Abstract
Skadede CNS axoner undlader at regenerere og ofte trække væk fra skadestedet. Axoner skånet fra den oprindelige skade, kan senere gennemgå sekundær axonal degeneration. Mangel på vækst kegle formation, regeneration, og tab af yderligere myelinerede axonale projektioner i rygmarven i høj grad begrænser neurologisk restitution efter skade. At vurdere, hvordan centrale myelinerede axoner i rygmarven svare til skade, har vi udviklet en ex vivo levende rygmarv model anvender transgene mus, der udtrykker gult fluorescerende protein i axoner og et samlingspunkt og meget reproducerbar laserinduceret rygmarvsskade at dokumentere skæbne axoner og myelin (lipofile fluorescerende farvestof Nile rød) over tid ved hjælp af to-foton excitation time-lapse mikroskopi. Dynamiske processer, såsom akut axonal skade axonal tilbagetrækning, og myelin degeneration bedst undersøgt i realtid. Men den ikke-prioriteret natur kontusion baserede skader og bevægelse artefakter stødtunder in vivo rygmarven imaging make differentiere primære og sekundære axonale skade respons ved hjælp af høj opløsning mikroskopi udfordrende. Den ex vivo rygmarv model her beskrevne efterligner flere aspekter af klinisk relevante kontusion / komprimering-induceret axonale patologier, herunder axonal hævelse, kugleformet dannelse, axonal transektion og peri-aksonal hævelse giver en nyttig model til at studere disse dynamiske processer i real-tid. Store fordele ved denne model er fremragende spatiotemporale opløsning, der tillader differentiering mellem den primære fornærmelse, der direkte skader axoner og sekundære skade mekanismer; styret infusion af reagenser direkte til perfusatet badning ledningen; præcise ændringer af miljømæssige miljø (fx calcium, natriumioner, kendte bidragydere til axonal skade, men næsten umuligt at manipulere in vivo); og murine modeller tilbyder også en fordel, da de giver mulighed for at visualisere ogmanipulere genetisk identificerede cellepopulationer og subcellulære strukturer. Her beskriver vi, hvordan at isolere og afbilde levende rygmarven fra mus at fange dynamikken i akut axonal skade.
Introduction
Degeneration af axoner er en fremtrædende årsag til sygelighed spænder adskillige neurologiske tilstande, herunder neurotrauma, slagtilfælde, autoimmune og neurodegenerative sygdomme. I modsætning til det perifere nervesystem (PNS), centralnervesystemet (CNS) axoner har en begrænset evne til at regenerere, når såret på grund af både indre og ydre barrierer (dvs. hæmmende molekyler til axonal vækst produceret under ardannelse og befriet under myelin degeneration) 1 -7. Selv om flere af disse barrierer er blevet grundigt undersøgt, at terapeutiske indgreb rettet forhindre CNS axonal degeneration, fremme robust axonal regenerering og genoprette funktionel connectively, begrænses.
Axoner engang adskilt fra deres soma gennemgå en stereotyp proces med degeneration kaldet Wallerian degeneration, der er præget af axonal hævelse, klumpformet dannelse og eventuel opsplitning (revideret i 8). IDerimod er proximale stump, der er tilbage i kontinuitet med den soma af en gennemskæres perifer Axon, danner en hævelse ved sin ende, dør tilbage til den nærmeste Ranviersk indsnøring, og kan derefter initiere vækst kegle dannelse, en vital forudsætning nødvendig til efterfølgende axonal regenerering 9-11. I modsætning hertil proximale axonale endelser mange centrale axoner danner karakteristiske "endbulbs" eller retraktionsindstillingen pærer, undlader at danne vækstkegler, og i stedet trække væk fra skaden site, hvor de forbliver i flere måneder efter skaden 12-15. Ud over den primære axonal skade, kan yderligere axonal skade / tab også forekomme for axoner, der blev stort set skånet fra den indledende skade. Dette forsinkede axonal tab af oprindeligt sparet axoner omtales som sekundær axonal degeneration. Denne iboende respons af CNS-axoner skade gør funktionel axonal regenerering en endnu vanskeligere mål at opnå i hjernen og rygmarven.
