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Neuroscience

Un Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173

Abstract

Assoni SNC feriti non riescono a rigenerarsi e spesso ritrarre lontano dal luogo di ferita. Gli assoni risparmiati dalla lesione iniziale possono poi subire una degenerazione assonale secondaria. La mancanza di formazione cono di crescita, la rigenerazione, e la perdita di ulteriori proiezioni assonale mieliniche all'interno del midollo spinale limita notevolmente il recupero neurologico dopo un trauma. Per valutare come centrale mielinizzati assoni del midollo spinale rispondono al danno, abbiamo sviluppato un modello ex vivo che vive midollo spinale utilizzando topi transgenici che esprimono la proteina giallo fluorescente in assoni e una focale e lesioni del midollo spinale indotta da laser altamente riproducibile per documentare il destino di assoni e mielina (colorante fluorescente lipofila Nile Red) nel tempo utilizzando la microscopia a due fotoni di eccitazione time-lapse. Processi dinamici come lesioni acute assonale, retrazione assonale e mielinica degenerazione sono meglio studiati in tempo reale. Tuttavia, la natura non-focale delle lesioni basate contusione-e artefatti da movimento rilevatodurante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopio impegnativo. Il modello in vivo ex midollo spinale descritto qui imita alcuni aspetti di rilevanza clinica contusione / patologie assonale compressione indotta tra cui gonfiore assonale, formazione sferoide, transezione assonale, e peri-assonale gonfiore fornendo un modello utile per studiare questi processi dinamici in tempo reale. I principali vantaggi di questo modello sono eccellenti risoluzione spazio-temporale che permette la differenziazione tra l'insulto primario che danneggia direttamente gli assoni e dei meccanismi di lesioni secondarie; infusione controllata di reagenti direttamente al bagno perfusato il cavo; alterazioni precise del milieu ambientale (ad esempio, il calcio, ioni sodio, noti collaboratori di danno assonale, ma vicino impossibile da manipolare in vivo); e modelli murini offrono anche un vantaggio in quanto forniscono la possibilità di visualizzare emanipolare popolazioni di cellule geneticamente identificati e strutture cellulari. Qui, descriviamo come isolare e immagine vivente midollo spinale di topi per catturare dinamiche di danno assonale acuta.

Introduction

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La degenerazione degli assoni è una causa importante di morbilità abbracciano diverse condizioni neurologiche tra cui neurotrauma, ictus, autoimmuni e malattie neurodegenerative. A differenza del sistema nervoso periferico (PNS), sistema nervoso centrale (SNC) assoni hanno una limitata capacità di rigenerare volta feriti causa sia barriere intrinseche ed estrinseche (cioè, molecole inibitrici della crescita assonale prodotti durante la formazione di cicatrici e liberato durante mielina degenerazione) 1 -7. Sebbene molti di questi ostacoli sono stati ampiamente esplorato, interventi terapeutici mirati per prevenire CNS degenerazione assonale, promuovere la rigenerazione assonale robusto, e ripristinare connectively funzionale, restano limitati.

Gli assoni una volta separati dal loro soma subiscono un processo di degenerazione stereotipata nota come degenerazione walleriana che è caratterizzata da gonfiore assonale, formazione sferoidale ed eventuale frammentazione (rivisto in 8). Incontrasto, il moncone prossimale che rimane in continuità con la soma di un assone periferiche transected, forma una tumefazione alla sua estremità, muore al nodo più vicino di Ranvier, e può quindi avviare la crescita formazione cono, un prerequisito vitale necessario per la successiva rigenerazione assonale 9-11. Al contrario, le terminazioni degli assoni prossimali di molti assoni centrali caratteristica forma "endbulbs" o lampadine retrazione, non riescono a formare coni di crescita, e invece rientrare dal sito della lesione dove rimangono per mesi dopo l'infortunio 12-15. Oltre al danno assonale primario, ulteriore danno assonale / perdita può verificarsi anche a assoni che sono stati in gran parte risparmiata dalla lesione iniziale. Questa perdita assonale ritardato di assoni inizialmente risparmiati viene definita degenerazione assonale secondaria. Questa risposta inerente assoni del SNC al danno rende la rigenerazione assonale funzionale un obiettivo ancora più difficile da raggiungere nel cervello e nel midollo spinale.

Anche se hallmarks di danno assonale (ad esempio, la formazione sferoide, lampadine di svincolo) sono state ben caratterizzate da tessuti post mortem e modelli sperimentali di degenerazione assonale, studio dei meccanismi molecolari alla base di questi processi dinamici è stato limitato. La maggior parte di questi studi si è basata su osservazioni endpoint statiche che non hanno di per sé di catturare singole risposte assonale nel tempo. Anche se esogeno applicate traccianti assonali sono stati utili a chiarire le risposte assoni dalle sezioni statiche e durante l'imaging dal vivo, la disponibilità di marcatori assonale geneticamente codificati ha notevolmente migliorato la nostra capacità di visualizzare assoni in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infatti, un rapporto seminale da Kerschensteiner e colleghi prima ha fornito prova diretta di degenerazione assonale e rigenerazione in vivo utilizzando topi Thy1 GFP-S che codificano la proteina fluorescente verde in sottoinsiemi di neuroni che inviano le loro proiezioni nelle colonne dorsali del midollocavo 16. Immagini dal vivo utilizzando due approcci microscopia a scansione laser fotoni (TPLSM) e l'etichettatura proteina fluorescente genetico delle cellule di interesse continua a fornire prove dirette e comprensione meccanicistica in molti diversi processi dinamici come la degenerazione assonale, Ca 2+ segnalazione, la rigenerazione assonale, astrociti fisiologia, la fisiologia della microglia, e la risposta al danno 17-25.

