Abstract
Axónios do SNC lesionados e não conseguem regenerar frequentemente retrair para longe do local da lesão. Os axônios poupados da lesão inicial pode depois sofrer degeneração axonal secundária. A falta de formação do cone de crescimento, regeneração, e a perda de projecções axonais mielinizadas adicionais no interior da medula espinal limita grandemente a recuperação neurológica após lesão. Para avaliar como centro de axônios mielinizados da medula espinhal responder a lesão, foi desenvolvido um modelo ex vivo vivendo medular utilizando camundongos transgênicos que expressam a proteína fluorescente amarela em axônios e um focal e altamente reprodutível induzida por laser lesão medular para documentar o destino de axônios e mielina (corante fluorescente lipofílico Nile Red) ao longo do tempo, através de microscopia de excitação de lapso de tempo de dois fótons. Processos dinâmicos como a lesão axonal aguda, retração axonal, e mielina degeneração são melhor estudadas em tempo real. No entanto, a natureza não-focal de lesões à base de contusão e artefatos de movimento encontradodurante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de alta resolução desafiador. O modelo ex vivo medula espinhal descrito aqui imita vários aspectos da contusão / induzida por compressão patologias axonal clinicamente relevantes, incluindo inchaço axonal, formação esferóide, transection axonal e peri-axonal inchaço fornecer um modelo útil para estudar esses processos dinâmicos em tempo real. As principais vantagens deste modelo são excelente resolução espaço-temporal que permite a diferenciação entre o insulto primário que fere diretamente os axônios e mecanismos de lesão secundária; perfusão controlada de reagentes directamente para o banho de perfusato o cabo; alterações precisas do meio ambiente (por exemplo, cálcio, íons de sódio, os contribuintes conhecidos lesão axonal, mas quase impossível de manipular in vivo); e modelos murinos também oferecem uma vantagem uma vez que proporcionam uma oportunidade de visualizar emanipular geneticamente populações celulares identificadas e estruturas subcelulares. Aqui, descrevemos como isolar e imagem da medula espinhal de ratos vivendo para capturar a dinâmica de lesão axonal aguda.
Introduction
A degeneração de axônios é uma causa importante de morbidade abrangendo várias condições neurológicas, incluindo neurotrauma, acidente vascular cerebral, auto-imune, e doenças neurodegenerativas. Ao contrário do sistema nervoso periférico (SNP), sistema nervoso central (SNC) axónios têm uma capacidade limitada para se regenerar uma vez feridas devido a ambas as barreiras intrínsecos e extrínsecos (isto é, moléculas inibidoras do crescimento axonal produzido durante a formação de cicatriz e libertado durante a degeneração da mielina) 1 -7. Embora várias dessas barreiras foram amplamente exploradas, intervenções terapêuticas destinadas a prevenir a degeneração axonal CNS, promover a regeneração axonal robusta, e restaurar connectively funcional, permanecem limitados.
Axónios uma vez separados do soma passam por um processo de degeneração estereotipada conhecida como degeneração Wallerina que é caracterizado pela presença de edema axonal, formação esferóide fragmentação e eventual (revistos em 8). Emcontraste, o coto proximal que permanece em continuidade com a soma de um axônio periférico seccionado, forma um inchaço no seu fim, morre de volta ao nó mais próximo de Ranvier, e pode, então, iniciar o crescimento do cone formação, um pré-requisito vital necessário para posterior regeneração axonal 9-11. Em contraste, as terminações axonais proximais dos axónios muitas centrais formam característicos "endbulbs" ou lâmpadas de retracção, não conseguem formar cones de crescimento, e em vez retrair para longe do local da lesão, onde permanecem durante meses após a lesão 12-15. Além da lesão axonal primária, axonal dano / perda adicional também pode ocorrer a axônios que foram em grande parte poupadas da lesão inicial. Esta perda axonal atrasado de axônios inicialmente poupado é referida à degeneração axonal como secundário. Esta resposta inerente de axônios do SNC a lesão torna a regeneração axonal funcional uma meta ainda mais difícil de conseguir no cérebro e na medula espinhal.
Embora hallmarks de lesão axonal (por exemplo, a formação de esferóide, lâmpadas de retração) foram bem caracterizados a partir de tecido post-mortem e modelos experimentais de degeneração axonal, elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a esses processos dinâmicos foi restringido. A maioria desses estudos se baseou em observações ponto final estático que, inerentemente, não conseguiu captar respostas axonal individuais ao longo do tempo. Embora exogenamente aplicado marcadores axonais ter sido útil para elucidar respostas axonal das seções estáticas e durante o exame ao vivo, a disponibilidade de marcadores axonais geneticamente codificados tem melhorado muito a nossa capacidade de visualizar os axônios em tempo real por meio de microscopia de fluorescência. De fato, um relatório seminal de Kerschensteiner e colegas fornecida primeira evidência direta de degeneração axonal e regeneração in vivo utilizando camundongos Thy1 -GFP-S que codificam a proteína verde fluorescente em subconjuntos de neurônios que enviam suas projeções nas colunas dorsais da medulacabo de 16. Imagens ao vivo abordagens por microscopia de varredura a laser photon dois (TPLSM) e rotulagem proteína fluorescente genético das células de interesse continua a fornecer evidências diretas e visão mecanicista em muitas e diversas processos dinâmicos como a degeneração axonal, Ca 2+ sinalização, a regeneração axonal, fisiologia astrócitos, fisiologia microglial, e resposta à lesão 17-25.