Selvom hallmarks af axonal skade (f.eks kugleformet dannelse, opløft- pærer) er blevet godt karakteriseret af post mortem væv og eksperimentelle modeller for axonal degeneration, har belysning af de molekylære mekanismer bag disse dynamiske processer blevet begrænset. De fleste af disse undersøgelser har påberåbt sig statisk endpoint observationer, i sagens natur ikke har indfange individuelle axonale reaktioner over tid. Selvom eksogent anvendt axonale sporstoffer have været nyttigt at belyse axonale svar fra statiske sektioner og under billeddannelse, er adgangen til genetisk indkodede axonale markører stærkt forbedret vores evne til at visualisere axoner i realtid ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Faktisk en skelsættende rapport fra Kerschensteiner og kolleger først forudsat direkte bevis for axonal degeneration og regeneration in vivo ved hjælp Thy1 -GFP-S-mus, der koder for grønt fluorescerende protein i undergrupper af neuroner, der sender deres fremskrivninger i den dorsale kolonner i spinalledning 16. Live-billedteknik ved hjælp af to foton laser scanning mikroskopi (TPLSM) og genetisk fluorescerende protein mærkning af celler af interesse fortsætter med at yde direkte bevis og mekanistisk indsigt i mange forskellige dynamiske processer som axonal degeneration, Ca2 + signalering, axonal regenerering, astrocyt fysiologi, mikroglial fysiologi, og respons på skade 17-25.
I modsætning til axoner, er meget lidt kendt af myelin reaktioner på skade i real-tid. Myelin er en vital del af hvid substans, der produceres og vedligeholdes af oligodendrocytter i CNS og Schwann celler i PNS. Myelin isolerer 99% af overfladen af axoner og derved giver en høj modstand, lav kapacitans beskyttende beklædning, der understøtter hurtig og effektiv saltatory impuls formering, for nylig revideret af Buttermore et al. 26. For at fange den dynamiske respons af myelin til skade, vi bruger solvatochromic, lipofilefluorescerende farvestof Nile Red 27. De solvatochromic egenskaber af denne vitale plet tillade spektrale skift i dens emissionsspektrum der er afhængig af fysisk-kemiske miljø 28,29. Disse egenskaber er nyttigt at få indsigt i mekanismerne for axomyelinic skade og kan visualiseres ved hjælp passende udvalgte dichroics og emissionsfiltre eller løses ved hjælp af spektrale mikroskopi 27. For eksempel, Nile Red emissionsspektrum er blå-forskydes i mindre polære lipid-rige omgivelser, såsom dem, der findes i adipocytter og normal CNS myelin (topemission ~ 580-590 nm) 27. I modsætning hertil denne vitale farvestof emission spektrum toppe ved ~ 625 nm i endbulbs dannet som axoner gennemgår axonal skovdød 27. Selv om de præcise mekanismer bag disse spektrale skift specifikt i endbulbs versus normal myelin er fortsat uklare, kan sådanne spektrale ændringer afsløre underliggende ændringer i protein akkumulering eller forvaltningsmæssigt fører tileksponering af hydrofobe bindingssteder 27.
Mens in vivo imaging er den ultimative metriske til observation rygmarv axonal skade dynamik i deres oprindelige miljø, er det teknisk udfordrende og kræver omfattende kirurgisk ekspertise, og ofte gentage kirurgi for at eksponere den dorsale kolonne, der kan indføre eksperimentelle artefakter (f.eks betændelse og ar dannelse). Desuden er dyrt udstyr ofte påkrævet for at tillade suspension og placering af et intakt dyr under mikroskop objektivlinsen. Dyrene skal nøje overvåges, og at sikre, at de forbliver varm, for at sikre, væsker genopfyldes, og at sikre, at der ikke er tegn på hypoxi på grund af langvarig bedøvede imaging sessioner. Sidstnævnte er yderst vigtigt, da axoner og myelin absolut kræver konstant perfusion og tilstrækkelige iltindhold at forblive levedygtig. Men det er ofte ikke rapporteret eller overvåges i de fleste in vivo studier tildato. Desuden bevægelse artefakter på grund af puls og vejrtrækning (isofluran bedøvet voksen mus: ~ 300-450 slag pr minut (BPM) er optimal til at opretholde 97-98% iltmætning (normale sats ~ 632 BPM) og ~ 55-65 vejrtrækninger per min (normale sats er ~ 163 vejrtrækninger per minut), henholdsvis)) 30 opstod under in vivo rygmarven imaging make differentiere primære og sekundære axonale skade respons ved hjælp af høj opløsning fluorescensmikroskopi udfordrende, da selv de hurtigste laser scanninger uundgåeligt er underlagt disse bevægelser artefakter. Fremskridt i ultrahurtige resonante scannere kombineret med en implanterbar stift vertebral indrammet vindue kan tillade billeddannelse af murine rygmarven i vågne dyr, men hurtigere scan gange uundgåeligt reducere signalet til støjforholdet nedbrydende billedkvalitet. Yderligere forbedringer af rygmarv billeddiagnostiske teknikker som i øjeblikket anvendes til hjernescanning kan overvinde mange af disse hindringer og begrænse potentielle forvirrer indført ved inakeligt vævsperfusion, fx 31-33.
