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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

부상 CNS의 축삭 재생과 자주 떨어져 부상 사이트에서 철회하지 못한다. 초기 부상을 아끼지 축삭 나중에 차 축삭 변성을 거칠 수있다. 척수 내에서 성장 콘 형성, 재생 및 추가 유수 축삭 돌기의 손실의 부족은 크게 손상 후 신경 학적 회복을 제한합니다. 척수의 유수 축삭 부상에 어떻게 반응하는지 중앙 평가하기 위해, 우리의 운명을 문서화하는 노란색 형광 축삭의 단백질과 초점과 재현성이 높은 레이저에 의한 척수 손상을 표현 형질 전환 마우스를 이용한 척수 모델을 살고 생체 개발 두 광자 여기 시간 경과 현미경을 사용하여 축삭과 시간에 수초 (친 유성 형광 염료 나일 레드). 급성 축삭 손상, 축삭 철회하고, 수초 변성 등의 동적 프로세스는 최고의 실시간으로 연구한다. 그러나, 타박상 기반의 부상과 운동 유물의 비 초점 자연 발생고해상도 현미경 도전하여 기본 및 보조 축삭 손상의 반응을 차별화 생체 척수 영상 메이크업 중. 여기에 설명 된 생체 척수 모델은 축삭 부종, 회전 타원체 형성, 축삭 절개, 실시간으로 이러한 역동적 인 과정을 연구하는 유용한 모델을 제공 붓기 근교의 축삭을 포함하여 임상 적으로 관련된 타박상 / 압축에 의한 축삭 병리의 여러 측면을 모방. 이 모델의 주요 장점은 직접 축삭 및 보조 부상 메커니즘을 상해를당한 차 모욕를 구별 할 수 있습니다 우수한 시공간 해상도입니다; 직접 관류 목욕 코드에 시약의 제어 주입; 환경 환경의 정확한 변경 (예를 들어, 칼슘, 나트륨 이온, 축삭 손상에, 거의 불가능에 가까운 영향을 미치는 것으로는 생체 내에서 조작 할 수있는); 그들이 시각화 할 수있는 기회를 제공하고 뮤린 모델로도 이점을 제공하며유전 학적으로 확인 된 세포 집단과 세포 내 구조를 조작 할 수 있습니다. 여기, 우리는 분리하고 이미지가 마우스의 생활 척수 급성 축삭 손상의 역학을 캡처하는 방법에 대해 설명합니다.

Introduction

축삭의 변성은 신경 외상, 뇌졸중,자가 면역 및 신경 퇴행성 질환 등 여러 가지 신경 학적 조건에 걸친 사망률의 저명한 원인이다. 말초 신경계 (PNS), 중추 신경계와는 달리 (CNS) 축색 돌기는 한 번으로 인해 본질과 비 본질 장벽 (즉, 수초 변성 동안 흉터 형성 동안 생산과 해방 축삭의 성장을 억제 분자) (1) 모두에 부상을 재생하는 제한된 능력을 가지고 -7. 이러한 장벽의 여러 가지가 광범위하게 탐구되었지만, 목표로 치료 개입, CNS 축삭 변성을 방지 강력한 축삭 재생을 촉진하고, 기능 접속 식을 복원, 제한 상태로 유지됩니다.

한 번 자신의 소마 분리 축삭 축삭 부종, 회전 타원체의 형성과 (8 검토) 최종 조각이 특징입니다 Wallerian 변성로 알려진 변성에 박힌 과정을 겪는다. 에반면, 가로로 주변 축삭의 소마와 연속성을 유지 근위 루터 이후의 축삭 재생을위한 중요한 전제 조건이 필요, 그 말에 부종을 형성 다시 Ranvier의 가장 가까운 노드에 사망하고 성장 콘 형성을 시작할 수 있습니다 9-11. 반면에, 많은 중앙 축삭의 근위 축삭 엔딩, 특성 "endbulbs"또는 후퇴 전구를 형성 성장 콘을 형성하고, 대신 거리가 부상 12-15 후 몇 개월 동안 남아있는 부상 사이트에서 철회하지 못한다. 기본 축삭 손상뿐만 아니라, 추가 축삭 손상 / 손실은 크게 초기 부상에서 겪었던 축삭 발생할 수 있습니다. 처음 아끼지 축삭이 지연 축삭 손실은 보조 축삭 변성이라고한다. 부상 CNS 축삭이 고유 응답 기능 축삭 재생을 뇌와 척수에 달성하기 위해 훨씬 더 어려운 목표를 렌더링합니다.

하,하지만축삭 손상 (예를 들어, 회전 타원체 형성, 후퇴 전구)의 llmarks 잘 사후 조직 및 축삭 변성의 실험 모델에서 특성화되었다, 이러한 동적 프로세스를 기본 분자 메커니즘의 해명이 ​​제한되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 본질적으로 시간이 지남에 따라 개별 축삭 반응을 포착하는 데 실패 정적 엔드 포인트 관찰에 의존했다. 비록 외생 축삭 추적자 정적 섹션에서 라이브 영상 중 축삭 반응을 규명하는 데 유용왔다 적용, 유전자 인코딩 된 축삭 마커의 가용성은 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 축삭을 시각화하는 능력을 크게 향상했다. 실제로, Kerschensteiner 및 동료 정액 보고서는 먼저 척추의 등 열에서 자신의 전망을 보내 뉴런의 부분 집합에 녹색 형광 단백질을 인코딩 Thy1 -GFP-S 마우스를 사용하여 생체 내에서 축삭 변성 및 재생의 직접적인 증거를 제공코드 (16). 라이브 영상은 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)를 사용하여 접근과 관심의 세포의 유전자 형광 단백질 표지는 축삭 변성, 칼슘 신호, 축삭 재생, 성상 세포 생리학 많은 다양한 동적 프로세스에 직접 증거와 기계적인 통찰력을 제공하고 미세 아교 세포 생리학, 부상 17 ~ 25에 대한 응답.