In contrasto con gli assoni, si sa molto poco di risposte mielina al danno in tempo reale. La mielina è una componente vitale della materia bianca prodotta e mantenuta da oligodendrociti nelle cellule del sistema nervoso centrale e di Schwann nel PNS. Mielina isola 99% della superficie di assoni e così facendo fornisce una elevata resistenza, bassa capacità rivestimento protettivo che supporta rapida ed efficiente propagazione dell'impulso saltatory, recentemente da Buttermore et al. 26. Per catturare la risposta dinamica di mielina al danno si usa il solvatochromic, lipofilacolorante fluorescente Nile Red 27. Le proprietà solvatochromic di questa macchia vitale permettono spostamenti spettrali del suo spettro di emissione che dipende sull'ambiente fisico-chimica 28,29. Queste proprietà sono utili al fine di conoscere i meccanismi di danno axomyelinic e può essere osservata con dicroici adeguatamente selezionati e filtri di emissione o risolti usando la microscopia spettrale 27. Ad esempio, lo spettro di emissione di Nile Red è blu-spostata in ambienti meno polari, ricchi di lipidi, come quelli trovati in adipociti e normale mielina del SNC (picco di emissione ~ 580-590 nm) 27. Al contrario, i picchi dello spettro di emissione di questo colorante vitale a ~ 625 nm in endbulbs formate da assoni subiscono deperimento assonale 27. Anche se il preciso meccanismo questi spostamenti spettrali specificamente in endbulbs rispetto mielina normale rimangono poco chiari, tali cambiamenti spettrali possono rivelare le alterazioni alla base di accumulo di proteine ​​o la disorganizzazione che porta aesposizione dei idrofobiche siti di legame di 27.

Mentre l'imaging in vivo è la metrica fondamentale per l'osservazione del midollo spinale dinamiche danno assonale nel loro ambiente nativo, è tecnicamente impegnativo e richiede competenza chirurgica notevole, e spesso ripetere ambulatori per esporre la colonna dorsale che può introdurre artefatti sperimentali (ad esempio, l'infiammazione e la cicatrice formazione). Inoltre, le apparecchiature costose è spesso necessario per permettere la sospensione e il posizionamento di un animale intatta sotto la lente obiettivo microscopio. Gli animali devono essere attentamente monitorati e per assicurare che rimangono caldo, al fine di garantire i fluidi sono reintegrati, e per assicurarsi che non ci sono segni di ipossia a causa di sessioni di imaging anestetizzati prolungati. Quest'ultimo è estremamente importante in quanto assoni e mielina assolutamente richiedono perfusione costante e livelli di ossigeno adeguati a rimanere vitale. Tuttavia, questo non è spesso segnalata o monitorato in più studi in vivo perdata. Inoltre, artefatti da movimento a causa della frequenza cardiaca e la respirazione (isoflurano anestetizzati topo adulto: ~ 300-450 battiti al minuto (BPM) è ottimale per mantenere la saturazione di ossigeno 97-98% (tasso normale di ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respiri al minuto (tariffa normale è ~ 163 respiri al minuto), rispettivamente)) 30 incontrato durante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopia a fluorescenza impegnativo come anche le scansioni laser più veloci inevitabilmente sono soggetti a questi movimenti artefatti. I progressi nella ultraveloci scanner di risonanza combinate con un impiantabile vertebrale rigida finestra incorniciate può consentire l'imaging del midollo spinale murino in animali svegli, ma i tempi di scansione più veloce inevitabilmente ridurre il rapporto segnale rumore qualità dell'immagine degradanti. Ulteriori miglioramenti nelle tecniche di imaging del midollo spinale, come attualmente utilizzate per l'imaging cerebrale possono superare molti di questi ostacoli e di limitare le potenziali confonde introdotte dal inaperfusione tissutale dequate, ad esempio, 31-33.