Meget af det, man ved om hvide substans fysiologi og mekanismer hvid substans skaden er blevet bestemt ved hjælp af in vitro eller ex vivo præparater af hvid substans fra synsnerven, perifer nerve, og strimler af rygmarven hvide substans 34-41. Disse præparater fortsætte med at fremme vores viden om hvide substans skade mekanismer, da de tillader kontrollerede ændringer i miljøfaktorer, kontrollerede anvendelse af lægemidler og reagenser, funktionelle vurderinger ved hjælp elektrofysiologi, og direkte fluorescens mikroskopi observationer af axoner og myelin i levende væv. Men for nogle tidligere tilgange observere axoner fra rygmarv dorsale kolonne strimler eller mobile hvide substans strimler uundgåeligt skade overflade axoner under fjernelsen fase, kan påvirke respons på nært modstående axoner. For at udnytte de eksperimentelle manipulationer over og undgå skader på veRy fibre, der undersøges, bruger vi en ex vivo cervikal rygmarv model, da det forhindrer direkte kontakt mellem dorsale aspekt af ledningen. Således arkitektur pia mater og tilstødende kolonne axoner overfladisk dorsale forbliver levedygtige og uforstyrret under isolation.
Her beskriver vi en forholdsvis enkel fremgangsmåde, der giver mulighed for direkte visualisering af centrale myelinerede axoner, som de dynamisk reagere på en fokal skade i real-tid op til 8 - 10+ timer efter skaden. Laseren-induceret rygmarvsskade (Lisci) model giver mulighed differentiering mellem primære og sekundære axonal skade mekanismer som den primære læsion (ablation stedet) forbliver rumligt begrænsede over tid. Den åbne bad imaging kammer er tilgængelig for terapeutisk intervention, reagens levering, og miljømæssige manipulationer. Formodede axomyelinic beskyttelsesmidler kan hurtigt vurderes i realtid ved direkte observationer versus langvarige og kostbare forsøg med væv procesING, sektionering, immunfarvning, image capture og analyse og dermed et nyttigt surrogat model til at vurdere akutte reaktioner og beskyttende manipulationer Før testning eksperimentelle stoffer i levende dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført under retningslinier fastsat af det institutionelle Animal Care og brug Udvalg ved University of Louisville, overholde føderale bestemmelser.
1. Fremstilling af lav Ca 2+ og 2 mM Ca2 + Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) perfusater
- Forbered 2x lav Ca 2+ (0,1 mM) Stock C buffer, 2x normal Ca2 + (2 mM) Stock A buffer, og 2x Stock B-buffer som beskrevet i tabel 1. De individuelle stamopløsninger tillader modifikation af ion-indhold (f.eks lav eller nul Ca 2+) og kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
- For intrakardial perfusion under dissektion, tilsættes 100 ml 2x lav Ca 2+ Stock C og 100 ml 2x Stock B i en plastflaske at 1x lav Ca 2+ aCSF. Bland og opbevar natten over ved 4 ° C eller gøre frisk.
- For perfusion af ex vivo rygmarv under imagmaterialer, tilsættes 500 ml 2x normal Ca 2+ Stock A og 500 ml 2x Stock B i en 1 L glasflaske at generere 1x aCSF. Bland og opbevares natten over ved stuetemperatur eller lave frisk.
- Juster pH ACSF buffere til 7,4. Mens holde aCSF ved stuetemperatur, placeres lavt Ca 2+ aCSF på is og derefter boble begge buffere med carbogen-gas (95% O2; 5% CO 2) i 30 minutter før brug og kontinuerligt under perfusion.
2. Fremstilling af ex vivo afbildningskammeret
- Wrap et varmetæppe (ingen automatisk slukke) omkring aCSF flasken og justere varmen til lav / medium indstilling.
- Indsæt en dedikeret aCSF perfusion linje i flasken forbundet til en perfusion pumpe og in-line varmelegeme, som styres af en bipolar temperaturregulator og feedback temperatur probe som vist i figur 1A.
- Vedhæft en flad mikroskop scene indsats (152 x 102 mm) til 2-foton excitation / confocal mikroskopbordet forsynet med en spill container.
- Placer en stor åben-bad perfusionskammer (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) i udslippet beholder til at rumme og give kontinuerlig strøm af frisk iltet aCSF til ex vivo rygmarven (se figur 1 B efter en egnet ex vivo imaging kammer design).
- Tilslut in-line varmeapparatets metal output port til ex vivo imaging kammer med egnet slange. Placer en tynd absorberende pude under ex vivo imaging kammer til at fastholde temperaturen af puffer / væv under billedbehandling.
- Klæbe ex vivo imaging kammer til bunden af udslippet beholder / fase insertet ved anvendelse aftagelig klæbrig tack. Den formbarhed af klæbrig tack vil tillade kammeret at blive justeret efter behov for at sikre en objektiv lyssti er vinkelret på vævsoverfladen. Brug om nødvendigt en bullseye niveau for at justere kammeret.