축삭 대조적으로, 거의 실시간으로 부상 미엘린 응답의 공지되어있다. 미엘린은 PNS에서 CNS와 슈반 세포에서 희소 돌기 아교 세포에 의해 생산 및 유지 백질의 중요한 구성 요소입니다. 수초는 축삭의 표면의 99 %을 절연하고 그렇게함으로써 최근 Buttermore 등. (26)에 의해 검토 신속하고 효율적으로 도약적인 충동 전달을 지원하는 고 저항, 낮은 커패시턴스 보호 커버를 제공한다. 우리가 solvatochromic, 친 유성을 사용하여 부상 수초의 동적 응답을 캡처하려면형광 염료 나일 레드 (27). 이 중요한 얼룩의 solvatochromic 속성은 물리 화학적 환경 (28, 29)에 따라 자사의 발광 스펙트럼의 스펙트럼 변화를 할 수 있습니다. 이러한 속성은 axomyelinic 부상의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 유용하고 적절하게 선택 dichroics 및 배출 필터를 사용하여 시각 또는 스펙트럼 현미경 (27)를 사용하여 해결할 수 있습니다. 예를 들면, 나일 레드의 발광 스펙트럼은 청색 시프트 등의 지방 세포 및 CNS의 정상 미엘린 (발광 피크 ~ 580-590 ㎚) (27)에있는 것과 같이 덜 극성 지질이 풍부한 환경에서이다. 반면에, ~ 625 nm의 축색 돌기로 형성 endbulbs의에서이 중요한 염료의 발광 스펙트럼의 피크는 축삭 dieback (27)를 받아야. 보통 수초 대 endbulbs에 특별히 이러한 스펙트럼 변화의 기초가되는 정확한 메커니즘은 불분명하지만, 이러한 스펙트럼 변화는 단백질의 축적 또는 해체로 이어지는에서 기본 변경을 표시 할 수있다소수성 결합 부위 (27)의 노출.

생체 내 이미징 자신의 네이티브 환경에서 척수 축삭 손상 역학을 관찰 궁극적 인 메트릭이 있지만, 기술적으로 도전하고 실질적인 수술 전문 지식을 필요로하고, 자주 (예를 들어, 염증과 흉터를 실험 유물을 소개 할 수있다 등의 열을 노출하는 수술을 반복 형성). 또한, 고가의 장비는 종종 현미경 대물 렌즈 아래 그대로 동​​물의 현탁액 및 위치를 허용하도록 요구된다. 동물은 신중하게 체액이 보충되어 있는지 확인하고, 때문에 장시간 마취 이미징 세션에 저산소증의 징후가 없는지 확인하기 위해, 따뜻한 유지하기 위해뿐만 아니라 모니터링 할 필요가있다. 축삭과 수초가 절대적으로 생존을 유지하기 위해 지속적인 관류하고 적절한 산소 수준을 필요로 후자는 매우 중요하다. 그러나이 종종보고 또는 생체 내 연구에서 대부분의 모니터되지 않습니다날짜. 또한 인한 심박수 및 호흡 운동 아티팩트 (이소 플루 란 성인 마우스를 마취 ~ 분당 300-450 비트 (BPM)을 97~98% 산​​소 포화도 (정상 속도 ~ 632 BPM) 및 유지에 적합하다 ~ 55-65 호흡 분 당 불가피하게 이러한 움직임 될 수 있습니다 각각)) (30)는 심지어 가장 빠른 레이저 스캔에 도전 고해상도 형광 현미경을 사용하여 기본 및 보조 축삭 손상의 반응을 차별화 생체 척수 영상 메이크업 중 발생 (정상 속도는 ~ 163 분당 호흡이다) 유물. 웨이크 동물 뮤린 척수의 이미징을 허용 할 수 척추 이식 강성 프레임 윈도우와 결합 공진 초고속 스캐너 진보하지만, 빠른 스캔 시간은 필연적 잡음비 저하 화상 신호 품질을 감소시킨다. 현재와​​ 같은 뇌 영상에 사용되는 척수 이미징 기술의 추가 개선이 많은 장애물을 극복하고 INA에 의해 도입 된 잠재적 인 혼동을 제한 할 수있다dequate 조직 관류, 예를 들어, 31 ~ 33.

