة 2+ ACSF. إذا لزم الأمر، وتقليم الأنسجة تحت العمود الفقري حتى انها تقع شقة في الطبق.
  13. نقل العمود الفقري معزول إلى غرفة التصوير خارج الحي وزيادة تدريجية في درجة حرارة سائل الإرواء أكثر من 1 ساعة إلى 36-37 درجة مئوية. الحفاظ على درجة الحرارة هذه أثناء التصوير.

4. التنسيب من فيفو السابقين النخاع الشوكي إلى غرفة التصوير والمايلين وصفها مع النيل الأحمر

  1. تأمين بعناية العمود الفقري في طغرفة maging مع شريحة المناسب المناسبة يعقدون تعديل أسفل مع منصة الشبكة العمودية التي تتكون من المواضيع ليكرا الدقيقة (إزالة المواضيع الوسطى من منصة الشبكة للسماح مساحة للالحبل الشوكي؛ انظر الشكل 3A).
  2. ذوبان الجليد قسامة من النيل الأحمر (5 ملي الأسهم في DMSO و 0.22 ميكرون تصفيتها، ويمكن تخزينها لمدة 1 شهر في 4 درجات مئوية، أو 6 أشهر في -20 درجة مئوية في الظلام). فقط قبل إضافة النيل الأحمر إلى غرفة التصوير، والحد من تدفق مضخة نضح وضبط خط فراغ لضمان السوائل في غرفة ويغطي دائما الحبل الشوكي.
  3. إضافة 5-10 ميكرولتر النيل الأحمر حل الأسهم إلى غرفة التصوير قرب نهاية الذيلية من الحبل (الشكل 3B). استخدام ماصة 1 مل إلى المزيج بلطف النيل الأحمر في جميع أنحاء الغرفة. السماح النيل الأحمر على البقاء في غرفة لمدة 1-2 دقائق، ثم ضع خط فراغ ذهابا وضبط مضخة نضح إلى 1.5-2 مل لكل دقيقة ليروي باستمرار الحبل الشوكي.
  4. بعناية رفع المسرح المجهرومحاذاة الهدف مع مركز للجزء الحبل الشوكي وإعلامي على أعمدة الظهرية حتى الهدف غمر المياه ما يقرب من 10 مم من سطح ACSF في الغرفة. استخدام المجهر عجلة التركيز الأنفية لجلب ببطء الهدف لأسفل حتى أنها تمس برفق سطح ACSF. استخدام مصدر الضوء epifluorescent لتركيز أعمدة الظهرية في مجال الرؤية (الشكل 3C).

5. فيفو السابقين التصوير من الحبل الشوكي الماوس مع TPLSM والتي يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي (LiSCI)

ملاحظة: يوفر الوريد الخلفي علامة مفيدة لتوسيط الأنسجة والألياف الحزمة النواة الناحلة (تنشأ من خلايا الجسم من الظهرية العقد الجذرية ويصعد من T6 وتحت على طول خط الوسط من الحبل الشوكي) بالتوازي مع هذه الأوعية الدموية. كما توفر YFP + عنق الرحم توقعات الجذر الظهري سمكا علامة مفيدة مثل الارتفاع الألياف وتنحدر أفقيا إلى YFP + الحزمة النواة الناحلة الألياف التي هي أصغر في قطر.