- Fastgør enin-line varmelegeme Feedback temperatursonde nær indløbskammeret væske og en rustfri stål sugerøret forbundet til en vakuumledning på udløbskammeret. Magnetbånd og passende mikropipette indehavere er nyttige i denne henseende. Tænd vakuumkilden.
- Tænd perfusion pumpe til at begynde at fylde imaging kammer med iltet aCSF. Indstil perfusion pumpen til 1,5-2 ml pr min.
- Styr volumen aCSF i imaging kammer ved at justere vakuum linje. Det er vigtigt, at der er nok aCSF i afbildningskammeret at dække rygmarven segment og tillade tilstrækkelig bearbejdning afstanden mellem en vand dypning objektiv og vævsoverfladen. Myelin og axoner kan skadeligt påvirket, hvis vævet segment ikke er helt nedsænket i frisk oxygeneret aCSF fører til forsøgslederen inducerede artefakter.
- Juster in-line varmelegeme temperaturregulator så perfusatet temperatur i afbildningskammeret er nær stuetemperatur.
- Aflive en voksen 6-10 uger gamle Thy1 -YFP transgene mus (brug passende stamme, der har fluorescerende protein ekspression i dorsale rodganglieneuroner) ved injektion af en overdosis af anæstesi natriumpentobarbital (200 mg / kg) via intraperitoneal injektion.
- Når under det korrekte niveau af anæstesi (f.eks ingen reaktion på tå knivspids og tab af blinkerefleks), omhyggeligt barbere huden overliggende rygmarv og hjerne med kirurgiske klippere. Rens huden med betadine og 70% ethanol pads.
- Spray bryst / mave område med 70% ethanol, derefter perfundere emnet transkardialt anvendelse af afkølet, carbogen-boblet lav Ca 2+ aCSF. (Se figur 1C for foreslået dissektion bænk top oprettet).
- Som leveren blegner, fastgøre perfusion nålen ind i hjertet ved hjælp af en lille klip. Vend emne for at få adgang barberede dorsale side afemnet og tør barberede område med 70% ethanol.
- Foretag en dorsale hud snit langs midterlinjen startende fra næse til hip hjælp dissektion saks til at udsætte hjernen og rygsøjlen (figur 2A). Fastgør forberedelse ved at placere stifter på næse og hofterne.
- Ved hjælp af en dissektion mikroskop fra dette punkt, fast tværs den dorsale overflade af kraniet på niveau med de olfaktoriske pærer. Indsæt en af saksens tips i den laterale kanter af snittet og skåret langs kanterne af kalot bilateralt indtil cerebellum.
BEMÆRK: Du må ikke helt udskære kalot, som det senere er nødvendigt for at løfte det overliggende væv fra rygmarven gennem dissektion (se figur 2B). - Løft kalot at eksponere hjernen. Forsigtigt skære venstre og højre kanter af interparietal knogle (placeret i lillehjernen), og træk det tilbage kaudalt at blotlægge hjernestammen / rygmarven (Figur 2C
- Brug fine tippes saks afholdt på en 45 ° vinkel til bordet overflade og skære hvirvlerne bilateralt bare ringere end de bageste nerve rødder.
BEMÆRK: Undgå kontakt med lyse hvide dorsale kolonner. Disse fibre er dem, der vil blive afbildet (Figur 2D) og kan nemt blive beskadiget. - Løft kalot og dorsale overflade af rygsøjlen med fine tippet pincet, forsigtigt at trække det overliggende væv i ét stykke som nedskæringer er lavet for at blotlægge rygmarven. Fortsæt med at skære ryghvirvler til det øvre thorax niveau for at isolere en 1-2 cm segment af livmoderhalskræft ledning til efterfølgende billeddannelse (Figur 2E).
- Brug en saks til at klippe vævet / knogle parallelt med rygsøjlen og klar væv under kolonnen. Gør disse nedskæringer så vandret som muligt. Det er meget vigtigt, at vævet ligger fladt i kammeret, så at ledningen er niveauet for billeddannelse.
- Brug en # 11 skalpel til transektere hjernestammen (forbiafslutning af gracile fasciculus fibre) og på øvre thorax niveau at isolere den cervikale rygmarv segment (se figur 2F). Brug en saks til at klippe væv / knogle på de samme to punkter. Det isolerede væv skal indeholde 2/3 af rygsøjlen omfatter den caudale hjernestammen, livmoderhalskræft udvidelse samt øvre thorax rygmarv (figur 2G).
- Placer isolerede rygsøjlen i en petriskål af carbogen bobler, kølet lav Ca 2+ aCSF. Hvis det er nødvendigt, trim vævet under rygsøjlen, indtil det ligger fladt i skålen.
- Overfør isolerede rygsøjlen til ex vivo-billeddannelse kammer og gradvist øge perfusatet temperatur i løbet af 1 time til 36-37 ° C. Denne temperatur holdes under billedbehandling.