백질 생리학과 백질 손상의 메커니즘에 대해 알려진의 대부분은 시험관 또는 시신경, 말초 신경, 척수 백질 34-41의 스트립에서 흰색 물질의 체외 준비에 사용하여 결정되었습니다. 이 환경 요인의 변화, 조직 생활에서 약물 및 시약의 제어 응용, 전기 생리학을 사용하여 기능성 평가 및 축삭의 직접 형광 현미경 관찰과 수초를 제어 허용 이러한 준비는 백질 손상 메커니즘에 대한 지식을 사전에 계속. 그러나, 일부 이전 방식은 불가피 밀접하게 반대 축삭의 응답에 영향을 미칠 수 제거 단계에서 표면 축삭 손상 척수 등의 열 스트립 또는 복부 백질 스트립에서 축색 돌기를 관찰한다. 위의 실험 조작에 투자하고는했습니다의 손상을 방지하려면이 코드의 등 측면의 직접 접촉을 방지로 조사중인 공예 섬유, 우리는 생체 자궁 경부 척추 모델을 사용하고 있습니다. 따라서, 피아 교인 인접 표면 등의 열 축색 돌기의 구조는 분리시 실행 가능하고 교란 남아있다.

손상 후 10 + 시간 - 여기에서 우리는 동적으로 최대 8 실시간으로 초점 부상으로 응답으로 중앙 유수 축삭의 직접 시각화 할 수있는 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 레이저에 의한 척수 손상 (LiSCI) 모델은 공간적으로 시간이 지남에 제약이 남아 기본 병변 (절제 사이트)와 같은 기본 및 보조 축삭 손상 메커니즘 사이의 차별화를 할 수 있습니다. 오픈 목욕 영상 챔버는 치료 적 개입, 시약 전달, 환경 조작에 액세스 할 수 있습니다. 추정 axomyelinic 보호제 빠르게 조직 프로세스와 관련된 비용과 시간이 소요 실험 대 직접 관찰하여 실시간으로 평가 될 수있다ING 따라서, 면역 염색, 화상 캡쳐 및 분석하여 절편과 살아있는 동물 실험에서 에이전트를 테스트하기 전에 급성 반응과 보호 조작을 평가하는 유용한 대리 모델을 제공한다.

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Protocol

참고 : 모든 동물 절차가 연방 규정을 준수, 루이스 빌 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회가 설정 한 지침에 따라 수행 하였다.

낮은 칼슘 2 + 2 mM의 칼슘 인공 뇌척수액 (ACSF) 1. 준비 관류

  1. 표 1에 기재된 바와 같이 2 배 낮은 칼슘 (0.1 mM)을 스톡 C 완충액 배 정상 칼슘 (2 mM)을 스톡 완충액 및 2 × B 버퍼를 준비한다. 개개의 스톡 솔루션 이온 함량의 수정을 허용 (예를 들어, 낮거나 제로 칼슘) 1 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 해부 동안 심장 내 관류를 들어, 1 배 낮은 칼슘 2 + ACSF를 만들기 위해 플라스틱 병에 2 배 낮은 칼슘 2 + 주식 C 100 ㎖와 2 × B 100 ㎖를 추가합니다. 혼합하고 4 ℃에서 하룻밤 저장하거나 신선한합니다.
  3. IMAG 동안 생체 척수의 관류ING는 1X ACSF를 생성하도록 한 L 유리 병에 배 정상 칼슘 스톡 500 ㎖의 2 × 500 B를 가하여. 혼합하고 실온에서 밤새 저장하거나 신선한합니다.
  4. 7.4 ACSF 버퍼의 산도를 조정합니다. 실온에서 ACSF 유지하면서, 얼음에 저 칼슘 ACSF을 배치하고 버블 carbogen 가스와 양쪽 모두의 버퍼 (95 % O 2, 5 % CO 2) 30 분 동안 종래는 관류 동안 연속적으로 사용하는.

예 생체 이미징 회의소 2. 준비

  1. ACSF 병 주위에 가열 담요합니다 (자동 차단 해제)을 감싸 저 / ​​중간 설정에 열을 조정합니다.
  2. 도 1a에 도시 된 바와 같이 바이폴라 온도 제어기 및 피드백 온도 프로브에 의해 제어되어 히터 관류 펌프와 인라인 접속 병에 전용 ACSF 관류 라인을 삽입한다.
  3. 2 광자 여기 / conf의 평평한 현미경 단계 삽입 (152 X 102mm)를 연결합니다개 지역 현미경 스테이지는 유출 용기 장착.
  4. 대형 오픈 목욕 관류 실을 배치 (가로 x L x 높이 12 X 24 X 8mm) 유출 용기에 (적절한 예는 그림 1B를 참조 수용하고 생체 척수에 신선한 산소 ACSF의 지속적인 흐름을 제공하는 ) 챔버 디자인을 생체 내 영상화.
  5. 적절한 배관을 사용하는 생체 촬상 챔버 인라인 히터 금속의 출력 포트를 연결한다. 영상 중에 버퍼 / 조직의 온도를 유지하는 데 도움이 생체 영상 실 아래에 얇은 흡수 패드를 놓습니다.
  6. 이동식 스티커 압정을 이용 스필 컨테이너 / 스테이지 인서트의 바닥에 생체 촬상 챔버 접착. 점착성의 끈적 순응성 대물의 광로가 조직 표면에 수직 있도록 필요한 챔버가 조절 될 수 있도록한다. 필요한 경우, 챔버를 조정하는 불스 아이 레벨을 사용한다.
  7. 보안챔버 유체 흡입구 근처 인라인 히터 피드백 온도 프로브 및 챔버의 진공 출구 라인에 연결된 스테인리스 흡입관. 자기 테이프와 적절한 마이크로 피펫 홀더는이 점에서 유용하다. 진공 원을 켭니다.
  8. 산소 ACSF과 영상 실을 작성 시작 관류 펌프를 켭니다. 분 당 1.5 ml의에 관류 펌프를 설정합니다.
  9. 진공 라인을 조정함으로써 촬상 ACSF 챔버의 체적을 제어한다. 이것은 척수 세그먼트를 커버하고 물 찍기 대물과 조직 표면 사이에 충분한 거리를 작동 할 수 있도록 결상 ACSF 챔버 내에 충분히 존재하는 것이 중요하다. 조직 세그먼트가 완전히하는 실험에 의한 아티팩트를 선도하는 신선한 산소 ACSF에 잠겨 있지 않은 경우 수초 및 축삭 해로운 영향을받을 수 있습니다.
  10. 촬상하는 관류 챔버 내의 온도가 상온이되도록 인라인 히터 온도 컨트롤러를 조정.
<P 클래스 = "jove_title"> 3. 성인 설치류 경부 척수의 해부