Em contraste com os axónios, muito pouco se sabe sobre as respostas à lesão da mielina em tempo real. A mielina é um componente vital da matéria branca produzido e mantido por oligodendrócitos nas células do SNC e de Schwann no PNS. Mielina protege 99% da superfície de axônios e fazendo assim fornece uma alta resistência, revestimento protector baixa capacitância que suporta propagação do impulso saltatory rápida e eficiente, recentemente revisado por Buttermore et al. 26. Para capturar a resposta dinâmica da mielina a lesão usamos o solvatocrômico, lipofílicocorante fluorescente Vermelho de Nilo 27. As propriedades solvatocrômicos deste corante vital permitir mudanças de espectro de seu espectro de emissão que é dependente do ambiente físico-química 28,29. Estas propriedades são úteis para obter insights sobre os mecanismos de lesão axomyelinic e pode ser visualizada usando dichroics devidamente seleccionados, filtros de emissão ou resolvidos usando microscopia espectral 27. Por exemplo, o espectro de emissão do vermelho do Nilo é azul-deslocada em ambientes ricos em lípidos menos polares, tais como aqueles encontrados nos adipócitos e mielina do SNC normal (pico de emissão ~ 580-590 nm) 27. Em contraste, o espectro da emissão deste corante vital em ~ 625 nm em endbulbs formados como axônios passam por perecimento axonal 27. Embora os mecanismos precisos subjacentes a estas mudanças de espectro especificamente em endbulbs contra mielina normais permanecem obscuros, tais mudanças espectrais pode revelar alterações subjacentes na acumulação de proteínas ou desorganização levando aexposição de sítios de ligação hidrofóbicos 27.
Enquanto a imagem in vivo é a métrica final para observar medula espinhal dinâmica lesão axonal em seu ambiente nativo, é tecnicamente desafiador e requer perícia cirúrgica substancial, e muitas vezes repetir cirurgias para expor a coluna dorsal que pode introduzir artefatos experimentais (por exemplo, inflamação e cicatriz formação). Além disso, o equipamento caro é muitas vezes necessário para permitir que a suspensão e o posicionamento de um animal intacto sob a lente objectiva de microscópio. Os animais devem ser cuidadosamente monitorados, bem como para garantir que eles permaneçam quentes, para garantir fluidos são reabastecidos, e para garantir que não há sinais de hipóxia por sessões de imagem anestesiados prolongados. Este último é extremamente importante como axónios e mielina requerem absolutamente constante de perfusão e os níveis de oxigénio adequados para permanecerem viáveis. No entanto, isso muitas vezes não é relatado ou monitorados em mais estudos in vivo paradata. Além disso, os artefatos de movimento, devido à freqüência cardíaca e respiração (anestesia inalatória adulto mouse: ~ 300-450 batimentos por minuto (BPM) é ideal para manter a 97-98% de saturação de oxigênio (normal taxa de ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respirações por min (taxa normal é de ~ 163 respirações por minuto), respectivamente)) 30 encontrados durante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de fluorescência alta resolução desafio, até mesmo as varreduras a laser mais rápidos inevitavelmente estão sujeitas a estes movimentos artefatos. Avanços na ultra-rápidos scanners de ressonância combinados com uma janela vertebral rígida implantável enquadrado pode permitir imaging da medula espinhal murino em animais acordados, mas os tempos mais rápidos de digitalização inevitavelmente reduzir a relação sinal-ruído qualidade de imagem degradante. Outras melhorias nas técnicas de imagem da medula espinhal como actualmente utilizados para exames de imagem cerebral pode superar muitos desses obstáculos e limitar os potenciais fatores de confusão introduzidas pela inaperfusão tecidual dequate, por exemplo, 31-33.