4. Placering af Ex Vivo Spinal Cord i Imaging Afdeling og myelin Mærkning med Nile Red
- Sikre forsigtigt rygsøjle i imaging kammer med en passende fitting skive Hold nede modificeret med en lodret gitter platform bestående af fine Lycra tråde (fjern midterste tråde af nettet platform til at give plads til rygmarven, se figur 3A).
- Optø en alikvot af Nile Red (5 mM stamopløsning i DMSO og 0,22 um filtreret; kan opbevares i 1 måned ved 4 ° C eller 6 måneder ved -20 ° C i mørke). Lige før tilsætning af Nile Red til afbildningskammeret, reducere strømmen af perfusion pumpen og justere vakuumledningen at sikre fluidet i kammeret altid dækker rygmarven.
- Tilføj 5-10 pi Nile Red stamopløsning til afbildningskammeret nær den kaudale ende af ledningen (figur 3B). Brug en 1 ml pipette forsigtigt blande Nile Red hele kammeret. Tillad Nile Red at bo i kammeret for 1-2 min, og derefter placere vakuumledning tilbage og justere perfusion pumpe til 1,5-2 ml pr min kontinuerligt perfundere rygmarven.
- Hæve forsigtigt mikroskopbordetog tilpasse formålet med midten af rygmarven segmentet og medialt i den dorsale kolonnerne indtil nedsænkning i vand mål er ca. 10 mm fra overfladen af aCSF i kammeret. Brug næsestykket fokus hjulet mikroskop langsomt bringe målet ned, indtil det rører ved overfladen af aCSF. Brug en epifluorescerende lyskilde til at fokusere den dorsale kolonner i synsfeltet (figur 3C).
5. Ex Vivo Imaging af musen Spinal Cord med TPLSM og Laser-induceret Rygmarvsskader (Lisci)
BEMÆRK: posterior vene giver en nyttig markør for at centrere væv som de gracile fasciculus fibre (stammer fra cellen kroppen af dorsalrodsganglier og stige op fra T6 og nedenfor langs midterlinien af rygmarven) løber parallelt med denne blodkar. Jo tykkere YFP + hals- root fremskrivninger også en nyttig markør som fibre stige op og ned lateralt til YFP + gracile fasciculus fibre, der er mindre i diameter.
- Når rygmarven væv er justeret korrekt, at skifte til laserscanning tilstand udføre baseline billeddannelse af opstigende gracile fasciculus myelinerede fibre. For at vække både YFP og Nile Red, bruge et to-foton laser kilde tunet til 950 nm bølgelængde (~ 17 mW målt ved afgangen fra en 25X, 1,1 NA mål), og passende dichroics (DM) og båndpasfiltre at isolere den fluorescerende emission af fluoroforerne (vi bruger 525/50 DM560, 600/60 DM640, og 685/70, at adskille YFP, og Nile Red til gul-orange, og udvidede røde kanaler, henholdsvis).
- Hvis mere end 3% af axoner viser axonale spheroids under baseline imaging (30-60 min), kasseres forberedelse grundet eksperimentator-induceret artefakter.
- Fremkalde en Lisci ved forstørre synsfelt 30.3X (til at skabe en ~ 20 um diameter ablation). Tune laseren til 800 nm, og øge styrken af laseren til ~ 110 mW vedprøven. Tillad 5 hele synsfeltet laser scanner for at sikre fibre helt gennemskåret.
- Bekræft Lisci ved at ændre laser indstillinger tilbage til imaging-indstillinger (950 nm, 17 MW ved prøven, 2.08X) og scanne vævet til at visualisere ablation. Kontroller diameter ablation, og at de primære ablerede axoner er fuldstændig gennemskåret (se figur 3D). Brug tid-lapse indstillinger på mikroskopet kombineret med z capture til at registrere den dynamiske respons af axoner og myelin af skader op til 8-10 + timer efter skaden.
BEMÆRK: Hvis ablation er ufuldstændig (dvs. ufuldstændig transektion af fibre), kasseres præparatet, som bestemmelsen af primære og sekundære skade mekanismer beskæmmes. Desuden kan isolerede rygmarv segmenter afbildes op til 24 timer post-Lisci med kun mild til moderat Lisci-uafhængig vævsskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljer for et passende laboratorium nedsat behov for at isolere, vedligeholde levedygtigheden, og billedet ex vivo rygmarven er vist i figur 1. Mikroskopet skal udstyres med en afstemmelig pulseret femtosekundlaser passende dicroics og emissionsfiltre, og vand- dypning objektiv med en høj numerisk blænde (≥1.0). For at sikre levedygtighed rygmarven under dissektion, bør proceduren udføres i nærværelse af kølet iltet lav Ca 2+ aCSF der giver nok Ca 2+ for de isolerede axonale membraner at forsegle 42. I modsat fald kan forårsage axomyelinic skader, herunder adskillelse af myelin fra axolemma og axonal klumpformet dannelse klart synlig under baseline billeddannelse. Repræsentative billeder af dissektion processen og isolering af ex vivo rygmarven er vist i figur 2. Efter isolering levedygtighed rygmarven er maintained ved kontinuerlig perfusion af iltet aCSF, der holdes ved 36-37 ° C. Den myelin plet Nile Red 27,43 kan derefter tilsættes til perfusionskammeret, og baseline optagelser af gracile fasciculus myelinerede axoner kan påbegyndes (figur 3).