Molto di ciò che si conosce della sostanza bianca fisiologia e meccanismi di danno sostanza bianca è stato determinato utilizzando in vitro o ex vivo preparazioni di sostanza bianca dal nervo ottico, nervo periferico, e le strisce di midollo spinale sostanza bianca 34-41. Queste preparazioni continuano ad avanzare la nostra conoscenza dei meccanismi di lesioni bianche importa quanto consentono cambiamenti di fattori ambientali, controllata di farmaci e reagenti, valutazioni funzionali utilizzando elettrofisiologia, e dirette osservazioni microscopia a fluorescenza di assoni e mielina nel tessuto vivo controllati. Eppure, alcuni approcci precedenti per osservare assoni da midollo spinale strisce colonna dorsale o strisce di sostanza bianca ventrale inevitabilmente ferire assoni superficie durante la fase di rimozione che possono influenzare la risposta degli assoni strettamente opposti. Per capitalizzare le manipolazioni sperimentali di cui sopra e di evitare danni alla vefibre Ry sotto inchiesta, usiamo un modello del midollo spinale cervicale ex vivo in quanto impedisce il contatto diretto della parte dorsale del cavo. Così, l'architettura della pia madre e adiacenti dorsali superficiali assoni colonna rimangono vitali e imperturbato durante l'isolamento.

Qui si descrive un approccio relativamente semplice che permette la visualizzazione diretta di assoni mielinizzati centrali come rispondono dinamicamente a una lesione focale in tempo reale fino a 8 - 10+ ore dopo l'infortunio. La lesione del midollo spinale (Lisci) Modello indotta da laser consente la differenziazione tra i meccanismi di danno assonale primarie e secondarie, come la lesione primaria (sito di ablazione) rimane spazialmente vincolate nel tempo. La camera di imaging open-bagno è accessibile a un intervento terapeutico, la consegna dei reagenti, e manipolazioni ambientali. Agenti protettivi axomyelinic putativi possono essere rapidamente valutati in tempo reale da osservazioni dirette contro gli esperimenti lunghi e costosi che coinvolgono processi tessutoING, sezionamento, immunostaining, l'acquisizione di immagini, e l'analisi e quindi fornisce un modello utile surrogato per valutare le risposte acute e manipolazioni di protezione prima di testare gli agenti sperimentali di animali vivi.

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Protocol

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NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dal comitato Animal Istituzionale Cura e uso presso l'Università di Louisville, in osservanza delle disposizioni federali.

1. Preparazione di Low Ca 2+ e 2 mM Ca 2 + artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) Perfusates

  1. Preparare 2x bassa Ca 2+ (0,1 mM) Stock tampone C, 2x normale Ca 2+ (2 mM) Stock Un buffer, e tampone 2x Archivio B come descritto nella Tabella 1. Le singole soluzioni stock consentono modifica del contenuto di ioni (ad esempio, basso o nullo Ca 2+) e può essere conservato a 4 ° C per un mese.
  2. Per intracardiaca perfusione durante la dissezione, aggiungere 100 ml di 2x basso Ca 2+ della C e 100 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di plastica per rendere basso Ca 2+ 1x aCSF. Mescolare e conservare una notte a 4 ° C o fare fresco.
  3. Per perfusione ex vivo del midollo spinale durante imagING, aggiungere 500 ml di 2x normale Ca 2+ Stock A e 500 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di vetro da 1 L per generare 1x aCSF. Mescolare e conservare notte a temperatura ambiente o fare fresco.
  4. Aggiustare il pH del buffer ACSF a 7,4. Mantenendo la aCSF a temperatura ambiente, collocare il basso Ca 2+ aCSF su ghiaccio e poi bolla entrambi i buffer con gas carbogeno (95% O 2; 5% CO 2) per 30 minuti prima dell'uso e continuamente durante la perfusione.

2. Preparazione di Ex Vivo Imaging Camera

  1. Avvolgere una coperta di riscaldamento (senza spegnimento automatico) intorno alla bottiglia aCSF e regolare la fiamma al minimo l'impostazione / media.
  2. Inserire una linea di perfusione aCSF dedicata nella bottiglia collegata ad una pompa di perfusione e in linea riscaldatore che è controllata da una sonda bipolare regolatore di temperatura e retroazione della temperatura, come mostrato nella Figura 1A.
  3. Fissare un microscopio piatta inserto fase (152 x 102 mm) per la 2-fotoni di eccitazione / confpalco microscopio Ocal dotato di un contenitore di fuoriuscita.
  4. Mettere un grande camera di perfusione open-bagno (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) nel contenitore fuoriuscita di accogliere e fornire un flusso continuo di fresco ossigenato aCSF al midollo spinale ex vivo (vedi Figura 1B per un ex adeguato Vivo l'imaging disegno della camera).
  5. Collegare la porta di uscita del metallo del riscaldatore in linea alla camera di ex vivo di immagini utilizzando tubi adatti. Inserire un tampone assorbente sottile sotto della camera ex vivo imaging per aiutare a mantenere la temperatura del buffer / tessuto durante l'imaging.
  6. Rispettare la camera di ex vivo imaging per il fondo dell'inserto container fuoriuscita / stage con tack appiccicoso rimovibile. La malleabilità del tack appiccicoso consentirà la camera da regolare come necessario per garantire percorso ottico del obiettivo è perpendicolare alla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare un livello Bullseye per regolare la camera.
  7. Fissare unsonda in linea risposte riscaldatore temperatura vicino alla camera di ingresso del fluido e un tubo di aspirazione in acciaio inox collegato ad una linea di vuoto all'uscita della camera. Supporti a nastro magnetico e appropriato micropipetta sono utili in questo senso. Accendere la sorgente di vuoto.
  8. Accendere la pompa di perfusione per iniziare a riempire la camera di imaging con aCSF ossigenato. Impostare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto.
  9. Controllare il volume del aCSF nella camera di imaging regolando la linea del vuoto. È importante che vi sia sufficiente aCSF nella camera di imaging per coprire il segmento del midollo spinale e permettere sufficiente distanza di lavoro tra un obiettivo immersione acqua e la superficie del tessuto. La mielina e gli assoni possono essere negativamente influenzate se il segmento di tessuto non è completamente immerso in fresco ossigenato aCSF porta artefatti per sperimentatore-indotte.
  10. Regolare il regolatore di temperatura del riscaldatore in linea in modo che la temperatura perfusato nella camera di imaging è temperatura ambiente.
<p class = "jove_title"> 3. Dissezione di adulti Murine cervicale del midollo spinale