  1. مرة واحدة يتم محاذاة الأنسجة الحبل الشوكي بشكل مناسب، والتبديل إلى وضع المسح الضوئي ليزر لأداء التصوير الأساسي من الصعود الحزمة النواة الناحلة الألياف مياليني. لإثارة كلا YFP والنيل الأحمر، استخدام مصدر ليزر ثنائي الفوتون ضبطها إلى 950 نانومتر الطول الموجي (~ 17 ميغاواط قياس في الخروج من 25X، 1.1 الهدف NA) وdichroics المناسب (DM) والمرشحات ممر الموجة لعزل الانبعاثات الفلورسنت من fluorophores (نستخدم 525/50 DM560، DM640 600/60، 685/70 و، لفصل YFP، والنيل الأحمر إلى الأصفر البرتقالي، وقنوات الحمراء الموسعة، على التوالي).
    1. إذا كان أكثر من 3٪ من محاور عصبية تظهر الأجسام الشبه الكروية محور عصبي أثناء التصوير الأساسي (30-60 دقيقة)، ونبذ إعداد بسبب القطع الأثرية التي يسببها المجرب.
  2. لحث على LiSCI بواسطة المكبرة مجال الرؤية ل30.3X (لخلق ~ 20 ميكرون قطر الاجتثاث). ضبط الليزر إلى 800 نانومتر، وزيادة قوة الليزر ل~ 110 ميغاواط فيالعينة. سماح 5 ميدانية كاملة من بالاشعة عرض ليزر لضمان مقطوع الألياف تماما.
  3. تأكيد LiSCI عن طريق تغيير إعدادات الليزر إلى الإعدادات التصوير (950 نانومتر، 17 ميغاواط في العينة، 2.08X) ومسح الأنسجة لتصور الاجتثاث. تحقق من قطر الاجتثاث وأن محاور ذاب الأولية ومقطوع تماما (انظر الشكل 3D). استخدام إعدادات الوقت الفاصل على المجهر جنبا إلى جنب مع التقاط ض لتسجيل الاستجابة الديناميكية من المحاور والمايلين إلى إصابة ما يصل إلى 8-10 + ساعة بعد الإصابة.
    ملاحظة: إذا كان الاجتثاث غير مكتمل (أي transection ناقصة من الألياف)، ونبذ إعداد، وتحديد آليات الإصابة الأولية والثانوية سيتم مرتبك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير شرائح الحبل الشوكي معزولة تصل إلى 24 ساعة بعد LiSCI مع خفيفة الى معتدلة فقط تلف الأنسجة LiSCI مستقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تفاصيل مختبر المناسب اقامة اللازمة لعزل، والحفاظ على قدرتها على البقاء، وصورة يظهر الحبل الشوكي خارج الحي في الشكل 1. ويحتاج المجهر لتكون مجهزة ليزر الفيمتو ثانية الانضباطي نابض، dicroics الاقتضاء والمرشحات الانبعاثات، والإمداد غمس عدسة موضوعية مع فتحة عددية عالية (≥1.0). لضمان بقاء الحبل الشوكي أثناء تشريح، يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في وجود المبردة منخفض ACSF الكالسيوم 2+ المؤكسج الذي يسمح يكفي الكالسيوم 2+ للأغشية محور عصبي معزولة لختم 42. يمكن أن يؤدي عدم القيام بذلك إلى إتلاف axomyelinic بما في ذلك الفصل بين الميلين من غمد المحوار وتشكيل كروي محور عصبي واضحة للعيان أثناء التصوير خط الأساس. وأظهرت صور تمثيلية لعملية تشريح والعزلة من الحبل الشوكي خارج الحي في الشكل 2. العزلة التالية جدوى من الحبل الشوكي هي مaintained التي نضح المستمر لACSF المؤكسج التي يتم الاحتفاظ بها في 36-37 درجة مئوية. المايلين وصمة عار النيل الأحمر 27،43 ويمكن بعد ذلك أن تضاف إلى غرفة نضح، والتسجيلات أساسية من الحزمة النواة الناحلة محاور العصبي يمكن أن تبدأ (الشكل 3).

وتظهر الصور التمثيلية من الحزمة العصبي محاور النواة الناحلة في الشكل (4). وبموجب شروط أساسية تسجيلات timelapse TPLSM تكشف موازية المنحازة YFP + المحاور مغمد في المايلين (النيل الأحمر) بأقطار ثابتة إلى حد كبير على طول محور عصبي. قليل من الأجسام الشبه الكروية محور عصبي أو علامات شكلية أخرى من انحطاط المحاور موجودة. نظرا لخصائص solvatochromic من النيل الأحمر والدهون والبروتين محتوى المايلين، وملطخة المايلين الأصفر البرتقالي في حين الصفوف من أجسام الخلايا دبقية قليلة التغصن المفترض تظهر البرتقال قتامة (الشكل 4A). ويمكن أيضا أن التفاصيل الدقيقة مثل العقد من رانفييه حلها (على سبيل المثال، والسهام في