Repræsentative billeder af gracile fasciculus myelinerede axoner er vist i figur 4. Under grundlinjebetingelser timelapse TPLSM optagelser afslører parallelt opstillet YFP + axoner ensheathed i myelin (Nile Red) med stort set konstant diameter langs længden af axon. Få axonale sfæroider eller andre morfologiske tegn på axonal degeneration er til stede. På grund af de solvatochromic egenskaber Nile Red og lipid- og proteinindhold af myelin er myelin farves gul-orange henviser rækker af formodet oligodendrocyt cellelegemer synes mørkere orange (figur 4A). Fine detaljer såsom knudepunkter Ranvier kan også løses (f.eks pile i Ved 10 min efter Lisci straks overskårne axoner (primær skade) placeret rostral og caudale til ablation stedet begynde at trække sig væk fra skadestedet og danne sigmoidal-lignende spoler inden hævede ballooning myelin. Myelin indhyllende axoner fjernbetjening til ablation vises uændret på dette tidspunkt. Ved 40 min post-Lisci mest primære overskårne axoner og axoner gennemgår sekundær degeneration (dvs. oprindelig skånet fra spot men senere degenereret) danner karakteristiske endbulbs som oprulles fra læsionsstedet (figur 4B). Ca. en tredjedel af disse overskårne axoner undergår pan-fragmentering, hvor det proximale segment første dønninger, danner axonale kugler, og i sidste ende transects Axon i flere uregelmæssige længder af Axon 43. Adskillelse af myelin fra axoner (peri-axonale hævelse) og vesikulær degeneration af myelin er også tydelig. Over tid, primær og sekundær transected axoner fortsat tilbagetrækning væk fra læsionsstedet, axoner umiddelbart flankerer ablationsstedet underkastes sekundær degeneration og peri-axonal opsvulmen bliver mere fremtrædende samt myelin hævelse og vesikulær degeneration (figur 4D-G, se også 43). En klar forskel i omfanget af axonal tilbagetrækning viser sig mellem proksimale axonale træstubbe (caudale til læsion) og deres distale segmenter (rostralt til læsion), der er bestemt til at undergå Wallerian degeneration (figur 4D-G). Axoner oprindeligt sparet af Lisci gennemgå forsinket sekundær degeneration (figur 4H). En repræsentativ kontrolforsøg uden Lisci, tyder på, at er mulige lange billeddiagnostiske sessioner (op til 13 timer efter snor isolation i dette eksempel) uden at forårsage skadelige virkninger på hvid substans integritet (Figur 4I, J). Repræsentant høj resoløsningsstrate- billeder af axomyelinic ændringer efter Lisci er vist i figur 5. Ved 3 timer efter Lisci har flere proksimale (caudale) axoner tilbagetrukket væk fra læsion site, hvor de forbliver inden hævede myelin rør, der har adskilt væk fra Axon. Andre axonale endbulbs tilsyneladende lukkes med myelin (figur 5A). Axoner støder op til ablation stedet gennemgå sekundær degeneration mens andre synes upåvirket. YFP lave / negative formodede vesikler (lyseblå) inden for Axon og axonale endbulbs er også til stede. I modsætning til kaudalt trække fibre, er de fleste af de rostrally tilbagetrækningskraften axonale endbulbs og spheroids på 3 timer efter Lisci stærkt mærket med Nile Red (mindre blå flyttet) indikerer en miljøændringer Axon (figur 5B). Nile Red-mærkede områder inden for aktivt tilbagetrækningskraften axoner tilsyneladende primært omgive eller cap axonal kerne. Selvom den præcise placering og ideNTITY af disse intra-axonale Nile Red-mærkede strukturer er i øjeblikket ukendt, kan de repræsentere tætte vesikel ophobning via axonal transport og / eller spaltede proteiner udsætter deres hydrofobe kerne 27. Nile Red mærkede myelin stadig hovedsageligt gul-orange i normalt vises myelin. Til forskel, Nile Red undersøgt vesikulær myelin synes gul (dvs. blå flyttet) indikerer miljømæssige ændringer inden for disse strukturer. Ved 7 timer efter Lisci axoner fortsætter tilbagetrækning væk fra læsionsstedet; Men det er mere tydeligt i rostral (figur 5D) versus caudale (figur 5C) endbulbs. Andre axoner undergår fuldstændig eller delvis nedbrydning forlader en tom myelin rør eller en tynd stilk flere mikrometer væk fra degenererende segment. Forsinket anvendelse af Nile Red efter Lisci afslører lignende axonal mærkning som præ-anvendelse af Nile Red tankevækkende at ablation sig selv og potentielle termiske effekter på proteindenaturering erusandsynligt ansvarlig for Nile Red spektrale skift i myelin og axoner efter skade (figur 5E, F). Kollektivt disse data illustrerer anvendeligheden af ex vivo Lisci model at efterligne kendte men dårligt forståede mekanismer akut axomyelinic skade i real-tid. Modellen kan derfor være nyttigt at fremme vores viden om patofysiologien af hvide substans skade, og afdække vigtige molekylære mål at bevare hvide substans integritet. 