  1. 복강 내 주사를 통해 마취 펜 토바 비탈 나트륨 (200 ㎎ / ㎏)의 과다 복용을 주입하여 성인 6~10주 된 thy1 -YFP 형질 전환 마우스 (신경절 (dorsal root ganglion)의 신경 세포에 형광 단백질 발현가 사용 적절한 변형)를 안락사.
  2. 일단 마취의 적절한 수준 (예를 들어, 발가락 핀치와 깜빡임의 손실에 더 반응), 신중하게 수술 가위와 척수와 뇌를 덮는 피부를 면도하지 미만. 베타 딘 및 70 % 에탄올을 사용하여 패드 피부를 정화.
  3. 70 % 에탄올로 가슴 / 복부 영역을 스프레이 한 후 냉장, carbogen - 버블 낮은 칼슘을 사용하여로 transcardially 주제를 관류 2+ ACSF을. (그림 1C 제안 해부 벤치 위에 설정).
  4. 간이 다지기 같이 작은 클립을 사용하여 심장 내로 관류 바늘을 고정. 의 면도 등쪽에 액세스 할 주제를 뒤집어제목과는 70 % 에탄올로 면도 영역을 닦습니다.
  5. 뇌와 척주 (그림 2A)를 노출 해부 가위를 사용하여 엉덩이에 코에서 시작하여 중간 선을 따라 등의 피부 절개를합니다. 코와 엉덩이에 핀을 배치하여 준비를 고정합니다.
  6. 이 지점에서 해부 현미경을 사용하여 단단히 후각 전구의 수준에서 두개골의 등쪽 표면을 가로 질러. 절개의 측면 가장자리에 가위 팁 중 하나를 삽입하고 양측 소뇌까지 skullcap의 가장자리를 따라 잘라.
    참고 :이 해부를 통해 척수에서 상부 조직을 들어 나중에 필요할 때 완전히 skullcap을 절제하지 마십시오 (그림 2B 참조).
  7. 뇌를 노출 skullcap를 들어 올립니다. 조심스럽게 (소뇌에 있음) interparietal 뼈의 좌우 가장자리를 잘라 (뇌간 / 척수를 노출 꼬리 쪽 다시 그림 2C를 당겨
  8. 테이블 표면에 45도 각도에서 개최 뾰족한 가위를 사용하고 후방 신경근에 좌우 단지 열등 척추를 잘라.
    주 : 밝은 흰색 등의 컬럼과의 접촉을 피하십시오. 이 섬유는 (그림 2D) 이미지를 만들 쉽게 손상 될 수있는 것들이다.
  9. 인하 척수를 노출 만들어 짐에 따라 부드럽게 한 조각 위에 놓인 조직을 당겨, 뾰족한 집게와 척주의 skullcap과 등의 표면을 들어 올립니다. 이후 영상 (그림 2E)의 자궁 코드의 1-2 CM 구간을 분리 상부 흉부 수준으로 척추 절단 계속합니다.
  10. 열 아래에있는 척추와 맑은 조직에 조직 / 뼈 평행하게 절단 가위를 사용합니다. 가능한 수준으로 이러한 상처를 확인합니다. 그것은 코드가 영상에 대한 수준이되도록 조직 챔버에 평평하게하는 것이 매우 중요합니다.
  11. 과거 (뇌 줄기를 가로로 쪼개다하기 # 11 메스를 사용하여날씬한 다발 섬유)과 자궁 경부 척수 세그먼트를 분리하는 상부 흉부 수준에서 종료 () 그림 2 층을 참조하십시오. 이 같은 두 지점에서 조직 / 뼈를 잘라 가위를 사용합니다. 분리 된 조직은 꼬리 뇌간, 자궁 경부 확대, 상부 흉부 척수 (그림 2G)를 포괄하는 척추의 2/3이 포함되어야합니다.
  12. carbogen 버블 링, 냉장 낮은 칼슘의 페트리 접시 2+ ACSF에 고립 된 척추를 놓습니다. 필요한 경우는 접시에 평평해질 때까지, 척추 아래에있는 조직을 잘라.
  13. 생체 촬상 챔버 격리 척주 옮기고 36 서서히 1 시간에 걸쳐 온도를 증가 관류 - 37 ° C. 이미징 동안이 온도를 유지한다.