  1. Euthanize un adulto 6-10 settimane di età Thy1 -YFP topo transgenico (uso ceppo appropriato che ha l'espressione della proteina fluorescente in radice dorsale neuroni gangliari) iniettando una dose eccessiva del pentobarbital sodico anestesia (200 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale.
  2. Una volta sotto il corretto livello di anestesia (per esempio, nessuna reazione a pizzico punta e perdita di riflesso corneale), barba accuratamente la pelle sovrastante il midollo spinale e il cervello con i tagliatori chirurgici. Detergere la pelle con betadine e il 70% pastiglie etanolo.
  3. Spray al torace / addome con il 70% di etanolo, quindi profumato il soggetto transcardiaca utilizzando refrigerata, CarboGen-bolle basso Ca 2+ aCSF. (Vedi Figura 1C per il banco di dissezione suggerito top istituito).
  4. Come il fegato impallidisce, fissare l'ago perfusione nel cuore con un piccolo clip. Girare il soggetto sopra per accedere al lato dorsale rasata diil soggetto e pulire la zona rasata con il 70% di etanolo.
  5. Fare un incisione cutanea dorsale lungo la linea mediana a partire dal naso all'hip con le forbici dissezione per esporre il cervello e la colonna vertebrale (Figura 2A). Fissare la preparazione mettendo perni al naso e anca.
  6. Utilizzando un microscopio di dissezione da questo punto in poi, saldamente tagliare attraverso la superficie dorsale del cranio a livello dei bulbi olfattivi. Inserire una delle punte forbice nei bordi laterali della incisione e taglio lungo i bordi della calotta cranica bilateralmente fino cervelletto.
    NOTA: Non accise completamente la calotta cranica, come è necessario in seguito a sollevare il tessuto sovrastante dal midollo spinale durante la dissezione (Figura 2B).
  7. Sollevare la calotta cranica per esporre il cervello. Tagliare delicatamente i bordi destro e sinistro del midollo interparietale (situato il cervelletto) e tirarlo indietro caudale per esporre il tronco cerebrale / midollo spinale (Figura 2C
  8. Usare le forbici fine punta terranno a un angolo di 45 ° rispetto alla superficie della tavola e tagliare le vertebre bilateralmente appena inferiore alle radici nervose posteriori.
    NOTA: Evitare il contatto con le colonne dorsali bianche luminose. Queste fibre sono quelli che verranno immagine (Figura 2D) e possono essere facilmente danneggiati.
  9. Sollevare la superficie zucchetto e dorsale della colonna vertebrale, con pinza sottile a punta, tirando delicatamente il tessuto sovrastante in un unico pezzo, come i tagli sono fatti per esporre il midollo spinale. Continuare a tagliare vertebre al livello superiore del torace per isolare un segmento 1-2 cm del midollo cervicale per la successiva formazione immagine (figura 2E).
  10. Usare le forbici per tagliare il parallelo di tessuto / ossea alla colonna vertebrale e dei tessuti chiari sotto la colonna. Rendere questi tagli come livello possibile. È molto importante che il tessuto sia piatto nella camera in modo che il cavo sia in piano per l'imaging.
  11. Utilizzare un # 11 bisturi al transetto del tronco cerebrale (oltre ilterminazione delle fibre fasciculus gracili) ea livello toracico superiore per isolare il segmento midollo spinale cervicale (vedere Figura 2F). Usare le forbici per tagliare il tessuto / ossea a questi stessi due punti. Il tessuto isolato dovrebbe contenere i 2/3 della colonna vertebrale, che comprende il tronco cerebrale caudale, l'allargamento cervicale, e del midollo spinale toracico superiore (Figura 2G).
  12. Porre la colonna vertebrale isolato in una scatola Petri di CarboGen-bollito, raffreddato a basso Ca 2+ aCSF. Se necessario, tagliare il tessuto sotto la colonna vertebrale fino a adagiata nel piatto.
  13. Trasferire la colonna vertebrale isolata alla camera di imaging ex vivo e aumentare gradualmente la temperatura perfusato più di 1 ora a 36-37 ° C. Mantenere questa temperatura durante l'imaging.