Figur 1: Oversigt over dissektion og billedbehandling setup. (A) En foreslået sat op til ex vivo billeddannelse af rygmarven. Den store nødvendige udstyr omfatter en carbogen (95% O2 / 5% CO 2) gasledningen at oxygenere aCSF, en perfusion pumpe til at levere carbogen-bubblødte aCSF gennem en in-line varmelegeme / temperaturregulator enhed udstyret med en feedback-temperatursonde, og en åben-bad designet imaging kammer forsynet med en vakuumkilde. (B) en højere forstørrelse af den billeddannende badkammeret vises. (C) En foreslået set-up for perfusion og dissektion af ex vivo rygmarven. Chilled lav Ca 2+ aCSF iltes med carbogen og anvendes til at opretholde levedygtigheden af rygmarven under dissektion. Klik her for at se en større udgave af dette tal. 
Figur 2:. Isolering af rygmarven til billeddannelse (A) under kontinuerlig kølet, iltet lav Ca2 + Perfusion kranielcap er udsat for. (b) en incision gennem den dorsale overflade af kraniet på niveau med de olfaktoriske pærer (stiplet linje). (C) Bilaterale indsnit foretages derefter gennem de laterale grænser kalot, indtil det kan forsigtigt løftes og trækkes kaudalt (i retning af pilen) for at blotlægge hjernestammen. (D) Fortsæt bilaterale indsnit med fine tippet saks til at klippe de laterale aspekter af ryghvirvler og udsætte den dorsale kolonner (pilespids). (E) Den eksponerede hjernestammen og hele cervikal udvidelse til den øvre thorax segment af rygmarven er vist. (F) to indsnit med en række 11-skalpelblad er lavet til at isolere rygmarven på hjernestammen, ud over de gracile fasciculus axonale afslutninger og øvre thorax plan ( stiplede linjer). (G) Den isolerede rygmarven overføres derefter til en petriskål indeholdende kølet lav Ca 2+ aCSF boblede medcarbogen gas. Hals- rødder (fx pilespidser), dorsale ganglion, og rygmarv fra den øvre thorax segment til hjernestammen (~ 15-20 mm) efterlades intakt. Scale bar i G:. 2 mm Klik her for at se en større udgave af dette tal. 
Figur 3:. Billedbehandling ex vivo rygmarven (A) Når den er placeret i kammeret, er rygmarven væv sikret med en modificeret væv / skive holde nede udstyret med Lycra gevind (B) Den myelin pletten Nile Red tilsættes direkte til. imaging kammer. (C) En vand nedsænkning mål er neddykket i aCSF og anbragt over gracile fasciculus fibre. 
