Abstract
Yaralı MSS aksonlar rejenere ve genellikle uzak yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. İlk yaralanma kurtulmuş aksonlar sonra ikincil aksonal dejenerasyonu uğrayabilir. Spinal kord içindeki büyüme konisinin oluşumu, rejenerasyon ve ek miyelinli akson projeksiyonlar kaybı olmaması büyük ölçüde yaralanma sonrası nörolojik iyileşme sınırlar. Omuriliğin miyelinli aksonları yaralanma nasıl tepki merkezi değerlendirmek için, biz kaderi belgelemek için sarı floresan akson protein ve fokal ve yüksek tekrarlanabilir lazer kaynaklı omurilik yaralanması ifade transgenik fareler kullanan omurilik modeli yaşayan bir ex vivo geliştirdi İki foton uyarma time-lapse mikroskopi kullanılarak akson ve zamanla miyelin (lipofilik floresan boya Nil Kırmızı). Akut aksonal yaralanma, akson retraksiyon ve miyelin dejenerasyonu gibi dinamik süreçler en iyi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Ancak, çürük temelli yaralanmalar ve hareket eserler olmayan odak doğa karşılaştıyüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak zorlu birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında. Burada anlatılan ex vivo omurilik modeli aksonal şişme, sfero oluşumu, akson Transeksiyon, ve gerçek-zamanlı olarak bu dinamik süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlayan şişme peri-akson olmak üzere klinik olarak anlamlı kontuzyon / sıkıştırma kaynaklı aksonal patolojilerin çeşitli yönlerini taklit eder. Bu modelin önemli avantajları doğrudan akson ve ikincil yaralanma mekanizmaları yaralandı birincil hakaret arasındaki farklılaşmayı sayesinde mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü vardır; doğrudan Perfüzat banyo kablosunu reaktif kontrollü infüzyon; Çevre ortamın kesin değişiklikler (örneğin kalsiyum, sodyum iyonları, aksonal yaralanma, ama imkansız yakın bilinen katkıda in vivo işlemek için); onlar görselleştirmek için bir fırsat olarak ve kemirgen modeller de bir avantaj sunuyoruz vegenetik belirlenen hücre popülasyonları ve hücre içi yapıları manipüle. Burada, biz izole etmek ve görüntü farelerin yaşayan omurilik akut aksonal yaralanma dinamiklerini yakalamak için nasıl açıklar.
Introduction
Akson Dejenerasyon nörotravma, inme, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok nörolojik koşulları kapsayan morbidite önemli bir nedenidir. Periferik sinir sistemi (PNS), santral sinir sistemi aksine (MSS) aksonlar kez nedeniyle iç ve dış engelleri (yani, miyelin dejenerasyonu sırasında skar oluşumu sırasında üretilen ve serbest aksonal büyüme inhibitör molekülleri) 1 hem yaralı yenilemek için sınırlı bir kapasiteye sahip -7. Bu engellerin çeşitli yaygın araştırdı olmasına rağmen, tedavi amaçlı müdahaleler, MSS akson dejenerasyonu önlemek sağlam aksonal rejenerasyonu teşvik ve fonksiyonel connectively geri, sınırlı kalmaktadır.
Bir kez soma ayrılmış aksonlar akson şişlik, sfero oluşumu ve (8 gözden) nihai parçalanma ile karakterizedir Wallerian dejenerasyon olarak bilinen dejenerasyonun bir basmakalıp sürecine tabi. Içindekontrast, nakledilen periferik akson soma ile süreklilik kalır proksimal güdük, sonraki aksonal rejenerasyon için hayati bir ön koşul gerekli, bir ucunda şişlik oluşturan geri Ranvier yakın düğüme ölür, ve sonra büyüme konisinin oluşumunu başlatabilir 9-11. Buna karşılık, birçok aksonlarda proksimal akson uçlarının, karakteristik "endbulbs" veya retraksiyon ampuller oluşturan büyüme konileri oluşturur, ve bunun yerine uzak onlar yaralanma 12-15 sonraki ay kalır yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. Primer aksonal hasara ek olarak, ek akson hasarı / kaybı da büyük ölçüde ilk yaralanma bağışladı akson oluşabilir. Başlangıçta bağışladı akson Bu gecikmiş akson kaybı gibi ikincil aksonal dejenerasyon denir. Yaralanma MSS akson Bu doğal tepki fonksiyonel aksonal rejenerasyon beyin ve omurilikte ulaşmak için daha da zor hale golü.
Ha ne kadaraksonal yaralanma (örneğin, sfero oluşumu, retraksiyon ampuller) ve llmarks iyi ölüm sonrası doku ve aksonal dejenerasyon deneysel modellerden karakterize edilmiştir, bu dinamik süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması sınırlı olmuştur. Bu çalışmaların çoğu doğal zamanla bireysel akson yanıtları yakalamak için başarısız statik uç nokta gözlemlere dayanıyordu. Gerçi dışsal olarak aksonal izleyiciler statik bölümlerden ve canlı görüntüleme sırasında aksonal yanıtları aydınlatmak için yararlı olmuştur uygulanan genetik olarak kodlanmış aksonal belirteçlerin kullanılabilirliği floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak aksonlar görselleştirmek için yeteneğimizi oldukça geliştirdi. Nitekim, Kerschensteiner ve meslektaşları bir seminal rapor ilk spinal dorsal sütunları kendi projeksiyonlarını göndermek nöronların alt kümelerinin yeşil floresan proteinini kodlayan Thy1 GFP-S fareleri kullanarak in vivo aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon doğrudan kanıt sağladıkord 16. Canlı görüntüleme iki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM) kullanarak yaklaşımları ve ilgi hücrelerin genetik floresan protein etiketleme gibi aksonal dejenerasyon, Ca 2 + sinyalizasyon, aksonal rejenerasyon, astrosit fizyolojisi gibi birçok farklı dinamik süreçlere doğrudan kanıt ve mekanik anlayış vermeye devam mikrogliyal fizyolojisi ve yaralanma 17-25 yanıt.