Muito do que se sabe sobre a fisiologia da substância branca e mecanismos de lesão substância branca foi determinado utilizando in vitro ou ex vivo preparações de substância branca do nervo óptico, nervo periférico, e as tiras de medula espinhal substância branca 34-41. Estas preparações continuar a aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de lesão da substância branca como eles permitem variações dos fatores ambientais, a aplicação controlada de medicamentos e reagentes, avaliações funcionais usando eletrofisiologia, e observações diretas microscopia de fluorescência dos axônios e mielina em tecidos vivos controlada. No entanto, algumas abordagens anteriores para observar axônios de cordão espinhal tiras de coluna dorsal ou tiras de substância branca ventral inevitavelmente ferir axônios de superfície durante a fase de remoção que pode influenciar a resposta dos axônios de perto opostos. Para capitalizar sobre as manipulações experimentais acima e evitar danos ao vefibras ry sob investigação, utilizamos um modelo da medula espinhal cervical ex vivo em que evita o contato direto do aspecto dorsal da medula. Assim, a arquitetura da pia-máter e axônios da coluna dorsal superficial adjacentes permanecem viáveis e imperturbável durante o isolamento.
Aqui nós descrevemos uma abordagem relativamente simples, que permite a visualização direta de axônios mielinizados centrais como eles respondem dinamicamente a uma lesão focal em tempo real até 8 - 10+ horas após a lesão. A lesão medular modelo induzido por laser (Lisci) permite a diferenciação entre os mecanismos de lesão axonal primário e secundário como a lesão primária (local de ablação) permanece espacialmente restritos ao longo do tempo. A câmara de imagem-banho aberto é acessível a intervenção terapêutica, de fornecimento de reagentes, e manipulações ambientais. Agentes protetores axomyelinic putativos pode ser rapidamente avaliado em tempo real através de observações diretas contra experiências longas e custosas que envolvam processo tecidoing, seccionamento, immunostaining, captura de imagem, e análise e, portanto, fornece um modelo substituto útil para avaliar as respostas agudas e manipulações de proteção antes de testar os agentes experimentais em animais vivos.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados sob as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso comitê animal Institucional da Universidade de Louisville, aderindo às regulamentações federais.
1. Preparação de Baixo Ca 2+ e 2 Ca 2+ mM líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) perfusatos
- Prepare 2x baixo Ca2 + (0,1 mM) da tampão C, 2x Ca 2+ normais (2 mM) da Um tampão, tampão e 2x da B como descrito na Tabela 1. As soluções stock individuais permitem a modificação do conteúdo de iões (por exemplo, baixo ou zero Ca 2+) e pode ser armazenado a 4 ° C durante até um mês.
- Para perfusão intracardíaca durante a dissecção, adicione 100 ml de 2x baixo Ca 2+ da C e 100 ml de 2x da B dentro de uma garrafa de plástico para fazer 1x baixo Ca 2+ aCSF. Misture e armazenar a noite a 4 ° C ou fazer fresco.
- Para perfusão ex vivo medula espinhal durante imagção, adicionar 500 ml de 2x o normal de Ca2 + da A e 500 ml de 2x da B para um frasco de vidro de 1 L para gerar 1x ACSF. Misture e armazenar durante a noite a temperatura ambiente ou fazer fresco.
- Ajustar o pH de 7,4 para buffers de aCSF. Mantendo o ACSF à temperatura ambiente, colocar a partir de Ca2 + aCSF em gelo e, em seguida, as duas soluções de bolha de gás com carbogénio (95% O2, 5% de CO 2) durante 30 min antes da utilização e durante a perfusão contínua.
2. Preparação de Ex Vivo Imagem Câmara
- Enrole um cobertor de aquecimento (sem desligamento automático) ao redor da garrafa aCSF e ajustar o calor para baixo configuração / médio.
- Inserir uma linha dedicada de perfusão aCSF no frasco ligado a uma bomba de perfusão e aquecedor em linha que é controlada por uma sonda de temperatura bipolar controlador de temperatura e de feedback, como mostrado na Figura 1A.
- Anexar um microscópio plana fase de inserção (152 x 102 mm) para o 2 fótons excitação / confocal fase microscópio equipado com um recipiente de derrame.
- Coloque uma grande câmara de perfusão em banho aberto (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) para o recipiente de vazamento para acomodar e fornecer um fluxo contínuo de novo para ACSF oxigenado ex vivo da medula espinhal (ver Figura 1B para uma saída adequado vivo de imagens desenho da câmara).
- Ligue a porta de saída de metal do aquecedor-line para a câmara de ex vivo de imagens usando tubulação adequada. Coloque uma almofada absorvente fina por baixo da câmara ex vivo para ajudar a manter a temperatura do tampão / tecido durante o exame.
- Aderem a câmara ex vivo de imagens para o fundo da inserção recipiente derramamento / palco usando pegajoso removível. A maleabilidade do pegajoso permitirá a câmara para ser ajustado conforme necessário para garantir o percurso da luz do objectivo é perpendicular à superfície do tecido. Se necessário, use um nível alvo para ajustar a câmara.
- Proteger umsonda em linha de retorno de aquecimento de temperatura perto da entrada de fluido e uma câmara de sucção do tubo de aço inoxidável ligado a uma linha de vácuo na saída da câmara. Titulares de suportes magnéticos e micropipeta adequado são úteis a este respeito. Ligue a fonte de vácuo.