4. Posizionamento di Ex Vivo midollo spinale in Imaging Camera e mielina Etichettatura con Nile Red

  1. Fissare adeguatamente la colonna vertebrale in iCamera Maging con un appropriato fetta raccordo tenere premuto modificata con una piattaforma griglia verticale costituita da fili sottili Lycra (rimuovere le discussioni centrali della piattaforma di rete per consentire lo spazio per il midollo spinale; vedi Figura 3A).
  2. Scongelare una aliquota di Nile Red (5 stock mM in DMSO e 0,22 micron filtrato; possono essere memorizzate per 1 mese a 4 ° C, o 6 mesi a -20 ° C al buio). Appena prima di aggiungere Nilo Red alla camera di imaging, ridurre la portata della pompa di perfusione e regolare la linea del vuoto per assicurare il fluido nella camera comprende sempre il midollo spinale.
  3. Aggiungere 5-10 ml di soluzione madre Nile Red alla camera di imaging verso la fine caudale del cavo (Figura 3B). Utilizzare una pipetta 1 ml di mescolare delicatamente Nile Red in tutta la camera. Lasciare Nile Red di rimanere in camera per 1-2 minuti, quindi inserire la linea del vuoto indietro e regolare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto di perfusione continuamente il midollo spinale.
  4. Sollevare con cautela palco microscopioe allineare l'obiettivo con il centro del segmento del midollo spinale e medialmente sulle colonne dorsali finché l'obiettivo ad immersione acqua è circa 10 mm dalla superficie del aCSF nella camera. Usate il microscopio volante fuoco revolver per portare lentamente l'obiettivo verso il basso fino a toccare leggermente la superficie del aCSF. Utilizzare una sorgente luminosa epifluorescente concentrare le colonne dorsali nel campo di vista (Figura 3C).

5. Ex Vivo Imaging del cavo del mouse spinale con TPLSM e laser-indotta Spinal Cord Injury (Lisci)

NOTA: La vena posteriore fornisce un marcatore utile per centrare il tessuto come le fibre Fasciculus gracili (provengono dal corpo cellulare dei gangli spinali e salire da T6 e sotto lungo la linea mediana del midollo spinale) in parallelo con questo vaso sanguigno. Le spesse YFP + cervicale proiezioni radici dorsali forniscono anche un indicatore utile come fibre salire e scendere lateralmente alla YFibre FP + Fasciculus gracile che sono più piccoli di diametro.

  1. Una volta che il tessuto del midollo spinale è allineato in modo appropriato, passare alla modalità di scansione laser per eseguire l'imaging di base degli ascendenti fasciculus gracile fibre mieliniche. Per eccitare sia YFP e Nilo Red, utilizzare una sorgente laser a due fotoni sintonizzati a 950 nm (~ 17 mW misurata all'uscita di un 25X, 1.1 obiettivo NA) e dicroici appropriate (DM) e filtri passa-banda per isolare l'emissione fluorescente dei fluorofori (usiamo 525/50 DM560, DM640 600/60, 685/70 e, per separare YFP e Nilo rosso al giallo-arancio, rosso e canali estesi, rispettivamente).
    1. Se più del 3% degli assoni mostrano sferoidi assonali durante l'imaging di base (30-60 min), eliminare la preparazione a causa di artefatti sperimentatore-indotta.
  2. Indurre un Lisci ingrandendo il campo visivo a 30.3X (per creare un diametro ablazione ~ 20 micron). Tune il laser a 800 nm, e aumentare la potenza del laser a ~ 110 mWil campione. Lasciare 5 completo campo delle scansioni vista laser per garantire le fibre sono completamente recisi.
  3. Confermare Lisci modificando le impostazioni laser alle impostazioni di imaging (950 nm, 17 MW a campione, 2.08X) e scansionare il tessuto di visualizzare l'ablazione. Verificare il diametro dell'ablazione e che gli assoni ablazione primari sono completamente sezionato (vedere Figura 3D). Utilizzare le impostazioni di time-lapse sul microscopio combinato con z cattura per registrare la risposta dinamica di assoni e mielina per infortunio fino a 8-10 + hr dopo l'infortunio.
    NOTA: Se l'ablazione è incompleta (cioè, transection incompleta di fibre), scartare la preparazione, la determinazione dei meccanismi di lesioni primarie e secondarie saranno confusi. Inoltre, isolati segmenti del midollo spinale possono essere esposte fino a 24 ore post-Lisci con solo lieve a moderata danno tissutale Lisci-indipendente.