Akson aksine, çok az gerçek zamanlı olarak yaralanma miyelin tepkilerinin bilinmektedir. Miyelin PNS CNS ve Schwann hücrelerinde oligodendrositler tarafından üretilen ve tutulan beyaz cevherin önemli bir bileşenidir. Miyelin akson yüzeyinin% 99 yalıtım ve böyle yaparak son zamanlarda Buttermore ark. 26 tarafından gözden hızlı ve verimli saltatory darbe yayılımını destekleyen bir yüksek direnç, düşük-kapasite koruyucu kaplama sağlar. Biz solvatokromik, lipofilik kullanmak yaralanma miyelin dinamik tepkisini yakalamak içinFloresan boya Nil kırmızısı 27. Bu hayati leke solvatokromik özellikleri fiziko-kimyasal ortamına 28,29 bağlıdır emisyon spektrumunun spektral vardiya izin verir. Bu özellikler axomyelinic yaralanma mekanizmaları anlamak için yararlıdır ve uygun seçilmiş dichroics ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntülendi veya spektral mikroskopi kullanılarak 27 çözülebilir. Örneğin, Nil Kırmızısı emisyon spektrumu mavi-kaydırılmış örneğin adipositler ve normal bir merkezi sinir sistemi miyelin (tepe emisyon ~ 580-590 nm) 27 bulunan bu gibi daha az polar lipid bakımından zengin ortamda bulunmaktadır. Buna karşılık, ~ 625 nm akson olarak oluşturulmuş endbulbs içinde bu hayati boyanın emisyon spektrumu zirveleri aksonal tepe kurumalarına 27 uğrarlar. Normal miyelin karşı endbulbs içinde özellikle bu spektral vardiya altında yatan kesin mekanizmalar belirsiz kalmasına rağmen, bu tür spektral değişiklikler, protein birikimi veya dağınıklığı yol altında yatan değişiklikler gösterebilirhidrofobik bağlama bölgelerinin 27 maruz kalma.
In vivo görüntüleme kendi doğal ortamında omurilik aksonal yaralanma dinamiklerini gözlemlemek için nihai metrik iken, bu teknik açıdan zor ve önemli bir cerrahi uzmanlık gerektirir, ve sık sık (örneğin, inflamasyon ve yara deneysel eserler tanıtmak olabilir dorsal sütun açığa ameliyatları tekrar formasyonu). Buna ek olarak, pahalı ekipman genellikle mikroskop objektif mercek altında sağlam bir hayvanın süspansiyon ve konumlandırma izin vermek için gereklidir. hayvanlar dikkatle sıvılar doldurulan sağlamak için, nedeniyle uzamış anestezi görüntüleme oturumlara hipoksi hiçbir işaret olmadığından emin olmak için, sıcak kalmasını sağlamak için de izlenmesi gerekir. akson ve miyelin kesinlikle canlı kalması için sürekli perfüzyon ve yeterli oksijen seviyelerini gerektiren ikinci derece önemlidir. Ancak, bu genellikle bildirilen veya in vivo çalışmalar çoğu izlenmeztarihi. Buna ek olarak, kalp hızı ve solunum için hareket eserler (izofluran yetişkin fare anestezi: ~ dakika başına 300-450 atım (BPM)% 97-98 oksijen doygunluğunu (Normal oranı ~ 632 BPM) ve korumak için en uygunudur ~ 55-65 nefes dakika başına kaçınılmaz bu hareketin tabidir sırasıyla)) 30 bile hızlı lazer taramaları zorlu yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında karşılaşılan (Normal oranı ~ 163 dk başına nefes olduğunu) eserler. Uyanık hayvanlarda kemirgen omurilik görüntüleme izin verebilir bir implante sert vertebra çerçeveli pencere ile kombine ultra hızlı rezonans tarayıcıları gelişmeler, ancak daha hızlı tarama kez kaçınılmaz gürültü oranı aşağılayıcı görüntü kalitesi sinyali azaltır. Şu anda beyin görüntüleme için kullanılan spinal kord görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler daha fazla bu engellerin birçoğu üstesinden gelmek ve ina tarafından tanıtıldı potansiyel boşa sınırlayabilirdequate doku perfüzyon, örneğin, 31-33.