- Ligue a bomba de perfusão para começar a encher a câmara de imagem com aCSF oxigenado. Defina a bomba de perfusão para 1,5-2 ml por min.
- Controlar o volume de aCSF no câmara de imagem, ajustando a linha de vácuo. É importante que haja suficiente ACSF na câmara de imagem para cobrir o segmento da espinal medula e permitir que a distância de trabalho suficiente entre um objectivo imersão de água e a superfície do tecido. A mielina e axônios podem ser prejudicados se o segmento de tecidos não está completamente submerso em fresco oxigenado aCSF levando artefatos induzidas experimentador.
- Ajustar o controlador de temperatura do aquecedor em linha de modo a que a temperatura do perfusato na câmara de imagem é próxima da temperatura ambiente.
- Eutanásia um adulto 6-10 semanas de idade Thy1 -YFP ratinho transgénico (estirpe uso apropriado que tem a expressão de proteína fluorescente em neurónios do gânglio da raiz dorsal) por injecção de uma overdose de pentobarbital a anestesia de sódio (200 mg / kg) via injecção intraperitoneal.
- Uma vez sob o nível adequado de anestesia (por exemplo, nenhuma reação ao pitada toe e perda de reflexo de piscar), fazer a barba cuidadosamente a pele que recobre o cérebro ea medula espinhal com clippers cirúrgicos. Limpe a pele com betadine e 70% de etanol almofadas.
- Spray de peito / área do abdômen com etanol 70%, em seguida, aspergir o assunto transcardially usando refrigerados, borbulhou-carbogen baixo Ca 2+ aCSF. (Veja a Figura 1C para sugeriu banco dissecção top configurada).
- Como o fígado empalidece, fixe a agulha de perfusão para o coração usando um pequeno clip. Vire o assunto para poder ter acesso ao lado dorsal raspada deo assunto e limpe a área depilada com etanol 70%.
- Fazer uma incisão na pele na linha média dorsal a partir do nariz até o quadril usando tesouras de dissecação para expor o cérebro e à coluna vertebral (Figura 2A). Fixe a preparação, colocando pinos no nariz e coxa.
- Usando um microscópio de dissecção a partir deste ponto em diante, firmemente atravessam a superfície dorsal do crânio no nível dos bolbos olfactivos. Introduzir uma das pontas de tesoura para os bordos laterais da incisão e cortar ao longo das bordas da calota craniana bilateral até o cerebelo.
NOTA: Não extirpar completamente a calota craniana, uma vez que é necessário mais tarde para levantar o tecido sobrejacente da medula espinhal em toda a dissecção (ver Figura 2B). - Levante a calota craniana para expor o cérebro. Com cuidado, cortar as extremidades esquerda e direita do osso interparietal (localizado no cerebelo) e puxá-lo para trás caudalmente para expor o tronco cerebral / espinal medula (Figura 2C
- Utilize uma tesoura fina inclinados realizada num ângulo de 45 ° com a superfície da mesa e cortar as vértebras bilateralmente apenas inferiores aos das raízes nervosas posteriores.
NOTA: Evite contato com as colunas dorsais brancas brilhantes. Estas fibras são as que irão ser espelhados (Figura 2D) e podem ser facilmente danificados. - Levantar a calota craniana e superfície dorsal da coluna vertebral com uma pinça de ponta fina, puxando o tecido sobreposta numa peça única como os cortes são feitos para expor a medula espinhal. Continuar a cortar vértebras ao nível torácico superior para isolar um segmento de 1-2 cm da coluna cervical para imagiologia subsequente (Figura 2E).
- Utilize uma tesoura para cortar o tecido / osso paralela à coluna vertebral e tecido claro debaixo da coluna. Faça estes cortes o mais nivelado possível. É muito importante que o tecido encontra-se horizontalmente na câmara de modo que o cabo é para imagiologia de nível.
- Use a # 11 bisturi para transecto do tronco cerebral (após oterminação das fibras fascículo grácil) e ao nível torácico superior para isolar o segmento cervical da medula espinhal (ver Figura 2F). Utilize uma tesoura para cortar o tecido / osso nestes mesmos dois pontos. O tecido isolado deve conter 2/3 da coluna vertebral, compreendendo o caudal do tronco cerebral, o alargamento do colo do útero, e na medula espinal torácica superior (Figura 2G).
- Inserir a coluna vertebral isolado em uma placa de Petri de borbulhou-carbogénio, baixo Ca 2+ gelada ACSF. Se necessário, cortar o tecido embaixo da coluna vertebral até que ela fique totalmente no prato.
- Transferir a coluna vertebral isolada para a câmara de imagiologia ex vivo, e aumentar gradualmente a temperatura do perfusato durante 1 hora a 36-37 ° C. Manter esta temperatura durante o exame.