Figur 4:. Lisci model af central myelinerede Axon skade TPLSM blev brugt til at indfange dynamikken i Axon og myelin reaktioner efter Lisci (*). Repræsentative billeder vises som maksimale intensitet fremskrivninger af fem 1 um tyk optiske sektioner taget med 0,24 um / pixel med et Nikon A1RMP + multiphoton / konfokal mikroskop udstyret med en 25X; NA: 1.1; WD: 2 mm vand nedsænkning mål. Standard dichroics og emissionsfiltre blev brugt til at adskille YFP + axoner (525/50 DM560, vist i blåt) og solvatochromic lipofile fluorescerende farvestof Nile Red i kortere (600/60 DM640, vist med grønt) og længere (685/70 nm, er vist med rødt) emission kanaler. De to sidstnævnte filterkombinationer er fordelagtige, da de fange Nile Red kendte spektrale skift i forskellige fysisk-kemiske miljøer. (A) I grundlinjebetingelser axoner (YFP +, blå) og myelin (NR, gul-orange) vises normalt orienteret med få sfæroider eller andre tegn på axomyelinic skade. Rækker af glia med den karakteristiske morfologi for hvide substans oligodendrocytter (NR, mørk orange, fx pilespidser) er også synlig (nogle markeret til klarhed), og fine strukturer såsom knudepunkter Ranvier også løses (f.eks pile). (B) ved 10 min efter Lisci, overskårne axoner placeret rostral og caudale til læsionen begynder at trække væk fra skadestedet og danne sigmoidale-lignende spoler (pile) inden hævede myelin. Myelin indhyllende axoner fjernt fra ablation vises uændret på dette tidspunkt. (C) By 40 min post-Lisci mest primære overskårne axoner og axoner der gennemgår sekundær degeneration danner karakteristiske endbulbs da de trække fra læsionsstedet (pilespidser). Nogle overskårne axoner også dannelse af sfæroider langs længden af deres axoner (pile). Adskillelse af myelin fra Axon (peri-axonale hævelse) og vesikulær degeneration af myelin er også tydeligt (+). (GD). Over tid, primære og sekundære tilskadekomne axoner fortsat trække væk fra læsionsstedet, og som det fremgår af YZ fremskrivninger af Lisci undergår oprindeligt sparet axoner flankerer ablation stedet forsinket sekundær degeneration (H, venstre panel før Lisci, midterste plade 10 minutter efter Lisci, og højre panel 7 timer efter Lisci, hvide prikker markerer den oprindelige Lisci, røde prikker angiver tab af axoner efter 10 min og grønne prikker angiver omfanget af forsinket sekundær degeneration af axoner af 7 timer). Peri-axonal hævelse bliver mere fremtrædende på senere tidspunkter efter Lisci. Omfanget of axonal tilbagetrækning og morfologi axonale endbulbs mellem proksimale Axon stubbe og deres distale segmenter bliver også tydeligt (Se også figur 5 til højere forstørrelse billeder). Scale bar:. 50 um Klik her for at se en større udgave af dette tal. 
Figur 5:. Repræsentative billeder af axomyelinic ændringer efter Lisci TPLSM høj opløsning blev anvendt til at fange indviklede detaljer af axon og myelin ændrer caudale (A, C) og rostral (B, D) til skade ved 3 timer (A, B) og 7 timer (C, D) efter Lisci. Repræsentative billeder vises som maksimale intensitet fremskrivninger af tre 1 um tyk optiske sektionerfanget på 0,0832 um / pixel med et Nikon A1RMP + multiphoton / konfokalt mikroskop. (A) kaudalt for Lisci (*), flere axoner (blå) er tilbagetrækningskraften fra læsionsstedet (store pilespidser) inden hævede myelin rør (gul-orange ), der har adskilt fra axonal endbulb. Nogle axoner støder op til ablation stedet undergår sekundær degeneration (små pilespidser), mens andre synes upåvirket. YFP lave / negative formodede vesikler (lyseblå) i axon og axonale endbulbs er til stede (pile). Et centralt knudepunkt Ranvier (n) er også tydeligt ved hjælp af denne billeddannelse og mærkning teknik. (B) I modsætning til kaudalt trække fibre, er de fleste af de rostrally tilbagetrækningskraften axonale endbulbs og spheroids på 3 timer efter Lisci stærkt mærket med Nile Rød (lyserød). Nile Red-mærkede områder i tilbagetrækningskraften axoner tilsyneladende primært omgive eller kasket YFP mærkede axoner (blå, store pilespidser). Selv om arten af disse Nile Red-labeled strukturer er i øjeblikket ukendt, kan de repræsentere tætte vesikel ophobning via axonal transport og / eller spaltede proteiner udsætter deres hydrofobe kerne. Til forskel, Nile Red mærkede vesikulær myelin (pile) synes gul (dvs. spektrum er blå flyttet) sammenlignet med normal myelin (gul-orange), tegn på formodede miljømæssige ændringer i førstnævnte. Peri-axonal hævelse er også indlysende (små pilespidser). 7 timer efter Lisci, axoner fortsat tilbagetrækning væk fra læsionsstedet; Men det er mere tydeligt i rostral (D) versus caudale (C) endbulbs. Nogle axoner gennemgår hel eller delvis disintegration forlader et tomt myelin rør (pil i C) eller en tynd stilk flere mikrometer væk fra udarter segmentet (små pile i D), hhv. Forsinket anvendelse af Nile Red producerer lignende spektrale skift i caudale versus rostralt centrale myelinerede axoner (E og F
| 2x Stock A (2 mM Ca 2+) | Reagens | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCI | 6 | |
| CaCl2 • 2H 2 O | 4 | |
| 2x Stock B | NaH 2 PO 4 | 2.5 |
| MgSO4 | 4 | |
| NaHCO3 | 52 | |
| Dextrose (D-glucose) | 20 | |
| 2x lav Ca 2+ Stock C (0,1 mM Ca 2+) | NaCl | 252 |
| KCI | 6 | |
| MgCl • 6H 2 O | 3.8 | |
| CaCl2 • 2H 2 O | 0.2 |
Tabel 1: Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) buffere.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