Beyaz cevher fizyolojisi ve beyaz cevher hasarı mekanizmaları hakkında bildiklerimizin çoğu vitro veya optik sinir, periferik sinir ve omurilik beyaz madde 34-41 şeritler beyaz madde ex vivo hazırlıklarında kullanılarak tespit edilmiştir. Çevresel faktörler değişiklikleri, canlı doku uyuşturucu ve reaktiflerin kontrollü uygulama, elektrofizyoloji kullanarak fonksiyonel değerlendirmeler ve akson doğrudan floresan mikroskop gözlemleri ve miyelin kontrollü izin gibi bu hazırlıklar beyaz cevher hasarı mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için devam ediyor. Ancak, daha önceki bazı yaklaşımlar kaçınılmaz yakından karşı akson yanıtı etkileyebilir çıkarma aşamasında yüzey aksonları zarar omurilik dorsal kolon şerit veya ventral beyaz cevher şeritler aksonlar gözlemlemek için. Yukarıdaki deneysel manipülasyonlar yararlanmak ve A.Ş. zarar görmemesi içinomuriliğin dorsal doğrudan temasını engeller soruşturması kapsamında ry lifler, biz bir ex vivo servikal spinal kord modeli kullanın. Böylece, pia mater ve komşu yüzeysel dorsal kolon akson mimarisi izolasyonu sırasında canlı ve soğukkanlı kalır.
Yaralanma sonrası 10+ saat - İşte onlar dinamik 8 gerçek zamanlı bir odak yaralanma cevap olarak, merkezi miyelinli akson doğrudan görselleştirme sağlar nispeten basit bir yaklaşım açıklar. Lazer kaynaklı omurilik yaralanması (Lisci) modeli mekansal zamanla kısıtlı kalır primer lezyon (ablasyon sitesi) gibi birincil ve ikincil aksonal yaralanma mekanizmaları arasındaki farklılaşmayı izin verir. açık banyo görüntüleme odası terapötik müdahale, reaktif teslimat ve çevre manipülasyonlara erişilebilir. Putatif axomyelinic koruyucu maddeler hızla doku sürecini kapsayan uzun ve masraflı deneyler karşı doğrudan gözlemlerle gerçek zamanlı olarak değerlendirilebiliring, bu nedenle, immün, görüntü yakalama ve analiz kesit ve canlı hayvanlarda deneysel maddeleri test etmeden önce akut yanıtları ve koruyucu manipülasyonlar değerlendirmek için yararlı bir vekil model sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri Federal düzenlemelere bağlı kalarak, Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde gerçekleştirildi.
Düşük Ca 2+ ve 2 mM Ca 2 + Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (aCSF) 1. hazırlanması guruplarına
- Tablo 1'de açıklandığı gibi 2x düşük Ca 2 + (0.1 mM) Stok C tampon, 2x, normal Ca 2 + (2 mM) Stok bir tampon ve 2x Stok B tampon hazırlayın. Bireysel stok solüsyonları iyon içeriği değiştirilmesine izin (örn, düşük ya da sıfır, Ca + 2) ve bir aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Diseksiyon sırasında intrakardiyak perfüzyon için, 1x düşük Ca 2+ aCSF yapmak için plastik bir şişenin içine 2x düşük Ca 2 + Stok C 100 ml ve 2x Stok B 100 ml ekleyin. Mix ve 4 ° C'de gece boyunca saklamak veya taze yapmak.
- Imag sırasında ex vivo olarak omuriliğin perfüzyon içining 1x aCSF oluşturmak için bir 1 L'lik bir cam şişe içine 2 x normal bir Ca + 2 Hazır A 500 ml ve 2 x stok B 500 ilave edin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında gece boyunca depolamak ya da taze olun.
- 7.4 aCSF tampon pH ayarlayın. Oda sıcaklığında aCSF tutarken, buz üzerinde düşük Ca 2 + aCSF yerleştirin ve kabarcık karbojen gazı ile iki tampon (% 95 O2;% 5 CO2) 30 dakika önce, perfüzyon sırasında sürekli olarak kullanmak için.
Ex Vivo Görüntüleme Odası 2. Hazırlık
- ACSF şişe etrafında bir ısıtma battaniye (hayır otomatik kapanır) sarın ve düşük / orta ayarda ısı ayarlayın.
- Şekil 1A 'da gösterildiği gibi iki kutuplu bir sıcaklık kontrol ve geri besleme sıcaklık probu vasıtasıyla kontrol edilir ısıtıcı bir perfüzyon pompaya ve hat-içi bağlı şişe içine özel bir CSF perfüzyon hattı yerleştirin.
- 2-foton uyarma / conf düz bir mikroskop sahne eki (152 x 102 mm) takınocal mikroskop sahne bir dökülme kabı ile donatılmış.
- Büyük bir açık-banyo perfüzyon odasına yerleştirin (G x U x Y; 12 x 24 x 8 mm) dökülme kabına (uygun ex Şekil 1B görmek uyum ve ex vivo omurilik taze oksijenli aCSF sürekli akışını sağlamak için ) odası tasarımı görüntüleme vivo.
- Uygun boru kullanılarak ex vivo görüntüleme odasının giriş-line ısıtıcının metal çıkış portuna bağlayın. Görüntüleme sırasında tampon / doku sıcaklığını korumaya yardımcı olmak için, ex vivo görüntüleme odasının altında ince bir emici pedi yerleştirin.
- Çıkarılabilir yapışkan yapışma kullanarak dökülme konteyner / sahne ucun altına ex vivo görüntüleme odasına uyun. yapışkan tack malleability AMAÇ ışık yolu doku yüzeyine dik olduğundan emin olmak için gerektiği gibi odası ayarlanır sağlayacaktır. Gerekirse, bölme ayarlamak için bir daireye düzeyini kullanır.
- Güvenli birbölmesi sıvı girişinin yakınına, ısıtıcısı geri besleme sıcaklık probu ve oda çıkışında bir elektrik hattına bağlı bir paslanmaz çelik emme tüpü. Manyetik bant ve uygun mikropipet sahipleri, bu bağlamda da faydalıdır. Vakum kaynağı açın.