في 10 دقيقة التالية LiSCI، محاور مقطوع فورا (الإصابة الأولية) تقع منقاري والذيلية الى الموقع الاجتثاث تبدأ في التراجع بعيدا عن موقع الإصابة وتشكل لفائف مثل السيني داخل تورم تضخم المايلين. المايلين مغمد محاور التحكم عن بعد لالاجتثاث تظهر دون تغيير عند هذه النقطة الزمن. قبل 40 دقيقة بعد LiSCI محاور مقطوع الأكثر الابتدائية ومحاور عصبية تمر انحطاط الثانوي (أي يدخر في البداية من إهانة ولكن المنحطة لاحق) تشكيل endbulbs مميزة لأنها تتراجع من موقع الآفة (الشكل 4B). ثلث هذه المحاور مقطوع يخضع حوالي عموم تجزئة حيث أول تتضخم الجزء الأقرب، ويشكل الأجسام الشبه الكروية محواري، وفي نهاية المطاف مقاطع عرضية محور عصبي إلى عدة أطوال غير النظامية من محور عصبي 43. فصل المايلين من محاور عصبية (شبه محور عصبي تورم) وانحطاط حويصلي المايلين واضح أيضا. مع مرور الوقت، تران الابتدائي والثانويمحاور sected تواصل التراجع بعيدا عن موقع الآفة، محاور المرافقة الموقع الاجتثاث فورا الخضوع انحطاط الثانوي، وتورم شبه محور عصبي يصبح أكثر بروزا وكذلك المايلين التورم وانحطاط الحويصلي (الشكل 4D-G، وانظر أيضا 43). وهناك فرق واضح في مدى تراجع محور عصبي يصبح واضحا بين جذوعها القريبة محواري (الذيلية لآفة) وشرائح البعيدة الخاصة بهم (منقاري لآفة) الموجهة للخضوع لانحطاط ولري (الشكل 4D-G). المحاوير يدخر في البداية من قبل LiSCI الخضوع ل تأخر انحطاط الثانوي (الشكل 4H). تجربة تمثيلية السيطرة دون LiSCI، يشير إلى أن جلسات التصوير الطويلة (بعد ما يصل إلى 13 ساعة العزلة الحبل في هذا المثال) ممكنة دون التسبب في آثار سلبية على سلامة المادة البيضاء (الشكل 4I، J).

الممثلة العليا للRESO-وتظهر الصور lution التغيرات axomyelinic بعد LiSCI في الشكل 5.

قبل 3 ساعة بعد LiSCI، فقد تراجع عدد القريبة (الذيلية) محاور بعيدا عن موقع الآفة حيث ما زالوا داخل أنابيب المايلين تورم التي فصلت بعيدا عن محور عصبي. تظهر endbulbs محواري البعض أن توج من قبل المايلين (الشكل 5A). المحاور المجاورة لموقع الاجتثاث تخضع انحطاط الثانوي في حين يبدو البعض الآخر لم يتأثر. YFP منخفضة / الحويصلات السلبية المفترضة (الأزرق الفاتح) ضمن محور عصبي وendbulbs محواري موجودة أيضا. وعلى النقيض من التراجع نحو caudally الألياف، والغالبية العظمى من endbulbs والأجسام الشبه الكروية محواري التراجع rostrally في 3 ساعات ما بعد LiSCI وصفت بقوة مع النيل الأحمر (أقل الأزرق تحول) مما يشير إلى حدوث التغير البيئي ضمن محور عصبي (الشكل 5B). النيل الأحمر المسمى تظهر مناطق داخل محاور التراجع بنشاط لتطويق بصورة رئيسية أو سقف صلب المحاور. على الرغم من أن الموقع الدقيق و IDEntity هذه الهياكل النيل الأحمر المسمى داخل محور عصبي غير معروفة حاليا، فإنها قد تمثل تراكم حويصلة كثيفة عبر نقل محور عصبي و / أو البروتينات المشقوق تعريض الأساسية مسعور من 27. يبقى النيل الأحمر المسمى المايلين أساسا الأصفر البرتقالي في العادي المايلين الظهور. في تمييز، سبرت النيل الأحمر يبدو المايلين حويصلي الأصفر (أي تحول الأزرق) يدل على التغيرات البيئية ضمن هذه الهياكل. قبل 7 ساعة بعد تواصل محاور LiSCI التراجع بعيدا عن موقع الآفة. ومع ذلك، وهذا هو أكثر وضوحا في منقاري (الشكل 5D) مقابل الذيلية (الشكل 5C) endbulbs. محاور أخرى تخضع التفكك الكامل أو الجزئي ترك أنبوب المايلين فارغة أو ساق رقيقة عدة ميكرون بعيدا عن قطاع المنحطة. تطبيق تأخر النيل الأحمر بعد LiSCI يكشف وضع العلامات محور عصبي مماثل قبل تطبيق النيل الأحمر توحي بأن الاجتثاث في حد ذاته والتأثيرات الحرارية المحتملة على تمسخ البروتين هومن غير المرجح مسؤولة عن التحولات النيل الأحمر الطيفية في المايلين ومحاور بعد إصابة (الشكل 5E، F).