나일 레드와 이미징 회의소 미엘린 라벨에 생체 외 척수 4. 배치

  1. 조심스럽게 난에 척추를 고정적절한 피팅 슬라이스 maging 실이 아래로 잘 라이크라 스레드로 구성된 수직 그리드 플랫폼을 수정 개최 (;도 3a를 참조 척수를위한 공간을 허용하는 그리드 플랫폼의 중간 스레드를 제거).
  2. (DMSO에 5 mM의 재고 및 필터링 0.22 μm의는 4 ° C, 또는 어둠 속에서 -20 ° C에서 6 개월 1 개월 저장 될 수 있습니다) 나일 레드 나누어지는을 녹여. 다만 촬상 챔버에 나일 레드를 첨가하기 전에, 관류 펌프의 유량을 감소시키고 챔버 내의 유체가 항상 척수 커버되도록 진공 라인을 조정한다.
  3. 코드 (그림 3B)의 꼬리 끝 부분에서 영상 실에 5 ~ 10 μL 나일 레드 주식 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 챔버를 통해 나일 레드를 믹스 1 ML의 피펫을 사용합니다. 나일 레드 후, 1 ~ 2 분 동안 챔버에 머물 다시 진공 라인을 배치하고 지속적으로 척수를 관류하는 분 당 1.5 ml의 관류 펌프를 조정할 수 있습니다.
  4. 조심스럽게 현미경 스테이지를 제기수침 목적은 챔버 내의 ACSF의 표면으로부터 약 10mm가 될 때까지 및 척수 분절의 중심과 등쪽 내측 기둥 위에 정렬 대물. 이 부드럽게 ACSF의 표면에 닿을 때까지 천천히 목표를 가지고 현미경 노즈 초점 휠을 사용합니다. 시야 (그림 3C)에 지느러미 열을 집중 epifluorescent 광원을 사용합니다.

TPLSM 및 레이저에 의한 척수 손상과 마우스 척수 5. 생체 외 이미징 (LiSCI)

주 : 후방 정맥 날씬한 다발 섬유와 같은 조직을 중앙에 유용한 마커를 제공가 (후근 신경절 세포 본체에서 발생하고 T6에서 올라 아래 척수의 중간 선을 따라)이 혈관에 평행을 실행합니다. 두꺼운 YFP + 자궁 후근 돌기는 또한 섬유 올라가면 유용한 마커를 제공하고, Y 측 방향으로 하강직경이 작은 FP + 날씬한 다발 섬유.

  1. 척수 조직이 적절하게 정렬되면, 레이저 스캐닝 모드로 전환하여 상승 날씬한 유수 섬유 다발의 기준선 촬상을 수행한다. 모두 YFP 나일 레드 (Nile Red)를 여기하기 위해, 형광 발광을 분리하는 950 nm 파장 (~ 25 배, 1.1 NA 대물 렌즈의 출구에서 측정 된 17 Mw)은 적절한 dichroics (DM) 및 대역 통과 필터로 튜닝 이광자 레이저 소스를 사용 형광의 (우리는 노란색 - 오렌지 및 확장 빨강 채널 각각에 YFP, 그리고 나일 레드를 분리, 50분의 525의 DM560, 60분의 600의 DM640 및 70분의 685를 사용).
    1. 축삭의 3 % 이상이 기준 영상 (30 ~ 60 분) 동안 축삭 타원체를 표시하는 경우, 때문에 실험에 의한 유물에 준비를 폐기합니다.
  2. 30.3X로 시야를 확대하여 LiSCI을 유도 (~ 20 μm의 직경 절제를 만들 수 있습니다). 조정은 800 nm의 레이저 및 1 ~ 110 메가 와트의 레이저 전력을 증가샘플. 섬유가 완전히 가로로 보장하기보기 레이저 스캔의 5 완전한 필드를 허용합니다.
  3. (샘플, 2.08X에서 950 나노 미터, 17 Mw)이 영상 설정으로 레이저 설정을 변경하여 LiSCI을 확인하고 절제를 시각화하는 조직을 검사합니다. 절제의 직경을 확인하고 차 절제 축삭이 완전히 가로로됩니다 (그림 3D 참조). 부상 후 8-10 + 시간까지 부상으로 축삭과 수초의 동적 응답을 기록 Z 캡처와 함께 현미경에 시간 경과 설정을 사용합니다.
    참고 : 절제가 불완전하면 (즉, 섬유의 불완전 절개), 혼동 될 기본 및 보조 부상 메커니즘의 결정으로, 준비를 폐기합니다. 또한, 고립 된 척수 세그먼트는 LiSCI 독립적 인 조직 손상을 완화하기 위해 경증과 24 시간 후 LiSCI까지 이미지화 할 수 있습니다.

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Representative Results

적절한 가능성을 격리 유지하기 위해 설정 실험실 및 이미지의 세부 사항은 생체 척수는도 1에 도시된다. 현미경 가변 펄스 펨토초 레이저, 적절한 dicroics 및 배출 필터 및 물 구비해야 높은 개구 수 대물 렌즈를 침지 (≥1.0). 해부시 척수의 생존을 보장하기 위해, 과정은 절연 축삭 멤브레인 42을 밀봉 할 2+ 충분한 칼슘을 허용 냉장 산소화 둘러 ACSF 칼슘의 존재하에 수행한다. 그렇게하지 ​​않으면 ax​​olemma에서 수초의 분리 및 기본 이미징 동안 명확하게 볼 축삭 회전 타원체의 형성을 포함 axomyelinic가 손상 될 수 있습니다. 박리 공정 및 생체 척수 단리의 대표적인 이미지는도 2에 도시되어있다. * 아래 단리는 척수의 생존율 m이고36-37 ℃로 유지되는 산소 ACSF 연속 관류 aintained. 미엘린 나일 레드 염색 27,43 후 관류 챔버에 부가 될 수 있으며, 연약 다발의 기준선 기록은 유수 축색 돌기 (도 3)를 개시 할 수있다.