- Oksijenli aCSF ile görüntüleme odasını dolduran başlamak için perfüzyon pompası açın. Dakika başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlayın.
- Vakum hattı ayarlayarak görüntüleme odasında aCSF düzeyini kontrol eder. Bu omurilik kesimi kapsayacak ve su daldırma objektif ve doku yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesi sağlamak için görüntüleme odasının yeterli aCSF olması önemlidir. Doku segmenti tamamen için deneyci kaynaklı eserler önde gelen taze oksijenli aCSF altındayken değilse miyelin ve akson zararlı etkilenebilir.
- Görüntüleme odasında o perfüzyon sıcaklığı oda sıcaklığına yakın yani in-line ısıtıcı sıcaklık kontrolörü ayarlayın.
- Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi sodyum pentobarbital (200 mg / kg) aşırı dozda enjekte edilerek bir yetişkin, 6-10 haftalık thy1 -YFP transjenik fare (Dorsal kök ganglion nöronlarının floresan protein ekspresyonu sahip kullanılması uygun suş) ile öldürülür.
- Bir kez anestezi seviyesinin doğru (örneğin, ayak tutam ve göz kırpma refleksinin kaybı yok reaksiyon), dikkatle cerrahi makası ile omurilik ve beyin örten cilt tıraş altında. Betadin ve% 70 etanol yastıkları kullanarak cildi temizlemek.
- % 70 etanol ile göğüs / karın alan Sprey, daha sonra soğutulmuş, karbojen-kabarmış düşük Ca kullanarak transkardiyal konuyu serpmek 2+ aCSF. (Bakınız Şekil 1C önerilen diseksiyonu tezgah üst kurmak).
- Karaciğer sönük kalır gibi, küçük bir klip kullanarak kalbin içine perfüzyon iğne sabitleyin. Traş dorsal yüzü erişmek için konu üzerinde çevirinkonu ve% 70 etanol ile traş bölgeyi silin.
- Beyin ve omur sütunu (Şekil 2A) maruz diseksiyon makas kullanarak kalça burun başlayarak orta hat boyunca dorsal cilt kesi yapmak. Burun ve kalça de işaretçilerine koyarak hazırlık sabitleyin.
- Bu noktada bir diseksiyon mikroskop kullanarak, sıkıca koku ampuller düzeyinde kafatasının dorsal yüzeyi boyunca kesti. Kesi lateral kenarları içine makas ipuçlarından birini yerleştirin ve bilateral beyincik kadar takke kenarlarında kesilmiş.
NOT: diseksiyon boyunca omurilikten örten doku kaldırmak için daha sonra gerekli gibi tamamen takke tüketim etmeyin (Şekil 2B bakınız). - Beyin maruz takke kaldırın. Yavaşça (beyincik bulunan) interparietal kemik sol ve sağ kenarları kesilmiş ve (beyin sapı / omurilik maruz kaudal geri Şekil 2C çekin
- Masa yüzeyine 45 ° açıda ince uçlu makas kullanın ve posterior sinir köklerine ikili sadece alt vertebra kesti.
NOT: Parlak beyaz dorsal sütunları ile temastan kaçının. Bu lifler (Şekil 2B) yansıması olacak ve kolayca zarar görebilir olanlardır. - Keser omuriliği ortaya çıkarmak için yapılır gibi yavaşça tek parça örten doku çekerek, ince uçlu forseps ile vertebral kolonun takke ve dorsal yüzeyini kaldırın. Sonraki görüntüleme (Şekil 2E) servikal kord 1-2 cm'lik bölümünü izole etmek üst torakal düzeyde vertebra kesmeye devam.
- Sütununun altında vertebral kolon ve net dokuya doku / kemik paralel kesmek için makas kullanın. Mümkün olduğunca aynı seviyede bu kesim yapmak. Kord görüntüleme için seviyede olacak şekilde doku bölmesi içinde olmasını sağlayacak çok önemlidir.
- Geçmiş (beyin sapı transect için 11. neşter kullanıngracile fasikül liflerin) ve servikal spinal kord segmenti izole üst torakal düzeyde sonlandırma () Şekil 2F Bkz. Bu aynı iki noktada doku / kemik kesmek için makas kullanın. İzole doku kuyruk beyin sapı, servikal genişleme ve üst torakal spinal kord (Şekil 2G) kapsayan vertebral kolonun 2/3 içermelidir.
- Karbojen-kabarmış, soğutulmuş düşük Ca bir petri 2+ aCSF içine izole omuriliğe yerleştirin. Gerekirse bu çanak düz yatıyor kadar, omurganın altında doku kırpın.
- Ex vivo görüntüleme odasına izole belkemiğine aktarın ve 36 için 1 saat boyunca perfüzyon sıcaklık artışı - 37 ° C. Görüntüleme sırasında bu sıcaklığı korumak.
Nil Kırmızı Görüntüleme Odası ve Miyelin Etiketleme içine Ex Vivo Omurilik 4. Yerleştirme
- Dikkatle i vertebra sütun güvenliğiniUygun bir montaj dilim ile maging odası aşağı ince lycra parçacığı oluşan dikey ızgara platformu ile modifiye tutun (Şekil 3A görmek omurilik için yer sağlamak için ızgara platformu orta Konuları kaldırmak).