بشكل جماعي، وتوضح هذه البيانات فائدة فيفو السابقين نموذج LiSCI لتقليد آليات معروفة ولكن غير مفهومة من الإصابة axomyelinic الحادة في الوقت الحقيقي. وبالتالي قد يكون نموذجا مفيدا لزيادة معرفتنا الفيزيولوجيا المرضية لإصابة المادة البيضاء، وكشف أهداف جزيئية أساسية للحفاظ على سلامة المادة البيضاء.

الشكل (1)
الشكل (1): نظرة عامة على تشريح والتصوير الإعداد. (A) واقترح انشاء لخارج الحي التصوير من الحبل الشوكي. وتشمل المعدات الرئيسية اللازمة لكربوجين (95٪ O 05/02٪ CO 2) خط الغاز إلى الأوكسجين في ACSF، مضخة نضح لتقديم كربوجين-بوبنزف ACSF من خلال جهاز تحكم سخان / درجة الحرارة في خط مجهزة التحقيق ردود الفعل درجة الحرارة، وحمام مفتوح غرفة التصوير مصممة مزودة مصدر فراغ. (B) ويرد التكبير العالي للغرفة حمام التصوير. (C) واقترح انشاء لنضح وتشريح الحبل الشوكي خارج الحي. الكالسيوم منخفض المبردة 2+ والمؤكسج ACSF مع كربوجين وتستخدم للحفاظ على سلامة الحبل الشوكي أثناء تشريح. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: عزل الحبل الشوكي للتصوير (A) تحت المستمر المبردة، المؤكسج منخفضة الكالسيوم 2+ نضح إلى skulيتعرض lcap. (B) يتم إجراء شق من خلال السطح الظهري من الجمجمة على مستوى بصيلات الشم (خط متقطع). وثم قام (C) شقوق الثنائية عبر الحدود الجانبية للقلنسوة حتى أنه يمكن أن يكون بلطف رفعت وسحبت نحو caudally (في اتجاه السهم) لفضح جذع الدماغ. (D) مواصلة شقوق الثنائية مع مقص يميل غرامة لخفض الجوانب الجانبية للفقرات وفضح الأعمدة الظهرية (رأس السهم). (E) ويتعرض وتظهر الدماغ وتوسيع عنق الرحم بأكمله إلى الجزء العلوي من الصدر الحبل الشوكي. (F) مصنوعة اثنين من الشقوق مع عدد 11 مشرط شفرة لعزل الحبل الشوكي في الدماغ، ما وراء النواة الناحلة إنهاء الحزمة محواري ومستوى الصدري العلوي ( الخطوط المتقطعة). (G) ثم يتم نقل النخاع الشوكي معزولة إلى طبق بتري تحتوي على الكالسيوم منخفض المبردة 2+ فقاعات ACSF معكربوجين الغاز. يتم ترك الجذور الظهرية عنق الرحم (على سبيل المثال، النصال)، العقدة الجذرية الظهرية، والحبل الشوكي من قطاع الصدري العلوي لجذع الدماغ (~ 15-20 ملم) سليمة. شريط النطاق في G: 2 مم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: التصوير الحبل الشوكي خارج الحي (A) وبمجرد وضعها في الغرفة، يتم تأمين أنسجة الحبل الشوكي باستخدام المعدلة الأنسجة / شريحة باستمرار مزودة المواضيع ليكرا يضاف (B) وصمة عار المايلين النيل الأحمر مباشرة. وغمرت غرفة التصوير. (C) وثمة هدف غمر الماء في ACSF وضعه على ألياف الحزمة النواة الناحلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
تم استخدام نموذج LiSCI في وسط إصابة محور عصبي مياليني TPLSM للقبض على ديناميات محور عصبي والمايلين الردود التالية LiSCI (*): الشكل 4. يتم عرض الصور التمثيلية توقعات كثافة أقصاها خمس 1 ميكرومتر المقاطع البصرية سميكة القبض على 0.24 ميكرون / بكسل مع نيكون A1RMP المجهر + multiphoton / مبائر مجهزة 25X. NA: 1.1. WD: 2 مم الهدف الغمر بالماء. استخدمت dichroics والمرشحات الانبعاثات القياسية لفصل YFP + المحاور (525/50 DM560، كما هو موضح باللون الأزرق) وsolvatochromic صبغة الفلورسنت محبة للدهون النيل Rإد في أقصر (600/60 DM640، كما هو موضح باللون الأخضر) وأطول (685/70 نانومتر، كما هو موضح في الحمراء) قنوات الانبعاثات. تركيبات مرشح الأخيرتين هي مفيدة لأنها التقاط التحولات الطيفية المعروف النيل الأحمر في البيئات الفيزيائية والكيميائية المختلفة. (A) في الظروف الأساسية محاور (YFP +، أزرق) والمايلين (NR، الأصفر والبرتقالي) يبدو الموجه عادة مع عدد قليل من الأجسام الشبه الكروية أو علامات أخرى من الإصابة axomyelinic. الصفوف من الدبقية مع التشكل من سمات قليلة التغصن البيضاء