4. Colocação de Ex Vivo Spinal Cord em Imagem Câmara e Mielina Marcando com Nile Red
- Garantir cuidadosamente a coluna vertebral na icâmara maging com uma fatia de montagem correspondente mantenha pressionado modificado com uma plataforma de rede vertical, que consiste tópicos Lycra finas (remover fios médios da plataforma de rede para permitir espaço para a medula espinhal; ver Figura 3A).
- Descongelar uma aliquota de Vermelho do Nilo (5 mM em DMSO e 0,22 um filtrado; pode ser armazenada durante 1 mês a 4 ° C ou 6 meses a -20 ° C, no escuro). Assim, antes de adicionar Vermelho do Nilo para a câmara de imagiologia, reduzir o fluxo da bomba de perfusão e ajustar a linha de vácuo para garantir que o fluido na câmara de cobre sempre a medula espinhal.
- Junte 5-10 ul solução estoque Vermelho do Nilo para a câmara de imagiologia perto da extremidade caudal da medula (Figura 3B). Usar uma pipeta de 1 ml para misturar suavemente Vermelho do Nilo ao longo da câmara. Permitir Nile Red para ficar em câmara para 1-2 min, em seguida, coloque linha de vácuo para trás e ajustar bomba de infusão, a 1,5-2 ml por min para perfundir continuamente a medula espinhal.
- Levantar cuidadosamente o estágio do microscópioe alinhar o objectivo com o centro do segmento da espinal medula e medialmente sobre as colunas dorsais até a objectiva de imersão em água é de aproximadamente 10 mm a partir da superfície do aCSF na câmara. Use o microscópio roda foco nosepiece para trazer lentamente o objetivo para baixo até que gentilmente toca a superfície da aCSF. Use uma fonte de luz de epifluorescência para focar as colunas dorsais para o campo de visão (Figura 3C).
5. Ex vivo de imagens do Cordão do rato Spinal com TPLSM e induzida por laser Lesão Medular (Lisci)
NOTA: A veia posterior fornece um marcador útil para centrar o tecido como as fibras fascículo grácil (originários de corpo celular de gânglios da raiz dorsal e ascender do T6 e abaixo ao longo da linha média da medula espinhal) correm em paralelo a este vaso sanguíneo. As mais grossas YFP + projeções de raiz dorsal cervical também fornecem um marcador útil como o Ascend fibras e descer lateralmente para a YPF + fascículo grácil fibras que são menores em diâmetro.
- Uma vez que o tecido da medula espinhal está alinhado de forma adequada, mude para o modo de varredura a laser realizar imagem de linha de base das fibras mielinizadas fascículo grácil ascendentes. Para excitar tanto YFP e Vermelho do Nilo, utilizar uma fonte de laser de dois fotões de comprimento de onda ajustado para 950 nm (~ 17 mW medido na saída de um 25X, 1,1 NA objectivo) e dicróicos apropriados (DM) e filtros de banda de passagem para isolar a emissão fluorescente dos fluoróforos (usamos 525/50 DM560, DM640 600/60, e 685/70, para separar YFP, Vermelho do Nilo e em amarelo-alaranjado, e canais vermelho estendidos, respectivamente).
- Se mais do que 3% dos axónios mostram esferóides axonais em imagiologia de linha de base (30-60 min), descartar a preparação devido a artefactos induzidos por experimentador.
- Induzir uma Lisci ampliando o campo de visão para 30.3X (para criar uma ablação ~ 20 um de diâmetro). Sintonizar o laser de 800 nm, e aumentar a potência do laser de 110 mW a ~a amostra. Permitir 5 campo completo de scans vista a laser para garantir fibras são completamente seccionado.
- Confirme Lisci, alterando as configurações de laser de volta para as configurações de imagem (950 nm, 17 MW na amostra, 2.08X) e digitalizar o tecido para visualizar a ablação. Verificar o diâmetro da ablação e que os axónios extirpadas primárias são completamente seccionado (ver Figura 3D). Use as configurações de time-lapse no microscópio combinado com captura de z para gravar a resposta dinâmica dos axônios e mielina a lesão até 8-10 + hr após a lesão.
NOTA: Se a ablação é incompleta (ie, transection incompleta de fibras), descarte a preparação, na determinação dos mecanismos de lesão primária e secundária será confundido. Além disso, isolados segmentos da medula espinhal podem ser visualizados até 24 horas pós-Lisci com apenas leve dano tecidual Lisci-independente a moderada.