- (DMSO içinde 5 mM'lik bir stok ve süzüldü 0.22 um, 4 ° C, ya da karanlıkta -20 ° C'de 6 ay, 1 ay boyunca saklanabilir) Nil kırmızısı bir kısım çözülme. Sadece görüntüleme odasına Nil Kırmızı eklemeden önce, perfüzyon pompa akışını azaltmak ve odasında sıvı daima omuriliği kapsar emin olmak için vakum hattı ayarlayın.
- Kord (Şekil 3B) kaudal ucuna yakın görüntüleme odasına 5-10 ul Nil Kırmızı stok solüsyonu ekleyin. Yavaşça oda boyunca, Nil Kırmızısı karıştırmak için 1 ml pipet kullanın. Nil Kırmızı, sonra 1-2 dakika odasında kalmak geri vakum hattı koyun ve sürekli omuriliği serpmek için min başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlamak için izin ver.
- Dikkatle mikroskop sahne yükseltmeksuya daldırma hedefi odasında aCSF yüzeyinden yaklaşık 10 mm kadar ve omurilik segmentinin merkezi ve medial dorsal sütunlar üzerinde hedefi hizalayın. Hafifçe aCSF yüzeyine temas edene kadar yavaşça aşağıya hedefi getirmek için mikroskop burun parçası odak tekerleğini kullanın. Görüş alanı (Şekil 3C) içine dorsal sütunları odaklanmak bir epifluorescent ışık kaynağı kullanın.
TPLSM ve Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Fare Omurilik 5. Ex Vivo Görüntüleme (Lisci)
Not: arka damar ince yapılı fasikül elyafları gibi doku merkezi için yararlı bir marker sağladığını (sırt kök ganglion hücre gövdesinden çıkan ve T6 arasından çıkmak ve aşağıdaki omurilik orta hat boyunca), bu kan damarı paralel uzanır. kalın YFP + servikal dorsal kök projeksiyonları da lifler yükselmek gibi yararlı bir işaretleyici sağlamak ve Y yanal inmekKüçük bir çapa sahip olan AP + ince yapılı fasikül lifleri.
- Spinal kord dokusu uygun hizalanmış sonra, lazer tarama moduna geçiş artan gracile fasikül miyelinli liflerin temel görüntüleme gerçekleştirmek için. Hem YFP ve Nil Kırmızı heyecanlandırmak için, floresan emisyon izole etmek 950 nm dalga boyunda (~ bir 25X, 1.1 NA amacı çıkışında ölçülen 17 mW) ve uygun dichroics (DM) ve bant geçiren filtreler için ayarlanmış bir iki-foton lazer kaynağı kullanın fluorophores (biz sarı-turuncu, kırmızı ve genişletilmiş kanalları, sırasıyla içine YFP ve Nil Kırmızı ayırmak için, 525/50 DM560, 600/60 DM640 ve 685/70 kullanın).
- Akson fazla% 3 temel görüntüleme (30-60 dakika) sırasında aksonal sferoidler gösteriyorsa nedeniyle deneyci kaynaklı eserler hazırlık atın.
- 30.3X görüş alanını büyüterek bir Lisci indükleyin (bir ~ 20 mikron çapında ablasyon oluşturmak için). Dinle 800 nm lazer ve en ~ 110 mW için lazer gücünü artırmakÖrnek. Lifler tamamen transeksiyon sağlamak için görünüm lazer taramaları 5 tam alanını izin verin.
- (Numune, 2.08X de 950 nm, 17 mW) görüntüleme ayarlarına geri lazer ayarlarını değiştirerek Lisci onaylayın ve ablasyon görselleştirmek için doku tarayın. Ablasyon çapını doğrulayın ve birincil ablasyon aksonlar tamamen transeksiyon olduğunu (Şekil 3D bakınız). Yaralanma sonrası 8-10 + saat kadar yaralanma akson ve miyelin dinamik tepkisini kaydetmek için z yakalama ile birlikte mikroskop zaman atlamalı ayarlarını kullanın.
NOT: ablasyon eksik ise (yani, liflerin eksik yaralanması), şaşırmış olacak birincil ve ikincil yaralanma mekanizmalarının belirlenmesi gibi, hazırlık atın. Buna ek olarak, izole spinal kord segmentleri Lisci bağımsız doku hasarı orta sadece hafif 24 saat sonrası Lisci kadar görüntülü olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uygun bir canlılığı, izole korumak için gerekli kurmak laboratuar ve görüntünün Detayları ex vivo omurilik Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroskop ayarlanabilir darbeli femtosaniye lazer, uygun dicroics ve emisyon filtreleri ve bir su- ile donatılması gerekmektedir yüksek sayısal diyafram objektif lens daldırma (≥1.0). Diseksiyon sırasında omurilik canlılığını sağlamak için, prosedür izole akson membranlar 42 mühür için 2+ yeterli Ca veriyor soğutulmuş oksijenli düşük Ca 2+ aCSF varlığında yapılmalıdır. Aksi takdirde axolemma gelen miyelin ayrılması ve temel görüntüleme sırasında açıkça görünür aksonal sfero oluşumu da dahil olmak üzere axomyelinic hasara neden olabilir. Diseksiyon işlemi ve ex vivo omurilik izolasyonu Örnek görüntüsü, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Ardından izolasyon omurilik canlılık m,36-37 ° C sıcaklıkta tutulur oksijenli aCSF sürekli perfüzyonla aintained. miyelin boyama Nil kırmızısı 27,43, perfüzyon odasına ilave edilebilir, ve ince yapılı fasciculus'un temel çizgi kayıtlarından miyelinli aksonlar (Şekil 3) başlayabilir.