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Representative Results

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Dettagli di un laboratorio appropriata stabilita necessarie per isolare, mantenere la vitalità, e l'immagine del midollo spinale ex vivo è mostrato in Figura 1. Il microscopio deve essere dotato di un laser pulsato a femtosecondi accordabile, dicroics appropriati e filtri di emissione, e acqua immersione lente obiettivo con un elevato apertura numerica (≥1.0). Per garantire la redditività del midollo spinale durante la dissezione, la procedura deve essere eseguita in presenza di refrigerate ossigenato partire Ca 2+ aCSF che permette abbastanza Ca 2+ per le membrane isolate assonale per sigillare 42. In caso contrario, può causare danni axomyelinic compresa la separazione della mielina dal axolemma e formazione sferoidale assonale ben visibile durante l'imaging di base. Immagini rappresentative del processo di dissezione e l'isolamento del midollo spinale ex vivo è illustrato nella figura 2. Isolamento seguendo la redditività del midollo spinale è maintained mediante perfusione continua di aCSF ossigenato che è tenuto a 36-37 ° C. La macchia mielina Nilo Red 27,43 può essere aggiunto alla camera di perfusione, e registrazioni di base del fasciculus gracile assoni mielinizzati può iniziare (Figura 3).

Immagini rappresentative della Fasciculus mieliniche assoni gracili sono mostrati in figura 4. In condizioni basali registrazioni timelapse TPLSM rivelano YFP + assoni paralleli allineati ensheathed in mielina (Nilo rosso) con diametri sostanzialmente costanti lungo la lunghezza della assone. Pochi sferoidi assonali o altri segni morfologici di degenerazione assonale sono presenti. Grazie alle proprietà solvatochromic di Nile Red e il contenuto di lipidi e di proteine ​​della mielina, la mielina è macchiato di colore giallo-arancio, mentre file di corpi cellulari oligodendrociti putativo appaiono arancione scuro (Figura 4A). Dettagli raffinati, come i nodi di Ranvier possono essere risolti (ad esempio, frecce

A 10 min dopo Lisci, assoni immediatamente sezionati (lesione primaria) situati rostrale e caudale al sito ablazione cominciano a rientrare dal luogo di ferita e formare bobine sigmoidale-come all'interno gonfio mongolfiera mielina. Mielina ensheathing assoni remoto al ablazione apparire invariata a questo punto di tempo. Con 40 min post-Lisci assoni sezionati più elementari e assoni sottoposti degenerazione secondaria (inizialmente risparmiato dalla insulto ma degenerato dopo) formano endbulbs caratteristici come ritrarre dal sito della lesione (Figura 4B). Circa un terzo di questi assoni sezionati subiscono pan-frammentazione dove il segmento prossimale primi gonfia, costituisce sferoidi assonali, e alla fine transetti l'assone in diverse lunghezze irregolari di assoni 43. Separazione della mielina da assoni (peri-assonale gonfiore) e la degenerazione della mielina vescicolare è anche evidente. Nel corso del tempo, tran primaria e secondariaassoni sected continuano ritraendo dal sito della lesione, assoni immediatamente fiancheggiano il sito di ablazione subiscono la degenerazione secondaria, e gonfiore peri-assonale diventa più prominente così come mielina gonfiore e degenerazione vescicolare (Figura 4D-G, puoi anche 43). Una chiara differenza nel grado di retrazione assonale diventa evidente tra monconi prossimali assonale (caudale di lesione) e loro segmenti distali (rostrale di lesione) che sono destinati a subire una degenerazione walleriana (Figura 4D-G). Gli assoni inizialmente risparmiato dalla Lisci subire degenerazione secondaria ritardato (Figura 4H). Un esperimento rappresentativo di controllo senza Lisci, suggerisce che le sessioni di imaging lunghe (fino a 13 ore dopo l'isolamento del cavo in questo esempio) sono possibili senza causare effetti negativi per l'integrità della sostanza bianca (Figura 4I, J).

Rappresentante-high resoimmagini Lution di cambiamenti axomyelinic dopo Lisci sono mostrati in figura 5.

Con 3 ore dopo Lisci, diversi (caudale) assoni prossimali sono ritirato dal sito della lesione dove rimangono all'interno di tubi di mielina gonfie che sono separati dalla assone. Altri endbulbs assonale sembrano essere ricoperto da mielina (Figura 5A). Gli assoni adiacenti al sito ablazione subiscono una degenerazione secondaria, mentre altri sembrano inalterati. YFP vescicole bassi / negative putativi (blu chiaro) all'interno del assone e endbulbs assonale sono presenti anche. In contrasto con caudale ritraendo fibre, la maggior parte dei rostralmente a scomparsa endbulbs assonale e sferoidi a 3 ore post-Lisci sono fortemente etichettati con Nile Red (meno blu spostato) indicativo di un cambiamento ambientale entro l'assone (Figura 5B). Nile Red-etichettato aree all'interno degli assoni a scomparsa attivamente sembrano circondare principalmente o tappare il nucleo assonale. Anche se la posizione precisa e identity di questi intra-assonale strutture Nile Red-marcati sono attualmente sconosciute, possono rappresentare accumulo vescicole denso attraverso il trasporto assonale e / o proteine ​​spaccati di esporre il loro core idrofobico 27. Nile Red mielina etichettato rimane prevalentemente giallo-arancio in normale mielina apparire. In distinzione, Nile Red sondato mielina vescicolare appare giallo (cioè blu spostato) indicativi dei cambiamenti ambientali all'interno di queste strutture. Con 7 ore dopo assoni Lisci continuano ritraendo dal sito della lesione; Tuttavia, questo è più evidente in rostrale (Figura 5D) rispetto caudale (Figura 5C) endbulbs. Altri assoni subiscono disgregazione totale o parziale lasciando un tubo di mielina vuoto o un gambo sottile alcuni micron dal segmento degenerazione. Applicazione ritardata di Nile Red dopo Lisci rivela etichettatura assonale simile come pre-applicazione di Nile Red suggestive che l'ablazione di per sé e potenziali effetti termici su denaturazione delle proteine ​​èimprobabile responsabile dei turni Nile Red spettrali di mielina e assoni dopo la lesione (Figura 5E, F).