날씬한 다발 유수 축삭의 대표 이미지는 그림 4에 표시됩니다. 기본 조건 인터벌 TPLSM 녹음이 축삭의 길이를 따라 거의 일정한 직경이 수초 (나일 레드)에 ensheathed 평행하게 정렬 YFP + 축삭을 알 수있다. 몇 축삭 타원체 또는 축삭 변성의 다른 형태 학적 징후가 존재한다. 추정 희소 돌기 아교 세포의 세포 기관의 행이 어두운 오렌지 (그림 4A)를 표시하는 반면 인해 나일 레드 solvatochromic 속성과 수초의 지질과 단백질 함량, 수초는 노란색 - 오렌지 염색된다. 이러한 Ranvier의 노드로 미세 자세한 사항은 (예를 들어, 화살표에서 해결 될 수 있습니다

LiSCI 다음 10 분에, 절제 사이트에 주동이의 꼬리에 위치한 바로 가로로 축삭 (주 부상) 떨어져 부상 사이트에서 후퇴하기 시작 부어 열기구 수초 내에서 S 자 모양의 코일을 형성한다. 절제 원격 축삭을 ensheathing 미엘린이 시점에서 변화가 나타납니다. 그들은 병변 사이트 (그림 4B)에서 철회로 40 분 후 LiSCI 가장 기본 가로로 축삭 및 보조 퇴보를 겪고 축삭으로 (즉, 처음에 모욕 나중에 타락에서 절약은) 특성 endbulbs를 형성한다. 근위 세그먼트 최초의 팽창은, 축삭의 타원체를 형성하고, 결국 축삭 (43)의 여러 불규칙한 길이로 축삭을 횡단하는 곳에 약이 가로로 축삭의 세 번째 팬 분열을 겪게. 축삭 (근교 축삭 부종) 및 수초의 포성 변성에서 수초의 분리도 분명하다. 시간이 지남에 따라, 기본 및 보조 트란sected 축삭 멀리 병변 사이트에서 후퇴 계속, 즉시 절제 사이트를 측면에서는 축삭이 차 변성을 받아야하고, 사망시 축삭 부종 부종 수초 포성 변성뿐만 아니라 더 유명하게된다 (그림 4D-G,도 43 참조). 축삭 수축의 정도에 명확한 차이는 근위 축삭 젊고 아름다운 여자 (병변에 꼬리) 및 Wallerian 변성 (그림 4D-G)를 거쳐 운명 자신의 말단 부분 (병변에 주동이의) 사이에 분명해진다. 축삭 처음 겪는 LiSCI 겪었던 지연 이차 변성 (그림 4H). LiSCI없는 대표적인 제어 실험 (최대 13시간이 예제 코드 분리 후) 긴 영상 세션 백질의 무결성에 악영향을 초래하지 않고 가능하다는 것을 시사한다 (그림 4I, J).

대표 높은 R​​ESOLiSCI 후 axomyelinic 변화의 기술인 것 이미지는 그림 5에 표시됩니다.

LiSCI 후 3 시간으로, 여러 근위 (꼬리) 축색 돌기는 거리가 멀리 축삭에서 분리 한 부어 수초 튜브 내에 남아있는 병변 사이트에서 후퇴했다. 다른 축삭 endbulbs은 수초 (그림 5A)로 출장 할 것으로 보인다. 다른 영향을받지 나타나는 반면, 절제 사이트에 인접한 보조 축삭 퇴행을 겪는다. YFP 축삭 내에서 낮은 / 음의 추정 소포 (옅은 파란색)과 축삭 endbulbs도 존재한다. 반면에 섬유를 수축 미부에, 3 시간 후 LiSCI에서 rostrally 후퇴 축삭 endbulbs 및 회전 타원체의 대부분이 강하게 나일 레드 라벨이 붙어 있습니다 축삭 (그림 5B) 내에서 환경 변화를 나타내는를 (이하 블루 시프트). 나일 적극적으로 후퇴 축삭 내 지역은 주로 둘러싸고 또는 축삭 코어 캡 나타 빨간색 표지. 정확한 위치 및 IDE 비록이러한 인트라 축삭 나일 레드 - 표지 구조 ntity 현재 알려지지 이들은 축삭 수송 및 / 또는 소수성 코어 (27)를 노출시키는 단백질 분해를 통해 치밀한 소포 축적을 나타낼 수있다. 나일 레드 라벨 ​​수초는 주로 정상 나타나는 수초의 노란색 - 오렌지 남아있다. 구분에서, 나일 레드 (즉 블루 시프트)이 구조 내에서 환경 변화를 나타내는 기공 수초 노란색 표시 프로브. LiSCI 축삭 멀리 병변 사이트에서 후퇴 계속 후 7 시간으로; 그러나, 이는 꼬리 (도 5C) endbulbs 대 입쪽 (도 5d)에서 더 명백하다. 다른 축삭은 빈 수초 튜브 또는 마이크론 멀리 퇴화 세그먼트에서 얇은 줄기를 떠나 전체 또는 일부 붕괴를 받아야. LiSCI 후 나일 레드 지연 응용 프로그램은 나일 레드의 사전 응용 프로그램과 유사한 축삭 라벨이 제거 자체 단백질 변성에 잠재적 인 열 효과가 있음을 암시 밝혀부상 후 수초와 축색 돌기에서 나 레드 스펙트럼의 변화 (그림 5E, F)에 대한 책임을 가능성.