Ince yapılı fasikül miyelinli akson Örnek görüntüsü Şekil 4'te gösterilmiştir. Bazal koşullar altında timelapse TPLSM kayıtları akson boyunca büyük ölçüde sabit bir çapa sahip miyelin (Nil kırmızısı) 'de ensheathed paralel hizalanmış YFP + aksonlar ortaya koymaktadır. Birkaç aksonal sferoidler veya aksonal dejenerasyon diğer morfolojik işaretler mevcut. Varsayılan oligodendrosit hücre gövdeleri satır koyu turuncu (Şekil 4A) görünür, oysa nedeniyle Nil Kırmızı solvatokromik özellikleri ve miyelin lipid ve protein içeriği, miyelin sarı-turuncu lekeli. Böyle Ranvier düğümleri olarak ince detayları da (örneğin, oklar çözülebilir Lisci Aşağıdaki 10 dk, ablasyon sitesine rostralinde ve kaudal bulunan hemen transected aksonlar (birincil yaralanma) uzakta yaralanma sitesinden geri başlar ve şişmiş balon miyelin içinde sigmoidal gibi bobinler oluşturur. Ablasyon uzak aksonlar ensheathing miyelin bu zaman noktasında değişmeden görünür. Onlar lezyon yerinde (Şekil 4B) den geri olarak 40 dk sonrası Lisci en temel transected akson ve ikincil dejenerasyon geçiren aksonlar tarafından (yani başlangıçta hakaret ama daha sonra dejenere kurtulmuş) karakteristik endbulbs oluştururlar. Proksimal segmenti ilk şişer, aksonal sferoidler oluşturur, ve sonunda akson 43 birkaç düzensiz uzunluklarda akson transekt nerede yaklaşık bu transected akson üçüncü pan-parçalanma tabi. Akson (peri-aksonal şişme) ve miyelin dejenerasyonu veziküler gelen miyelin ayrılması da açıktır. Zamanla, birincil ve ikincil transected aksonlar uzakta lezyon sitesinden geri çekilmeden devam hemen ablasyon sitesini kuşatan aksonlar ikincil dejenerasyona maruz ve peri-aksonal şişme şişme miyelin ve veziküler dejenerasyon yanı sıra daha belirgin hale gelir (Şekil 4D-G, ayrıca 43 bakınız). Aksonal retraksiyon ölçüde net bir fark proksimal aksonal kütükleri (lezyon kaudal) ve Wallerian dejenerasyon (Şekil 4D-G) geçmesi mukadder onların uzak kesimleri (lezyon rostralinde) arasındaki belirgin hale gelir. Aksonlar başlangıçta tabi Lisci tarafından bağışladı gecikmeli ikincil dejenerasyon (Şekil 4H). LISCI olmayan temsili bir kontrol deneyi, (en çok 13 saat, bu örnekte kordon izolasyonu sonra) uzun görüntüleme seansları beyaz madde bütünlüğü yan etkilere neden olmadan mümkün olduğunu göstermektedir (Şekil 4I, J). Temsilci yüksek rezonansLISCI sonra axomyelinic değişikliklerin dökülmesinden görüntüsü Şekil 5'te gösterilmektedir. Lisci sonra 3 saat olarak, birçok proksimal (kaudal) aksonlar uzakta uzakta akson ayrılmış olan şişmiş miyelin tüpler içinde kalması lezyon sitesinden geri gelmiş. Diğer aksonal endbulbs miyelin (Şekil 5A) tarafından şapkalı görünmektedir. Diğerleri etkilenmemiş görünen ise ablasyon sitesine bitişik aksonlar ikincil dejenerasyona maruz. YFP akson içinde düşük / negatif varsayılan veziküller (soluk mavi) ve aksonal endbulbs de mevcuttur. Bunun aksine liflerin geri çekilmesi kaudal için, 3 saat sonra-LISCI en rostral geri çekme aksonal endbulbs ve parçacıklarının çoğunluğunun güçlü Nil Kırmızısı ile etiketlenir akson (Şekil 5B) içinde çevresel bir değişikliğin göstergesidir (daha az mavi kaymıştır). Nil aktif retracting akson içinde alanlar ağırlıklı olarak çevreleyen veya akson çekirdek kap görünen Kırmızı-etiketli. Hassas konum ve ide rağmenBu intra-aksonal Nil kırmızısı etiketli yapılar ntity bilinmemektedir, bunlar aksonal taşıma ve / veya hidrofobik çekirdek 27 açığa ayrıldı proteinleri ile yoğun vezikül birikimi temsil edebilir. Nil Kırmızı etiketli miyelin ağırlıklı, normal görünen miyelin sarı-turuncu kalır. Farklı olarak, Nil Kırmızı (yani mavi kaymıştır) bu yapıların içinde çevresel değişikliklerin göstergesi veziküler miyelin sarı görünür sondalandı. Lisci aksonlar uzakta lezyon sitesinden geri çekilmeden devam sonra 7 saat ile; Bununla birlikte, bu kuyruk (Şekil 5C) endbulbs karşı rostral (Şekil 5D), daha da belirgindir. Diğer aksonlar boş miyelin tüpü veya birkaç mikron uzaklıkta dejenere segmentinden ince bir sap bırakarak tam veya kısmi parçalanmayı tabi. Lisci sonra Nil Kırmızı Gecikmeli uygulama Nil Kırmızı ön uygulama olarak benzer aksonal etiketleme ablasyon başına ve protein denatürasyonu potansiyel termal etkiler olduğunu düşündürür ortaya koymaktadırYaralanma sonrası miyelin ve akson Nil Kırmızı spektral vardiya (Şekil 5E, F) sorumlu olası. Toplu olarak bu veriler, gerçek zamanlı olarak, akut axomyelinic yaralanma iyi bilinen, ancak tam olarak anlaşılamamıştır mekanizmaları taklit etmek için ex vivo olarak LISCI modelinin yararını göstermektedir. Bu nedenle bu model beyaz cevher hasarı patofizyolojisi bilgimizi ilerletmek için yararlı olabilir, ve beyaz cevher bütünlüğünü korumak için önemli moleküler hedefleri ortaya çıkarabilir. 