Collettivamente, questi dati dimostrano l'utilità del modello ex vivo Lisci per imitare i meccanismi ben noti, ma poco conosciute di lesioni acute axomyelinic in tempo reale. Il modello può quindi essere utile per approfondire la nostra conoscenza della fisiopatologia di lesioni della sostanza bianca, e scoprire bersagli molecolari fondamentali per preservare l'integrità della sostanza bianca.

Figura 1
Figura 1: Panoramica del setup dissezione e di imaging. (A) A suggerito set-up per ex vivo l'imaging del midollo spinale. Il principale attrezzatura necessaria comprende un CarboGen (95% O 2/5% di CO 2) la linea del gas di ossigenare il aCSF, una pompa di perfusione di consegnare il CarboGen-bubdissanguati aCSF attraverso un dispositivo in linea regolatore riscaldamento / temperatura dotato di una sonda di temperatura risposte, e un open-bagno camera di imaging progettato dotato di una sorgente di vuoto. (B) viene mostrato una maggiore ingrandimento della camera vasca imaging. (C) A suggerito set-up per la perfusione e la dissezione del midollo spinale ex vivo. Chilled basso Ca 2+ aCSF è ossigenato con CarboGen e utilizzato per mantenere la vitalità del midollo spinale durante la dissezione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2:. Isolamento del midollo spinale per l'imaging (A) In continuo refrigerati, ossigenato basso Ca 2+ perfusione la skullcap è esposto. (B) L'incisione viene effettuata attraverso la superficie dorsale del cranio a livello dei bulbi olfattivi (linea tratteggiata). (C) incisioni bilaterali vengono effettuate tramite i bordi laterali della calotta cranica finché può essere delicatamente sollevato e tirato caudalmente (nella direzione della freccia) per esporre il tronco cerebrale. (D) Continuare incisioni bilaterali con le forbici a punta sottili per tagliare gli aspetti laterali delle vertebre e esporre le colonne dorsali (punta di freccia). (E) L'esposto sono mostrati tronco cerebrale e tutta l'allargamento cervicale al segmento toracico superiore del midollo spinale. (F) Due incisioni con un numero di blade 11-bisturi sono fatti per isolare il midollo spinale al tronco encefalico, al di là delle gracili terminazioni fasciculus assonale e livello toracico superiore ( linee tratteggiate). (G) L'isolato midollo spinale è poi trasferito a una piastra di Petri contenente refrigerata bassa Ca 2+ aCSF bolliti congas di CarboGen. Radici dorsali cervicale (ad esempio, punte di freccia), gangli spinali e il midollo spinale dal segmento toracico superiore al tronco encefalico (~ 15-20 mm) sono lasciate intatte. Bar Scala in G:. 2 millimetri Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Imaging midollo spinale ex vivo (A) Una volta posizionato nella camera, il tessuto del midollo spinale è fissato utilizzando una versione modificata del tessuto / fetta tenere premuto dotato di fili Lycra (B) La macchia mielina Nile Red è aggiunto direttamente. la camera di imaging. (C) Un obiettivo immersione in acqua è immerso nel aCSF e posizionato sopra le fibre fasciculus gracili. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Lisci modello di danno assonale mielinizzati centrale TPLSM è stato utilizzato per catturare le dinamiche di assoni e mielina risposte seguenti Lisci (*). Immagini rappresentative vengono visualizzate come proiezioni di massima intensità di cinque 1 micron sezioni ottiche spesse catturato a 0,24 micron / pixel con un microscopio + multifotone / confocale Nikon A1RMP dotato di 25X; NA: 1.1; WD: 2 mm obiettivo immersione in acqua. Dicroici e filtri di emissione standard sono stati utilizzati per separare YFP + assoni (525/50 DM560, mostrate in blu) e il colorante fluorescente lipofila solvatochromic Nile REd in più corta (600/60 DM640, mostrato in verde) e più a lungo (685/70 nm, mostrato in rosso) i canali di emissione. Le due combinazioni di filtri ultimi sono vantaggiosi in quanto catturano noti spostamenti spettrali del Nilo rosse in diversi ambienti fisico-chimiche. (A) in condizioni basali assoni (YFP +, blu) e mielina (NR, giallo-arancio) appaiono normalmente orientato con poche sferoidi o altri segni di lesioni axomyelinic. Righe di glia con morfologia caratteristica di oligodendrociti sostanza bianca (NR, arancio scuro, ad esempio punte di freccia) sono visibili anche (un po 'segnato per chiarezza), e le strutture pregiati come nodi di Ranvier sono risolti (ad esempio, le frecce). (B) A 10 min dopo Lisci, assoni sezionati situati rostrale e caudale alla lesione cominciare a rientrare dal luogo di ferita e formare bobine sigmoidali-like (frecce) all'interno