종합적으로, 이들 데이터는 실시간 axomyelinic 급성 손상의 공지하지만 제대로 이해 메커니즘을 모방 생체 LiSCI 모델의 유용성을 예시한다. 따라서이 모델은 백질 손상의 병태 생리에 대한 지식을 증진하는 것이 유용 할 수 및 백질의 무결성을 유지하기 위해 키 분자 표적을 발견 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : 해부 및 이미징 설정의 개요. (A)은 척수의 생체 외 이미징을위한 설정을 제안했다. 필요한 주요 장비 carbogen-온것을 제공 관류 펌프 ACSF을하는 산화물 carbogen (95 %, O2 / 5 % CO 2)의 가스 라인을 포함온도 피드백 프로브를 갖춘 인라인 히터 / 온도 제어 장치, 및 진공 원 장착 오픈 욕 설계된 촬상 챔버를 통해 ACSF을 채혈. (B) 촬상 욕 챔버의 높은 배율이 나타나있다. (C) 관류 및 생체 척수의 해부에 대한 제안 설정. 냉장 낮은 칼슘 2 + ACSF가 carbogen와 산소 및 박리시 척수의 생존 능력을 유지하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 이미징 척수의 분리 (A) 연속 냉장, 산소 낮은 칼슘 아래는 skul을 관류 2+LCAP가 노출된다. (B) 절개 후각 전구 (점선)의 수준에서 두개골의 등쪽 표면을 통해 이루어진다.이 부드럽게 될 때까지 (C) 양측 절개 후 skullcap의 측면 테두리를 통해 이루어진다 올린 뇌간을 노출 (화살표 방향) 꼬리 쪽 당겼다. (D) 등의 열을 척추의 좌우 측면을 잘라 노출 뾰족한 가위 (화살촉)과의 양자 절개를 계속합니다. (E)를 노출 척수의 상부 흉부 세그먼트 뇌간과 전체 자궁 경부 확대가 표시됩니다. (F) 번호 11 메스 블레이드와 함께 두 개의 절개 날씬한 다발의 축삭 종단 상부 흉추 레벨 (이상, 뇌간에서 척수를 분리하도록되어 점선). (G) 절연 척수 냉각하여 저 칼슘을 함유하는 페트리 접시로 전송 2+ ACSF가 버블carbogen 가스. 자궁 등의 뿌리 (예를 들어, 화살촉), 신경절 (dorsal root ganglion), 그리고 뇌간 (~ 15-20mm)에 상부 흉부 세그먼트에서 척수는 그대로 남아 있습니다. G의 스케일 바 :. 2mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 생체 척수 이미징 (A) 일단 챔버에 넣고는, 척수 조직이 변형 된 조직 / 슬라이스 일은 스레드를 장착 누르고 사용하여 고정 (B) 수초 얼룩 나일 레드가 직접 추가됩니다. 영상 실이. (C) 침수 목표 ACSF에 잠긴 날씬한 다발 섬유 위에 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. 중앙 유수 축삭 손상 TPLSM의 LiSCI 모델은 LiSCI (*) 다음 축삭과 수초 반응의 역학을 캡처하는 데 사용되었다. 대표 이미지는 25X를 장착 한 니콘 A1RMP + 광자 / 공 초점 현미경으로 0.24 μm의 / 픽셀로 촬영 오 1 ㎛ 두께의 광학 부분의 최대 강도 예측으로 표시됩니다; NA : 1.1; WD : 2mm 침수 목표. dichroics 및 배출 필터 표준 YFP + 축삭 (50분의 525의 DM560, 파란색으로 표시) 및 solvatochromic 친 유성 형광 염료 나 R을 구분하는 데 사용되었다배출 채널 (빨간색으로 표시 70분의 685 nm의) 짧은 (녹색으로 표시 60분의 600 DM640)과 이상에 에디션. 후자의 두 필터의 조합은 서로 다른 물리 화학적 환경의 나 레드의 알려진 스펙트럼의 변화를 포착으로 유리하다. 기본 조건 축삭에서 (A) (YFP +, 청색) 및 수초 (NR, 노란색 - 오렌지)은 일반적으로 몇 타원체 또는으로 지향 나타납니다 axomyelinic 손상의 징후. 백질 희소 돌기 아교 세포 (NR, 다크 오렌지, 예를 들어, 화살촉)의 특성 형태와 아교 세포의 행은 (일부는 명확하게 표시) 볼 수 있습니다, 이러한 Ranvier의 노드로 미세 구조도 (예 : 화살표) 해결됩니다. (B) (10)에서 분 LiSCI 후, 병변에 주동이의 꼬리에 위치한 가로로 축삭 부어 수초에서 떨어져 부상 사이트에서 후퇴 S 자 모양의 코일 (화살표)를 형성하기 시작한다. 절제에서 원격 축삭을 ensheathing 미엘린이 시점에서 변화가 나타납니다. (C) BY 40 분 후 LiSCI 가장 기본 가로로 축삭 그들이 병변 사이트 (화살촉)에서 철회로 차 변성 양식 특성 endbulbs를 받고 축삭. 