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Representative Results
Detalhes de um laboratório adequado configurar necessário para isolar, manter a viabilidade, e da imagem do ex vivo medula espinhal é mostrado na Figura 1. O microscópio deve ser equipado com um laser ajustável pulsado femtosegundo, dicroics apropriados e filtros de emissão, e uma água mergulhando lente objetiva com uma alta abertura numérica (≥1.0). Para assegurar a viabilidade da medula espinhal durante a dissecção, o procedimento deve ser realizado na presença de Ca2 + refrigerada baixo ACSF oxigenado que permite suficiente Ca 2+ para as membranas axonais isolados para vedar 42. Não fazer isso pode causar danos axomyelinic incluindo a separação de mielina do axolema e formação esferóide axonal claramente visível durante o exame inicial. Imagens representativas do processo de dissecção e isolamento da medula espinal ex vivo é mostrada na Figura 2. Seguindo o isolamento viabilidade da medula espinal é maintained por perfusão contínua de ACSF oxigenado, que é mantida a 36-37 ° C. A mielina mancha vermelha do Nilo 27,43 pode, então, ser adicionada à câmara de perfusão, e gravações de linha de base do fascículo gracile axónios mielinizados pode iniciar (Figura 3).
Imagens representativas de axónios mielinizados fascículo grácil são mostrados na Figura 4. Em condições basais gravações Timelapse TPLSM revelar + axônios YFP paralelos alinhados ensheathed na mielina (Vermelho do Nilo) com diâmetros largamente constante ao longo do comprimento do axónio. Poucos esferóides axonais ou outros sinais morfológicos de degeneração axonal estão presentes. Devido às propriedades solvatocrômicos de Nile Red e o teor de lípidos e de proteínas da mielina, a mielina é manchado amarelo-laranja Considerando fileiras de corpos celulares oligodendrócitos putativo aparecer laranja mais escuro (Figura 4A). Detalhes finos, tais como nódulos de Ranvier também pode ser resolvido (por exemplo, as setas nas Aos 10 min seguinte Lisci, axônios imediatamente transeccionados (lesão primária) localizados rostral e caudal ao local de ablação começar a retrair de distância do local da lesão e formar bobinas sigmoidal-like dentro inchado mielina balonismo. A mielina ensheathing axônios remoto para a ablação aparecer inalterados neste ponto do tempo. Por 40 min pós-Lisci axônios transeccionados mais primárias e axônios submetidos a degeneração secundária (ou seja, inicialmente poupado do insulto, mas degenerado mais tarde) formam endbulbs característicos como eles retrair a partir do site da lesão (Figura 4B). Aproximadamente um terço desses axônios transeccionados sofrer pan-fragmentação onde o segmento proximal primeiros swells, forma esferóides axonais e, eventualmente, secciona o axônio em vários comprimentos irregulares de axônio 43. Separação de mielina dos axônios (peri-axonal inchaço) e degeneração vesicular de mielina também é evidente. Ao longo do tempo, tran primária e secundáriaaxónios sected continuar retracção longe do local da lesão, os axônios imediatamente flanqueando o local de ablação sofrer degeneração secundária, inchaço e peri-axonal torna-se mais proeminente, bem como inchaço mielina e degeneração vesicular (Figura 4D-G, ver também 43). A clara diferença no grau de retração axonal se torna aparente entre os cotos proximais axonal (caudais de lesão) e seus segmentos distais (rostral à lesão) que estão destinados a sofrer degeneração Walleriana (Figura 4D-G). Axons inicialmente poupado pela Lisci sofrer degeneração secundária atrasada (Figura 4H). A experiência representativa controle sem Lisci, sugere que as sessões de imagem de longa duração (até 13 horas após o isolamento cabo neste exemplo) são possíveis, sem causar efeitos adversos para a integridade da substância branca (Figura 4I, J). Representante de alta resoimagens lução de alterações axomyelinic após Lisci são mostrados na Figura 5. Por 3 h após Lisci, vários (caudal) axônios proximais têm retraída para longe do local da lesão, onde permanecem dentro de tubos de mielina inchados, que têm separado longe do axónio. Outros endbulbs axonais parecem ser tapado por mielina (Figura 5A). Os axônios adjacentes ao local de ablação sofrer degeneração secundária enquanto outros parecem afetados. YFP vesículas baixo / negativos putativos (azul pálido) dentro do axônio e endbulbs axonal também estão presentes. Em contraste com caudalmente retracção fibras, a maioria das endbulbs e esferóides axonais rostral de retracção, em 3 h pós-Lisci são fortemente marcada com Vermelho do Nilo (menos azul deslocado) indicativa de uma mudança ambiental dentro do axónio (Figura 5B). Marcado Red Nilo áreas dentro dos axônios retracção ativamente parecem cercar principalmente ou tampar o núcleo axonal. Embora a localização precisa e identity destas estruturas Nile Red-rotulados intra-axonal são presentemente desconhecidos, eles podem representar acúmulo vesícula densa via transporte axonal e / ou proteínas clivadas expondo seu núcleo hidrofóbico 27. Nile Red mielina marcado permanece principalmente amarelo-laranja na mielina aparecendo normal. Em distinção, Nile Red sondado mielina vesicular aparece amarelo (ou seja, azul deslocado) indicativo de mudanças ambientais dentro dessas estruturas. Até 7 horas após axônios Lisci continuar retraindo longe do local da lesão; no entanto, isto é mais evidente na rostral (Figura 5D) versus caudal (Figura 5C) endbulbs. Outros axônios sofrer desintegração completa ou parcial deixando um tubo de mielina vazio ou uma haste fina diversos mícrons de distância do segmento de degeneração. Aplicação tardia de Nile Red depois Lisci revela rotulagem axonal semelhante à pré-candidatura de Nilo Red sugestivo que a ablação por si e potenciais efeitos térmicos sobre a desnaturação de proteínas éimprovável responsável pelas mudanças Nile Red espectrais em mielina e axônios após a lesão (Figura 5E, F). Colectivamente, estes dados ilustram a utilidade do modelo ex vivo Lisci para imitar mecanismos bem conhecidos mas pouco compreensíveis de lesão aguda axomyelinic em tempo real. O modelo pode, portanto, ser útil para aprofundar o nosso conhecimento da fisiopatologia da lesão da substância branca, e descobrir alvos moleculares fundamentais para preservar a integridade da substância branca. 