di mielina gonfio. Mielina ensheathing assoni distanza dalla ablazione appare invariato a questo punto di tempo. (C) Bassoni y 40 min post-Lisci più elementari sezionati e assoni sottoposti forma degenerazione secondaria endbulbs caratteristici come ritrarre dal sito della lesione (punte di freccia). Alcuni assoni sezionati formano anche sferoidi lungo la lunghezza delle loro assoni (frecce). Separazione della mielina dalla assone (peri-assonale gonfiore) e la degenerazione della mielina vescicolare è anche evidente (+). (DG). Nel corso del tempo, gli assoni feriti primarie e secondarie continuano ritraendo dal sito della lesione, e come mostrato dalle proiezioni YZ del Lisci, assoni inizialmente risparmiati fiancheggiano il sito di ablazione subiscono ritardi degenerazione secondaria (H, pannello a sinistra prima di Lisci, pannello centrale 10 minuti post-Lisci, e proprio pannello di 7 ore dopo Lisci; puntini bianchi segnano l'iniziale Lisci, puntini rossi indicano la perdita di assoni di 10 minuti e punti verdi indicano l'entità del ritardo degenerazione secondaria di assoni da 7 ore). Gonfiore Peri-assonale diventa più prominente in successivi momenti post-Lisci. L'estensione of retrazione assonale e la morfologia di endbulbs assonale tra ceppi assoni prossimali e loro segmenti distali diventa anche evidente (vedi anche la Figura 5 per le immagini ingrandimento superiori). Scala bar:. 50 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Immagini rappresentative ad alta risoluzione dei cambiamenti axomyelinic dopo Lisci TPLSM è stato utilizzato per catturare intricato dettaglio di assoni e mielina cambia caudale (A, C) e rostrale (B, D) per infortunio alle 3 ore (A, B) e 7 hr (C, D) a seguito lisci. Immagini rappresentative vengono visualizzate come proiezioni di massima intensità di tre 1 micron sezioni ottiche di spessorecatturato a 0,0832 micron / pixel con una Nikon A1RMP + multiphoton / microscopio confocale. (A) Caudal al Lisci (*), molti assoni (blu) sono a scomparsa dal sito della lesione (grandi punte di freccia) all'interno di tubi di mielina gonfie (giallo-arancio ) che sono separati dal endbulb assonale. Alcuni assoni adiacenti al sito ablazione subiscono la degenerazione secondaria (piccole punte di freccia), mentre altri sembrano inalterati. YFP vescicole bassi / negative putativi (pallido blu) nel assone e endbulbs assonale sono presenti (frecce). Un nodo centrale di Ranvier (n) è anche ben visibile con questa tecnica di imaging e l'etichettatura. (B) In contrasto con caudale retrazione delle fibre, la maggior parte dei rostralmente a scomparsa endbulbs assonale e sferoidi a 3 ore post-Lisci sono fortemente marcato con Nile Red (rosa). Aree Nile Red-etichettati nella assoni a scomparsa sembrano circondare principalmente o berretto YFP assoni etichettati (blu, grandi punte di freccia). Anche se la natura di questi Nile Red-labelstrutture ED è attualmente sconosciuta, possono rappresentare accumulo vescicole denso attraverso il trasporto assonale e / o proteine ​​spaccati di esporre il loro core idrofobico. In distinzione, Nile Red etichettato mielina vescicolare (frecce) appare giallo (cioè spettro è spostato blu) rispetto al normale mielina (giallo-arancio), indicativi dei cambiamenti ambientali putativi all'interno dell'ex. Gonfiore Peri-assonale è anche evidente (piccole punte di freccia). A 7 ore dopo Lisci, assoni continuano ritraendo dal sito della lesione; Tuttavia, questo è più evidente nel rostrale (D) rispetto caudale (C) endbulbs. Alcuni assoni subiscono disgregazione totale o parziale lasciando un tubo vuoto mielina (freccia in C) o un gambo sottile alcuni micron dal segmento degenerazione (piccole frecce in D), rispettivamente. Applicazione ritardata di Nile Red produce spostamenti spettrali simili in caudale rispetto rostrali assoni mielinizzati centrali (E e F (C, D). Scala bar:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2x Stock A (2 mM Ca 2+) Reagente mM
NaCl 252
KCl 6
CaCl 2 • 2H 2 O 4
2x della B NaH 2 PO 4 2.5
MgSO4 4
NaHCO 3 52
Destrosio (D-glucosio) 20
2x basso Ca 2+ della C (0.1 mM Ca 2+) NaCl 252
KCl 6
MgCl • 6H 2 O 3.8
CaCl 2 • 2H 2 O 0.2

Tabella 1: fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) buffer.

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

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References

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Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).More

Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

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