Şekil 1: diseksiyon ve görüntüleme kurulum bakış. (A), omurilik ex vivo görüntüleme için kurulumu önerdi. Gerekli önemli ekipman karbojen-bub sunmak için bir perfüzyon pompası aCSF, oksijeninin bir karbojen (% 95 O 2 /% 5 CO 2) gaz hattını kapsamaktadırbir sıcaklık geri besleme probu ile donatılmış bir in-line ısıtıcı / sıcaklık kontrol cihazı, ve bir vakum kaynağı ile donatılmış bir açık banyosu tasarlanmış görüntüleme odası içinden aCSF kan alındı. (B), görüntüleme banyosu odasının Daha fazla büyütülmüş bir gösterilmiştir. (C) perfüzyon ve ex vivo omurilik diseksiyonu için önerilen set-up. Soğuk düşük Ca 2 + aCSF karbojen ile oksijenli ve diseksiyon sırasında omurilik canlılığını korumak için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2:. Görüntüleme için omuriliğe İzolasyonu (A) Sürekli soğutulmuş, oksijenli düşük Ca altında skul perfüzyon 2+LCAP maruz kalmaktadır. (B) bir kesi koku ampuller (kesikli çizgi) seviyesinde kafatasının dorsal yüzeyi ile yapılır. yavaşça olabilir kadar (C) İkili kesiler daha sonra takke yanal sınırları ile yapılır kaldırdı ve beyin sapı maruz (ok yönünde) kaudal çekti. (D) dorsal sütunları omurların yan yönlerini kesmek ve ortaya çıkarmak için ince uçlu makas (ok başı) ile ikili kesiler devam. (E) maruz omuriliğin üst torakal segmente beyin sapı ve tüm servikal genişleme gösterilmiştir. (F) bir sayı 11-neşter bıçağı ile iki kesiler gracile fasikül aksonal sonlandırmaları ve üst torakal seviyede (ötesinde, beyin sapı de omuriliği izole yapılır kesik çizgiler). (g) izole omurilik sonra soğutulmuş, düşük Ca içeren bir petri tabağına aktarılır 2+ CSF ile kabarcıklar halindekarbojen gazı. Servikal dorsal köklerin (örneğin, ok uçları), dorsal kök ganglion ve beyin sapı (~ 15-20 mm) üst torakal segmentte spinal kord sağlam kalır. G Ölçek çubuğu:. 2 mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. 
Şekil 3:. Ex vivo omurilik Görüntüleme (A) kez odasına yerleştirilen, omurilik dokusu değiştirilmiş doku / dilim Lycra parçacığı ile donatılmış basılı tutun kullanılarak sabitlenir (B) miyelin leke Nil Kırmızı doğrudan eklenir. görüntüleme odası. (C) suya daldırma hedefi aCSF batırılan ve gracile fasikül lifleri üzerinde konumlandırılmış. 
Şekil 4:. Merkezinden miyelinli akson yaralanması TPLSM bölgesinin LISCI modeli LISCI (*) aşağıdaki akson ve miyelin tepkilerinin dinamiklerini için kullanılmıştır. Temsilcisi görüntüleri 25X ile donatılmış Nikon A1RMP + multiphoton / konfokal mikroskop ile 0.24 mm / piksel yakalanan beş 1 mikron kalınlığında optik kesitler maksimum yoğunluğu projeksiyonları olarak gösterilir; NA: 1.1; WD: 2 mm suya daldırma hedefi. Dichroics ve emisyon filtreleri standart YFP + aksonlar (525/50 DM560, mavi gösterilir) ve solvatokromik lipofilik floresan boya Nil R ayırmak için kullanıldıemisyon kanalları (kırmızı ile gösterilen 685/70 nm) kısa (yeşil gösterilen 600/60 DM640) ve daha uzun içine ed. Adı geçen son iki filtre kombinasyonları farklı fiziko-kimyasal ortamlarda, Nil Kırmızısı en bilinen spektral vardiya yakalama olarak avantajlıdır. bazal koşullar akson (A) (YFP +, mavi) ve miyelin (NR, sarı-turuncu) normal olarak birkaç küremsi veya yönlendirilmiş görünür axomyelinic yaralanma diğer işaretler. Beyaz cevher oligodendrositler (NR, koyu turuncu, örneğin ok uçları) karakteristik morfolojisi ile glia Satırlar da (bazı netlik için işaretli) görünür ve bu Ranvier düğümleri olarak ince yapılar da (örneğin oklar) çözümlenir. (B) 10 At dk Lisci sonra, lezyonun rostralinde ve kaudal bulunan transected aksonlar şişmiş miyelin içinde uzak yaralanma sitesinden geri ve sigmoidal gibi bobinler (oklar) oluşmaya başlar. Ablasyon uzak aksonlar ensheathing miyelin bu zaman noktasında değişmeden görünür. (C) By 40 dk sonrası Lisci en temel transected akson ve lezyon yerinde (ok başları) den geri