Figura 1: Visão geral da configuração de dissecção e de imagem. (A) Um sugerido set-up por ex vivo da medula espinhal. O principal equipamento necessário inclui uma carbogen (95% O 2/5% de CO 2) linha de gás para oxigenar o aCSF, uma bomba de perfusão para entregar o carbogen-bubsangrados aCSF através de um dispositivo em-linha de controlador / aquecedor temperatura equipado com uma sonda de temperatura de realimentação, e uma câmara de imagem concebido-banho aberto equipado com uma fonte de vácuo. (B) Uma maior ampliação da câmara do banho de formação de imagens é mostrado. (C) A sugeriu set-up para a perfusão e dissecção da ex vivo medula espinhal. Baixo Ca 2+ Chilled aCSF é oxigenado com carbogen e usado para manter a viabilidade da medula espinhal durante a dissecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2:. O isolamento da medula espinhal para a imagem latente (A) Sob contínua refrigerados, oxigenado baixo Ca2 + perfusão o skullcap está exposta. (B) Uma incisão é feita por meio da superfície dorsal do crânio no nível dos bolbos olfactivos (linha a tracejado). (C) bilaterais incisões são então feitos através das bordas laterais da calota craniana até que possa ser suavemente levantada e puxada caudalmente (na direcção da seta) para expor o tronco cerebral. (D) Continuar incisões bilaterais com tesoura de ponta fina para cortar os aspectos laterais das vértebras e expõem as colunas dorsais (ponta de seta). (E) O exposto tronco cerebral e de todo o alargamento cervical para o segmento torácico superior da medula espinhal são mostrados. (F) duas incisões com um número de 11 bisturi com lâmina são feitos para isolar a medula espinhal, no tronco cerebral, além das terminações grácil fascículo axonal e nível torácico superior ( linhas tracejadas). (G) O isolado medula espinhal é então transferido para uma placa de Petri contendo baixo Ca 2+ refrigerados aCSF borbulhargás carbogen. Raízes dorsais do colo do útero (por exemplo, pontas de seta), gânglio da raiz dorsal, e da medula espinhal do segmento torácico superior ao tronco cerebral (~ 15-20 mm) são deixadas intactas. Barra de escala em G:. 2 milímetros por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3:. Imaging o ex vivo da medula espinhal (A) Uma vez colocado na câmara, o tecido da medula espinal é protegido usando um tecido / fatia modificado mantenha pressionada equipado com fios de Lycra (B) O corante Vermelho do Nilo mielina é adicionado directamente a. a câmara de imagem. (C) Uma objectiva de imersão em água é submerso no ACSF e posicionado sobre as fibras fascículo grácil. 