المسألة (NR، البرتقالي الداكن، مثل النصال) هي أيضا واضحة (بعض ملحوظ من أجل الوضوح)، ويتم حل الهياكل الدقيقة مثل العقد من رانفييه أيضا (مثل السهام). (ب) في 10 دقيقة بعد LiSCI، محاور مقطوع تقع منقاري والذيلية لالآفة تبدأ في التراجع بعيدا عن موقع الإصابة وتشكيل السيني مثل لفائف (الأسهم) داخل المايلين منتفخة. المايلين مغمد محاور بعيدة عن الاجتثاث تظهر دون تغيير عند هذه النقطة الوقت. (C) Bمحاور ص 40 دقيقة بعد LiSCI الأكثر الأولية مقطوع ومحاور عصبية تمر شكل انحطاط الثانوي endbulbs مميزة لأنها تتراجع من موقع الآفة (السهام). كما تشكل بعض المحاور مقطوع الكروية على طول محاور منها (السهام). فصل المايلين من محور عصبي (شبه محور عصبي تورم) وانحطاط حويصلي المايلين واضح أيضا (+). (DG). وبمرور الوقت، المحاور الأساسية والثانوية الجرحى تواصل التراجع بعيدا عن موقع الآفة، وكما يتضح من التوقعات YZ من LiSCI، محاور يدخر البداية المرافقة الموقع الاجتثاث الخضوع تأخر انحطاط الثانوي (H، لوحة اليسرى قبل LiSCI، لوحة المتوسطة 10 دقيقة بعد LiSCI، واليمين لوحة 7 ساعة بعد LiSCI، بقع بيضاء بمناسبة LiSCI الأولي والنقاط الحمراء تشير إلى خسارة من المحاور التي كتبها 10 دقيقة والنقاط الخضراء تشير إلى مدى تأخر انحطاط الثانوية من المحاور من قبل 7 ساعة). تورم شبه محور عصبي يصبح أكثر بروزا في وقت لاحق نقاط الوقت بعد LiSCI. س حدو تراجع محور عصبي ومورفولوجية endbulbs محواري بين جذوعها محور عصبي الداني والقاصي فئتها يصبح أيضا واضح (انظر أيضا الشكل 5 للصور التكبير أعلى). شريط مقياس: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: تم استخدام صور الممثل عالية الدقة من التغييرات axomyelinic بعد LiSCI TPLSM لالتقاط التفاصيل الدقيقة من محور عصبي والمايلين يغير الذيلية (A، C) ومنقاري (B، D) لإصابة في 3 ساعة (A، B) و 7 ساعة (C، D) بعد LiSCI. يتم عرض الصور التمثيلية توقعات كثافة أقصاها ثلاثة 1 ميكرومتر المقاطع البصرية سميكةالقبض على 0.0832 ميكرون / بكسل مع نيكون A1RMP + multiphoton / المجهر متحد البؤر. (A) الذيل إلى LiSCI (*)، عدة محاور (الأزرق) والتراجع بعيدا عن موقع الآفة (السهام كبيرة) داخل أنابيب المايلين تورم (الأصفر والبرتقالي ) التي فصلت بعيدا عن endbulb المحاور. بعض محاور عصبية مجاورة للموقع الاجتثاث تخضع انحطاط الثانوي (السهام الصغيرة) في حين يبدو البعض الآخر لم يتأثر. YFP منخفضة / الحويصلات المفترضة السلبية (شاحب زرقاء) ضمن محور عصبي وendbulbs محواري هي الحالية (السهام). عقدة المركزية للرانفييه (ن) هي أيضا مرئية بشكل واضح استخدام هذه التقنية التصوير ووضع العلامات. (B) وعلى النقيض من التراجع نحو caudally الألياف، والغالبية العظمى من endbulbs والأجسام الشبه الكروية محواري التراجع rostrally في 3 ساعات ما بعد LiSCI وصفت بقوة مع النيل الأحمر (وردي). تظهر مناطق النيل الأحمر المسمى في محاور التراجع لتطويق أساسا أو غطاء YFP محاور المسمى (الأزرق ورؤوس سهام الكبيرة). على الرغم من أن طبيعة هذه النيل الأحمر التسميةهياكل إد غير معروفة حاليا، فإنها قد تمثل تراكم حويصلة كثيفة عبر نقل محور عصبي و / أو البروتينات المشقوق تعريض الأساسية مسعور الخاصة بهم. في تمييز، وصفت النيل الأحمر المايلين الحويصلي (الأسهم) يظهر الأصفر (أي طيف هو تحول الأزرق) مقارنة المايلين العادي (الأصفر والبرتقالي)، يدل على التغيرات البيئية المفترضة في السابق. تورم شبه محور عصبي واضح أيضا (السهام الصغيرة). في 7 ساعات بعد LiSCI، لا تزال المحاور التراجع بعيدا عن موقع الآفة. ومع ذلك، وهذا هو أكثر وضوحا في منقاري (D) مقابل الذيلية (C) endbulbs. بعض محاور تخضع التفكك الكامل أو الجزئي ترك أنبوب فارغ المايلين (السهم في C) أو ساق رقيقة عدة ميكرون بعيدا عن قطاع المنحطة (الأسهم الصغيرة في D)، على التوالي. تطبيق تأخر النيل الأحمر تنتج تحولات طيفية مماثلة في الذيلية مقابل منقاري myelinated محاور عصبية مركزية (E و F (C، D). شريط مقياس: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2X الأوراق المالية وهناك (2 ملي كا 2+) كاشف ملي