gibi ikincil dejenerasyon formu karakteristik endbulbs geçiren aksonlar. Bazı kesilen aksonları da akson (oklar) uzunluğu boyunca sferoidler oluştururlar. Akson (peri-aksonal şişme) ve miyelin veziküler dejenerasyonu miyelin ayrılması da (+). (DG). Zamanla, birincil ve ikincil yaralı aksonlar uzak geri çekilmeden yz projeksiyonlarına göre gösterilen devam lezyon sitesinden ve gibi açıktır Lisci bölgesinin ablasyon sahayı kuşatan başlangıçta bağışladı aksonlar ikincil dejenerasyon gecikmeli geçirmeyen (H Lisci önce sol paneli, orta panel 10 dakika sonrası Lisci ve Lisci sonra sağ panel 7 saat, beyaz noktalar ilk Lisci işareti, kırmızı noktalar işaret 10 dakika ve yeşil nokta ile akson kaybı) 7 saat ile akson gecikmiş ikincil dejenerasyon boyutunu göstermektedir. Peri-aksonal şişme sonraki zaman noktalarında sonrası Lisci daha belirgin hale gelir. ölçüde of aksonal retraksiyon ve proksimal akson uçlarının ve uzak kesimleri arasındaki aksonal endbulbs morfolojisi de görünür hale (Ayrıca yüksek büyütme görüntüleri için Şekil 5). Ölçek çubuğu:. 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. 
Şekil 5:. Lisci TPLSM sonra axomyelinic değişikliklerin Temsilcisi yüksek çözünürlüklü görüntüler 3 saatte yaralanma kaudal (A, C) ve rostral (B, D) değiştirir akson ve miyelin karmaşık detay yakalamak için kullanılan (A, B) ve 7 saat LISCI aşağıdaki gibidir (C, D). Temsilcisi görüntüleri üç 1 mikron kalınlığında optik kesitler maksimum yoğunluğu projeksiyonları olarak görüntülenirNikon A1RMP + multiphoton / konfokal mikroskop ile 0,0832 mm / piksel çekilen. şişmiş miyelin tüpler içinde Lisci (*), birkaç akson (mavi) lezyon yerinde uzak geri çekilmeden olan (büyük ok başları) (sarı-turuncu (A) Caudal ) aksonal endbulb uzak ayrılmış olması. Ablasyon sitesine bitişik Bazı aksonlar, diğerleri etkilenmez görünür ise ikincil dejenerasyon (küçük ok başları) tabi. YFP düşük / olumsuz varsayılan veziküller akson içinde (mavi soluk) ve aksonal endbulbs mevcut (oklar) vardır. Ranvier (n) bir merkez düğüm bu görüntüleme ve etiketleme tekniği kullanılarak da açıkça görülebilir. (B) aksine lifleri geri çekilmeden caudally için, 3 saat sonrası Lisci de rostrally geri çekme aksonal endbulbs ve parçacıklarının büyük çoğunluğu güçlü Nil ile etiketlenmiş Kırmızı (pembe). Geri çekme akson Nil Kırmızı etiketli alanlar ağırlıklı olarak etiketlenmiş aksonlar (mavi, büyük ok başları) çevreleyen veya kapak YFP görünür. Bu Nil Kırmızı-etiket doğası rağmenEd yapıları şu anda bilinmemekle birlikte, bu aksonal taşıma ve / veya hidrofobik çekirdek açığa ayrıldı proteinleri ile yoğun vezikül birikimi temsil edebilir. Farklı olarak, Nil Kırmızı eski içinde varsayılan çevresel değişikliklerin göstergesi veziküler miyelin (oklar) sarı, normal miyelin (sarı-turuncu) göre (yani spektrum değiştirdi mavi) belirir, etiketli. Peri-aksonal şişme da belirgin (küçük ok başları) 'dir. Lisci sonra 7 saat sonra, aksonlar lezyon yerinde uzak geri çekilmeden devam; Bununla birlikte, bu kaudal (C), endbulbs karşı rostral (D) 'de daha da belirgindir. Bazı aksonlar sırasıyla, (D küçük oklar) dejenere segmentinde birkaç mikron uzaklıkta boş bir miyelin tüpü (C ok) veya ince bir sap bırakarak tam veya kısmi parçalanmayı tabi. Nil Kırmızı Gecikmeli uygulama rostral santral miyelinli aksonlar (E ve F karşı kuyruğu benzer spektral vardiya üretir
| 2x Stok A (2 mM Ca 2+) | Reaktif | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCI | 6 | |
| CaCl2 • 2H 2 O | 4 | |
| 2x Stok B | NaH 2 PO 4 | 2.5 |
| MgSO 4 | 4 | |
| NaHCO 3 | 52 | |
| Dekstroz (D-glukoz) | 20 | |
| 2x düşük Ca 2+ Stok C (0.1 mM Ca 2+) | NaCl | 252 |
| KCI | 6 | |
| MgCl • 6H 2 O | 3.8 | |
| CaCl2 • 2H 2 O | 0.2 |
Tablo 1: yapay serebrospinal akışkan (CSF) tamponlar da kullanılabilir.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