일부 가로로 축색 돌기는 축색 돌기 (화살표)의 길이를 따라 회전 타원체를 형성한다. 축삭 (근교 축삭 부종) 및 수초의 포성 변성에서 수초의 분리도 (+). (DG). 시간이 지남에 따라, 기본 및 보조 부상 축삭 멀리 후퇴하는 YZ 돌기로 표시 계속 병변 사이트에서와 같이 분명하다 LiSCI의, 절제 사이트를 측면에서는 처음 아끼지 축삭이 차 변성을 지연 거칩니다 (H, LiSCI 전에 왼쪽 패널, 가운데 패널 십분 후 LiSCI 및 LiSCI 후 오른쪽 패널 7 시간, 하얀 점은 초기 LiSCI을 표시, 빨간 점이 표시 10 분 및 녹색 점으로 축삭의 손실)은 7 시간으로 축삭의 지연 이차 변성의 정도를 나타냅니다. 요정 - 축삭 부종은 나중에 포인트 이후 LiSCI에서 더욱 두드러집니다. 정도의 오F 축삭 철회 및 근위 축삭 젊고 아름다운 여자와 그 말단 세그먼트 사이 축삭 endbulbs의 형태는 분명해진다 (또한 더 높은 배율의 이미지를 그림 5 참조). 스케일 바 :. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 :. LiSCI TPLSM 후 axomyelinic 변동을 반영 고해상도 이미지는 3 시간에서 부상 꼬리 (A, C) 및 입쪽 (B, D)를 변경하는 축삭과 수초 복잡 세부를 캡처하는 데 사용 하였다 (A, B) 및 7 시간 LiSCI 이하의 (C, D). 대표 이미지는 세 1 ㎛ 두께의 광학 부분의 최대 강도 예측으로 표시됩니다니콘 A1RMP + 광자 / 공 초점 현미경으로 0.0832 μm의 / 픽셀로 촬영. 부어 수초 튜브 내에서 LiSCI (*), 여러 축삭 (파란색) 병변 사이트에서 멀리 후퇴된다 (대형 화살촉) (노란색 - 오렌지에 (A) 꼬리 ) 축삭 endbulb에서 멀리 분리 한 그. 절제 사이트에 인접한 일부 축색 돌기는 다른 사람들이 영향을받지 나타나는 반면, 이차 변성 (작은 화살촉을) 받다. YFP 저 / ​​음의 추정 소포는 축삭 내 (옅은 파란색)과 축삭 endbulbs 현재 (화살표)입니다. Ranvier (N)의 중앙 노드는이 이미징 및 라벨링 기술을 사용하여 또한 명확하게 볼 수 있습니다. (B) 반면에 섬유를 수축 미부에, 3 시간 후 LiSCI에서 rostrally 후퇴 축삭 endbulbs 및 회전 타원체의 대부분은 강하게 나일 라벨이 붙어 있습니다 레드 (핑크). 후퇴 축삭의 나 레드 표지 지역은 주로 표시 축삭 (파란색, 큰 화살촉)를 둘러싸고있는 또는 모자 YFP 보인다. 이러한 나일 레드 라벨의 성격이지만혼성 구조가 현재 알려지지 이들은 축삭 수송 및 / 또는 소수성 코어를 노출 단백질 분해를 통해 치밀한 소포 ​​축적을 나타낼 수있다. 구분에서, 나일 레드는 전 내 추정 환경 변화를 나타내는 기공 수초 (화살표) 노란색 정상 수초 (노란색 - 오렌지)에 비해 (즉, 스펙트럼이 이동 파란색) 표시를 표시. 요정 - 축삭 붓기도 분명 (작은 화살촉)입니다. LiSCI 후 7 시간 동안, 축삭은 병변 사이트에서 멀리 후퇴 계속; 그러나, 이는 꼬리 (C) 대 endbulbs 주동이 (D)에서 더 명백하다. 일부 축색 돌기는 각각 (D 작은 화살표) 퇴화 세그먼트에서 수 마이크론 멀리 빈 수초 튜브 (C에서 화살표) 또는 얇은 줄기를 떠나 전체 또는 일부 붕괴를 받아야. 나일 레드 지연 응용 프로그램은 주동이의 중앙 유수 축삭 (E와 F 대 꼬리 유사한 스펙트럼 변화를 생산 (C, D) 등. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2 × (2 mM의 칼슘) 시약 mM의
염화나트륨 (252)
의 KCl (6)
염화칼슘 2 • 2H 2 O 4
2 × B 의 NaH 2 PO 4 2.5
황산 4
의 NaHCO3 (52)
덱스 트로 오스 (D-포도당) (20)
배 낮은 칼슘 2 + 주식 C (0.1 mM의 칼슘) 염화나트륨 (252)
의 KCl (6)
의 MgCl • 6H 2 O 3.8
염화칼슘 2 • 2H 2 O 0.2

표 1 : 인공 뇌척수액 (ACSF) 버퍼.

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

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References

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