Figura 4:. Modelo Lisci de lesão axonal mielinizado centro TPLSM foi usado para capturar a dinâmica do axônio e mielina respostas seguintes Lisci (*). Imagens representativas são exibidas como projeções máximos de intensidade de 1 mícron cinco secções ópticas grossas capturados em 0,24 mm / pixel com uma Nikon A1RMP + multiphoton / microscópio confocal equipado com um 25X; NA: 1,1; WD: 2 milímetros objetiva de imersão em água. Dichroics e filtros de emissão padrão foram utilizados para separar YFP + axônios (525/50 DM560, mostrados em azul) e o corante fluorescente lipofílico solvatocrômico Nile Red em menor (600/60 DM640, mostrado em verde) e maior (685/70 nm, mostrado em vermelho) canais de emissão. As duas últimas combinações de filtro apresenta como vantagem a capturar conhecidos mudanças espectrais do Nilo vermelhas em diferentes ambientes físico-químicas. (A) em condições basais axônios (YFP +, azul) e de mielina (NR, amarelo-laranja) aparecem normalmente orientada com poucas esferóides ou outros sinais de lesão axomyelinic. Fileiras de glia com a morfologia característica de oligodendrócitos substância branca (NR, laranja escuro, por exemplo, pontas de seta) também são visíveis (alguns marcado para maior clareza), e estruturas finas, como nós de Ranvier são também resolveu (por exemplo, setas). (B) a 10 min após Lisci, axónios transeccionados localizados rostral e caudal da lesão começar a retrair para longe do local da lesão e formar-sigmoidais como bobinas (setas) dentro de mielina inchados. Mielina ensheathing axónios afastada da ablação aparecem inalterados neste ponto de tempo. (C) Baxônios transeccionados y 40 min pós-Lisci mais primárias e axônios submetidos formulário degeneração secundária endbulbs característicos como eles retrair a partir do local da lesão (setas). Alguns axónios transeccionados também formar esferóides ao longo do comprimento dos seus axónios (setas). Separação de mielina do axônio (peri-axonal inchaço) e degeneração vesicular de mielina também é evidente (+). (DG). Ao longo do tempo, os axônios lesionados primárias e secundárias continuam retraindo longe do local da lesão e, como mostrado por projeções yz do Lisci, axônios inicialmente poupados flanqueando o local de ablação submetem adiada degeneração secundária (H, o painel esquerdo antes Lisci, painel central 10 minutos pós-Lisci, e à direita do painel de 7 horas após Lisci; pontos brancos marcar o Lisci inicial, pontos vermelhos indicam a perda de axônios por 10 min e pontos verdes indicam o grau de degeneração secundária atrasada de axônios por 7 h). Inchaço Peri-axonal se torna mais proeminente em posteriores momentos pós-Lisci. A extensão of retração axonal e morfologia de endbulbs axonal entre tocos axônio proximais e seus segmentos distais também se torna aparente (ver também Figura 5 para imagens de ampliação superiores). Barra de escala:. 50 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 5:. Imagens de alta resolução representativos de mudanças axomyelinic após Lisci TPLSM foi utilizado para captar detalhes intrincados de mielina do axónio e muda caudal (A, C) e rostral (B, D) a uma lesão em 3 horas (A, B) e 7 horas (C, D) seguinte Lisci. Imagens representativas são exibidas como projeções máximos de intensidade dos três secções ópticas de 1 um de espessuracapturados em 0,0832 mm / pixel com uma Nikon A1RMP + multiphoton / microscópio confocal. (A) Caudal ao Lisci (*), vários axônios (azul) estão retraindo longe do local da lesão (grandes pontas de seta) dentro de tubos de mielina inchados (amarelo-laranja ) que se separaram longe da endbulb axonal. Alguns axónios adjacentes ao local de ablação sofrer degeneração secundária (pontas de seta pequenas) ao passo que outras parecem inalterados. YFP vesículas baixo / negativos putativos (azul pálido) dentro do axônio e endbulbs axonal estão presentes (setas). Um nó central de Ranvier (n) é também claramente visíveis através desta técnica de imagiologia e rotulagem. (B) Em contraste com caudalmente retracção fibras, a maioria das endbulbs e esferóides axonais rostral de retracção, em 3 horas pós-Lisci são fortemente marcada com Nilo Red (rosa). Áreas Nile Red-rotulados, os axônios retracção parecem cercar principalmente ou boné YFP axônios marcados (azuis, grandes setas). Embora a natureza destas Vermelho do Nilo rótuloestruturas ed é actualmente desconhecida, eles podem representar acúmulo vesícula densa via transporte axonal e / ou proteínas clivadas expondo seu núcleo hidrofóbico. Em distinção, Nile Red marcado mielina vesicular (setas) aparece amarelo (ou seja, o espectro é azul deslocado) em comparação com mielina normal (amarelo-laranja), indicativo de mudanças ambientais putativos dentro da antiga. Inchaço Peri-axonal é também evidentes (pequenas setas). Aos 7 horas após Lisci, axônios continuar retraindo longe do local da lesão; no entanto, isto é mais evidente na rostral (D) versus caudal (C) endbulbs. Alguns axônios sofrer desintegração completa ou parcial deixando um tubo vazio de mielina (seta C) ou de uma haste fina diversos mícrons de distância do segmento de degeneração (pequenas setas em D), respectivamente. Aplicação tardia de Nile Red produz mudanças espectrais semelhantes em caudal contra rostral axônios mielinizados centrais (E e F
| 2x da A (Ca 2+ 2 mM) | Reagente | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCl | 6 | |
| CaCl 2 2H 2 O • | 4 | |
| 2x da B | NaH 2 PO 4 | 2,5 |
| MgSO4 | 4 | |
| NaHCO3 | 52 | |
| Dextrose (D-glicose) | 20 | |
| 2x baixo Ca 2+ da C (Ca 0,1 mM 2+) | NaCl | 252 |
| KCl | 6 | |
| MgCl • 6H 2 O | 3.8 | |
| CaCl 2 2H 2 O • | 0,2 |
Tabela 1: Artificial de líquido cefalorraquidiano (aCSF) buffers.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
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