كلوريد الصوديوم 252
بوكل 6
CaCl 2 • 2H 2 O 4
2X المالية B ناه 2 PO 4 2.5
MgSO 4 4
NaHCO 3 52
سكر العنب (الجلوكوز D-) 20
2X منخفضة الكالسيوم 2+ سهم C (0.1 ملي كا 2+) كلوريد الصوديوم 252
بوكل 6
MgCl • 6H 2 O 3.8
CaCl 2 • 2H 2 O 0.2

الجدول 1: السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) مخازن.

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
  3. McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
  4. Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
  5. Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
  6. Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
  7. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  8. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  9. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
  10. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
  11. Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
  12. Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
  13. Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
  14. McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
  15. Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
  16. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  17. Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
  18. Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
  19. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
  20. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
  22. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  23. Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
  24. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  25. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
  26. Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
  27. Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
  28. Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
  29. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  30. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
  31. Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
  32. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
  33. Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
  34. Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
  35. Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
  36. Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
  37. Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
  38. Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
  39. Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
  40. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
  41. Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
  42. Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
  43. Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 93، واصابات الحبل الشوكي، المحور، المايلين، واثنين من الفوتون الإثارة المجهري، النيل الأحمر، انحطاط محور عصبي، السقم محور عصبي، تراجع محور عصبي
ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okada, S. L. M., Stivers, N. S.,… More

Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter