Abstract
Verletzte CNS Axone nicht zu regenerieren und oft zurückziehen von der Verletzungsstelle. Axone aus der anfänglichen Verletzung verschont später sekundärmetallurgisch axonale Degeneration. Mangel an Wachstumskegel Bildung, Regeneration, und der Verlust von weiteren markhaltigen Axonen Projektionen im Rückenmark stark einschränkt neurologische Erholung nach einer Verletzung. Um zu beurteilen, wie zentral myelinisierten Axone im Rückenmark, um Verletzungen zu reagieren, haben wir eine ex vivo lebenden Rückenmark-Modell unter Verwendung von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Axonen und eine Brenn und hoch reproduzierbare Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen zum Ausdruck bringen, um das Schicksal zu dokumentieren Axone und Myelin (lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nile Red) im Laufe der Zeit mit Zweiphotonenanregung Zeitraffer-Mikroskopie. Dynamische Prozesse wie akute axonale Verletzung, axonale Retraktion und Myelin-Degeneration sind am besten in Echtzeit untersucht. Doch die Nichtschwerpunkt Natur Prellung basierte Verletzungen und Bewegungsartefakte auftretenwährend der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Mikroskopie Herausforderung. Der Ex-vivo-Rückenmark-Modell hier beschriebenen imitiert verschiedene Aspekte der klinisch relevanten Prellung / Kompression induzierte axonalen Pathologie einschließlich axonalen Schwellungen, Sphäroidbildung, axonalen Durchtrennung und peri-axonalen Schwellungen ein nützliches Modell, um diese dynamischen Prozesse in Echtzeit zu studieren. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind ausgezeichnet räumlich-zeitliche Auflösung, die Differenzierung zwischen Primär- Beleidigung, die direkt verletzt Axonen und sekundären Verletzungsmechanismen ermöglicht; kontrollierte Infusion von Reagenzien direkt auf den Perfusat Bade das Kabel; präzise Änderungen der Umgebungsmilieu (zB Calcium, Natriumionen, bekannt Beitrag axonale Verletzung, aber praktisch unmöglich, in vivo zu manipulieren); und Maus-Modelle bieten auch einen Vorteil, da sie die Möglichkeit bieten, zu visualisieren und zumanipulieren genetisch identifizierten Zellpopulationen und subzellulärer Strukturen. Hier beschreiben wir, wie die Isolierung und das lebendige Bild Rückenmark von Mäusen, um die Dynamik der akuten axonalen Verletzungen zu erfassen.
Introduction
Degeneration von Axonen ist eine prominente Ursache für Morbidität über mehrere neurologischen Erkrankungen einschließlich Neurotrauma, Schlaganfall, Autoimmunerkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen. Im Gegensatz zu dem peripheren Nervensystem (PNS), Zentralnervensystem (ZNS) Axone haben eine begrenzte Kapazität zu regenerieren, sobald aufgrund sowohl intrinsische als auch extrinsische Barrieren (dh inhibitorische Moleküle axonale Wachstum während der Narbenbildung während der Myelindegeneration produziert und freigesetzt) 1 verletzt -7. Obwohl einige dieser Hindernisse wurden intensiv erforscht, therapeutische Interventionen Ziel, ZNS-axonale Degeneration verhindern, fördern robuste axonale Regeneration und Wiederherstellung funktions verbindend, begrenzt bleiben.
Axone einmal von ihren Soma getrennt durchlaufen eine stereotype Prozess der Degeneration wie Waller-Degeneration, die durch axonalen Schwellungen, Sphäroid Bildung und eventuelle Fragmentierung (in 8 mit Beiträgen) gekennzeichnet ist bekannt. InDagegen ist der proximale Stumpf, der in Kontinuität mit dem Soma eines durchtrennten peripheren Axonen bleibt, bildet eine Schwellung an seinem Ende, Matrizen zurück zur nächsten Knoten Ranvier, und kann dann zu initiieren Wachstumskegel Aufstellung für nachfolgende axonale Regeneration eine wichtige Voraussetzung erforderlichen 9-11. Im Gegensatz dazu sind die proximalen Enden von axonalen vielen zentralen Axone bilden charakteristische "endbulbs" oder Einfahren Glühbirnen, nicht zu Wachstumskegeln bilden, und statt zurückzuziehen von der Verletzungsstelle, wo sie für die Monate nach der Verletzung 12-15 bleiben. Neben der primären axonalen Schädigung, können zusätzliche axonalen Schäden / Verluste auch Axone, die im Wesentlichen aus der anfänglichen Verletzung verschont auftreten. Diese verzögerte axonalen Verlust zunächst verschont Axone wird als Sekundär axonale Degeneration bezeichnet. Diese inhärente Reaktion von ZNS Axone Schädigung macht funktionale axonale Regeneration noch schwieriger Ziel im Gehirn und Rückenmark zu erreichen.
Obwohl hallmarks der axonalen Schädigung (zB Sphäroidbildung, Rückzug Glühbirnen) wurden auch von post-mortem Gewebe und experimentellen Modellen der axonale Degeneration gekennzeichnet hat Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser dynamischen Prozesse sind beschränkt. Die meisten dieser Studien angeführten statischen Endpunkt Beobachtungen, die von Natur gescheitert einzelne axonalen Antworten über die Zeit zu erfassen. Obwohl exogen applizierten axonalen Tracern nützlich gewesen zu axonalen Antworten von statischen Abschnitten und während der Live-Bildgebung zu klären, hat die Verfügbarkeit von genetisch kodierten axonalen Marker stark verbessert unsere Fähigkeit, Axone in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. In der Tat, eine wegweisende Bericht Kerschensteiner und Kollegen zunächst vorgesehen unmittelbarer Nachweis der axonalen Degeneration und Regeneration in vivo mit Thy1 -GFP-S Mäuse, die das grün fluoreszierende Protein in Teilmengen von Neuronen, die ihre Projektionen in die Hinterstränge des Rücken senden kodierenKabel 16. Live-Imaging-Ansätze mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) und genetische fluoreszierende Protein Markierung von Zellen von Interesse nach wie vor direkte Beweise und mechanistischen Einblick in viele verschiedene dynamische Prozesse wie axonale Degeneration, Ca 2+ Signal, axonale Regeneration, Astrozyten Physiologie liefern, Mikroglia Physiologie und Reaktion auf eine Verletzung 17-25.
Im Gegensatz zu den Axonen ist sehr wenig von Myelin Reaktionen auf Verletzungen in Echtzeit bekannt. Myelin ist ein wesentlicher Bestandteil der weißen Substanz produziert und von Oligodendrozyten im ZNS und Schwann-Zellen in der PNS erhalten. Myelin isoliert 99% der Oberfläche von Axonen und dadurch eine hochohmige, kapazitätsarme Schutzabdeckung, die eine schnelle und effiziente saltatory Impulsausbreitung, die kürzlich von Buttermore et al. 26 überprüft unterstützt. Um die Dynamik von Myelin, um Verletzungen verwenden wir die solvatochromen, lipophile erfassenFluoreszenzfarbstoff Nile Red 27. Solvatochromen Eigenschaften dieses Vitalfärbung erlauben Spektralverschiebungen seines Emissionsspektrums, das von der physikalisch-chemischen Umgebung 28,29 ist. Diese Eigenschaften sind nützlich, um Einblick in die Mechanismen der axomyelinic Verletzungen zu gewinnen und können mit entsprechend ausgewählten dichroitische und Emissionsfilter sichtbar gemacht oder gelöst mit spektralen Mikroskopie 27 werden. Zum Beispiel ist Nilrot Emissionsspektrum blau-verschoben in weniger polare lipidreichen Umgebungen, wie sie in Adipozyten und normale CNS Myelin (Spitzenemission ~ 580-590 nm) 27 gefunden. Im Gegensatz dazu Emissionsspektrum Spitzen dieser Vitalfarbstoff ist bei ~ 625 nm in endbulbs wie Axone gebildet ziehen axonalen Sterben 27. Obwohl die genauen Mechanismen dieser spektralen Verschiebungen speziell in endbulbs gegenüber normalen Myelin unklar bleiben, können solche spektralen Veränderungen zugrunde liegenden Veränderungen der Proteinakkumulation oder Desorganisation, die zu enthüllenExposition von hydrophoben Bindungsstellen 27.
Während in-vivo-Bildgebung ist die entscheidende Messgröße für die Beobachtung des Rückenmarks axonalen Verletzungen Dynamik in ihrer natürlichen Umgebung, es ist technisch anspruchsvoll und erfordert erhebliche chirurgischem Know-how und oft wiederholen Operationen, um die dorsalen Säule, die experimentellen Artefakten führen kann ausgesetzt werden (zB Entzündungen und Narben Bildung). Außerdem ist teure Ausrüstung oft notwendig, um Suspendierung und Positionierung von einem intakten Tier unter der Mikroskopobjektivlinse ermöglicht. Die Tiere müssen sorgfältig überwacht werden, als auch, um sicherzustellen, bleiben sie warm, um sicherzustellen, Flüssigkeiten wieder aufgefüllt werden, und um sicherzustellen, gibt es keine Anzeichen von Hypoxie aufgrund längerer betäubt Imaging-Sitzungen. Letzteres ist äußerst wichtig, da Axone und Myelin unbedingt benötigen konstante Durchblutung und eine angemessene Sauerstoffgehalt lebensfähig zu bleiben. Dies ist jedoch oft nicht gemeldet oder in den meisten in-vivo-Studien zu überwachenDatum. Zusätzlich Bewegungsartefakte durch Herzfrequenz und Atmung (Isofluran erwachsenen Maus: ~ 300-450 Schläge pro Minute (BPM) ist optimal, um 97 bis 98% Sauerstoffsättigung (wie normal ~ 632 BPM) und pflegen ~ 55-65 Atemzüge pro min (normal ist ~ 163 Atemzüge pro min), beziehungsweise)) 30 während der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make begegnet differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie Herausforderung als auch die schnellsten Laserscans unvermeidlich unterliegen diese Bewegung Artefakte. Fortschritte in der ultraschnellen Resonanzscanner in Verbindung mit einem implantierbaren starren Wirbel gerahmte Fenster können Abbildung der Maus Rückenmark bei wachen Tieren zu ermöglichen, aber schnellere Scanzeiten zwangsläufig das Signal-Rausch-Verhältnis Bild erniedrigender Qualität. Weitere Verbesserungen in der Rückenmarksbildgebenden Verfahren, wie sie derzeit für die Bildgebung des Gehirns verwendet werden, können viele dieser Hindernisse zu überwinden und potenziellen verwechselt von ina eingeführt begrenzendequate Gewebedurchblutung, zB 31-33.
Vieles, was über der weißen Substanz Physiologie und Mechanismen der weißen Substanz Verletzungen bekannt wurde nach den in vitro oder ex vivo Zubereitungen der weißen Substanz von Sehnerv, der peripheren Nerven und Bänder des Rückenmarks weißen Substanz 34 bis 41 bestimmt. Diese Präparate weiterhin unser Wissen über weißen Substanz Verletzungsmechanismen zu fördern, da sie ermöglichen eine kontrollierte Veränderungen der Umweltfaktoren, kontrollierte Anwendung von Arzneimitteln und Reagenzien, Funktionsprüfungen mit der Elektrophysiologie und die direkte Fluoreszenzmikroskopie Beobachtungen der Axone und Myelin in lebendem Gewebe. Doch einige frühere Ansätze zur Axone Rückenmark dorsalen Säule Streifen oder ventralen weißen Substanz Streifen beobachten unweigerlich verletzen Oberfläche Axone während der Entfernungsstufe, die die Reaktion von eng gegen Axone beeinflussen können. Um auf die experimentelle Manipulationen oben zu nutzen und vermeiden Schäden an der very Fasern untersucht, verwenden wir eine ex vivo Halsmark-Modell, da es einen direkten Kontakt der Dorsalseite des Kabels verhindert. Somit ist die Architektur der Pia und neben oberflächlichen dorsalen Säule Axone tragfähige und gelassen bleiben, während der Isolierung.
Hier beschreiben wir eine relativ einfache Methode, die direkte Visualisierung von zentraler markhaltigen Axonen, da sie dynamisch mit einer Brenn Verletzungen in Echtzeit bis zu 8 reagieren können - 10+ Stunden nach der Verletzung. Die laserinduzierte Verletzung des Rückenmarks (Liščí) Modell erlaubt die Unterscheidung zwischen primären und sekundären axonalen Verletzungsmechanismen als primäre Läsion (Ablationsstelle) bleibt räumlich über die Zeit eingeschränkt. Die Open-Bad Abbildungskammer ist zugänglich für eine therapeutische Intervention, Reagenz Lieferung und Umwelt Manipulationen. Vermeintliche axomyelinic Schutzmittel lassen sich schnell in Echtzeit durch direkte Beobachtungen gegenüber langwierigen und kostenintensiven Experimenten mit Gewebeprozess bewertet werdening, Schneiden, Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse und daher eine nützliche Ersatzmodell zu akuten Reaktionen und Schutz Manipulationen vor der Prüfung die experimentellen Agenten mit lebenden Tieren zu bewerten.
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Protocol
HINWEIS: Alle Tierversuche wurden unter Leitlinien von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of Louisville gesetzt durchgeführt, um Bundesvorschriften einzuhalten.
1. Vorbereitung der Low Ca 2+ und 2 mM Ca 2+ Künstliche Liquor (aCSF) Perfusaten
- Bereiten 2x niedrigen Ca 2+ (0,1 mM) Auf C-Puffer, 2x Normal Ca 2+ (2 mM) Auf A-Puffer und 2x Auf B-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben. Die einzelnen Stammlösungen erlauben Modifikation der Ionengehalt (zB niedrig oder null Ca 2+) und kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.
- Für intra Perfusion beim Präparieren, 100 ml 2x niedrigen Ca 2+ Lizenz C und 100 ml 2x Lizenz B in eine Plastikflasche auf 1x niedrigen Ca 2+ aCSF machen. Mischen und über Nacht bei 4 ° C oder machen frisch.
- Für Durchblutung der ex vivo Rückenmark während imaging, fügen Sie 500 ml 2x Normal Ca 2+ Lizenz A und 500 ml 2x Lizenz B in einen 1 l Glasflasche auf 1x aCSF erzeugen. Mischen und über Nacht bei Raumtemperatur lagern oder kreiere frisch.
- Der pH-Wert von aCSF Puffer auf 7,4. Während die aCSF bei Raumtemperatur, legen Sie die niedrige Ca 2+ aCSF auf Eis und dann Luftblasen beide Puffer mit Carbogen Gas (95% O 2, 5% CO 2) 30 Minuten vor der während der Perfusion verwendet und kontinuierlich.
2. Herstellung von Ex Vivo Imaging Kammer
- Wickeln Sie ein Heizdecke (keine automatische Abschaltung) um den aCSF Flasche und stellen Sie Hitze zu niedrig / mittlere Einstellung.
- Legen Sie eine dedizierte aCSF Perfusionsleitung in die Flasche zu einem Perfusionspumpe und Inline-Heizung, die durch einen bipolaren Temperaturregler und Feedback-Temperaturfühler, wie in 1A gezeigt, gesteuert wird.
- Befestigen Sie einen Flachmikroskoptisch Einsatz (152 x 102 mm) mit dem 2-Photonen-Anregung / confocal Mikroskoptisch mit einem Überlaufbehälter ausgestattet.
- Stellen Sie ein großes Open-Bad Perfusionskammer (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) in den Überlaufbehälter zur Aufnahme und ermöglichen die kontinuierliche Zufuhr von frischer Sauerstoff angereicherte aCSF auf die Ex-vivo-Rückenmark (siehe Abbildung 1B nach einer geeigneten Ex- vivo-Bildgebung Kammer-Konstruktion).
- Schließen Metall Ausgangs-Port des Inline-Heizung bis zur Ex-vivo-Imaging-Kammer mit geeigneten Schlauch. Legen Sie ein dünnes absorbierendes Kissen unter dem Ex-vivo-Imaging-Kammer, um die Temperatur der Puffer / Gewebe während der Bildgebung zu halten.
- Beachten Sie die Ex-vivo-Imaging-Kammer, um den Boden des Überlaufbehälter / Bühneneinsatz mit abnehmbaren klebrig. Die Formbarkeit des klebrig ermöglicht je nach Bedarf, um sicherzustellen Lichtweg des Objektivs senkrecht zur Gewebeoberfläche der Kammer eingestellt werden. Verwenden Sie gegebenenfalls eine Bullseye Ebene, um die Kammer ein.
- Sicher einDurchlauferhitzer Feedback-Temperaturfühler in der Nähe der Kammer Fluideinlass und einem Stahlstutzen Edelstahl mit einer Vakuumleitung an die Kammer Steckdose angeschlossen ist. Magnetband und geeignete Mikropipette Halter sind in dieser Hinsicht nützlich. Schalten Sie die Vakuumquelle.
- Schalten Sie den Perfusionspumpe zu beginnen Füllung der Imaging-Kammer mit Sauerstoff angereichert aCSF. Stellen Sie die Perfusionspumpe 1,5-2 ml pro min.
- Regeln Sie die Lautstärke des aCSF in der bildgebenden Kammer durch Anpassung der Unterdruckleitung. Es ist wichtig, dass es genug aCSF werden im Abbildungsraum, um das Segment des Rückenmarks zu decken und ausreichender Arbeitsabstand zwischen einer Wassertauchobjektiv und der Gewebeoberfläche. Myelin und Axone können in Mitleidenschaft gezogen werden, wenn die Gewebesegment nicht vollständig in frischem sauerstoffreichem aCSF taucht, die zu Experimentator bedingte Artefakte.
- Stellen Sie die in-line-Heizung Temperaturregler, so dass Perfusat Temperatur in der Imaging-Kammer ist in der Nähe von Raumtemperatur.
- Euthanize ein Erwachsener 6-10 Wochen alte thy1 -YFP transgene Maus (Einsatz geeigneter Stamm, fluoreszierende Protein-Expression in Dorsalwurzelganglionneuronen hat) durch Injektion einer Überdosis des Narkose Natriumpentobarbital (200 mg / kg) über intraperitoneale Injektion.
- Einmal unter der richtigen Ebene der Anästhesie (zB keine Reaktion bis Fuß Prise und der Verlust der Blinkreflex), sorgfältig rasiert, die Haut über dem Rückenmark und Gehirn mit chirurgischen Schneidemaschinen. Reinigen Sie die Haut mit Betadin und 70% Ethanol-Pads.
- Spray Brust / Bauchbereich mit 70% Ethanol und dann durchströmen das Thema transkardial Verwendung gekühlt, Carbogen-sprudelte niedrigen Ca 2+ aCSF. (Siehe Abbildung 1C für vorgeschlagen Präparation Labortisch aufgestellt).
- Da die Leber verblasst, sichern Sie die Perfusion Nadel in das Herz mit einem kleinen Clip. Drehen Sie das Thema über die rasierte Rückenseite zugreifenGegenstand und wischen Sie die rasierte Fläche mit 70% Ethanol.
- Machen Sie eine dorsalen Hautschnitt entlang der Mittellinie ausgehend von der Nase bis zur Hüfte mit Dissektion Schere, um das Gehirn und der Wirbelsäule (2A) aus. Sichern Sie die Vorbereitung, indem Stifte an der Nase und Keule.
- Verwendung eines Dissektionsmikroskop von diesem Punkt an, fest auf der dorsalen Oberfläche des Schädels auf dem Niveau der Riechkolben geschnitten. Das eine Ende der Scherenspitzen in den seitlichen Kanten des Einschnitts und entlang den Rändern der Schädeldecke beidseitig bis Cerebellum geschnitten.
HINWEIS: Nicht ganz die Schädeldecke herauszuschneiden, wie es später benötigt wird, um die darüber liegende Gewebe aus dem Rückenmark in der gesamten Dissektion heben (siehe Abbildung 2B). - Heben Sie die Schädeldecke, um das Gehirn aus. Vorsichtig schneiden Sie die linken und rechten Rand des Inkabein (im Kleinhirn befindet) und ziehen Sie sie zurück nach kaudal um den Hirnstamm / Rückenmark freizulegen (2C
- Verwenden Sie feinen Spitzen Schere in einem 45 ° Winkel zur Tischoberfläche gehalten und schneiden Sie den Wirbel bilateral nur schlechter als die hinteren Nervenwurzeln.
HINWEIS: Kontakt mit den hellen weißen Hinterstränge vermeiden. Diese Fasern sind diejenigen, die abgebildet werden sollen (2D) und kann leicht beschädigt werden. - Heben Sie die Schädeldecke und Rückenfläche der Wirbelsäule mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig Ziehen des darüberliegenden Gewebe in einem Stück wie Schnitte gemacht werden, um das Rückenmark aus. Weiterhin Wirbel der oberen Brust Ebene geschnitten, um eine 1-2 cm Segment der Halsmark für die anschließende Bildgebung (2E) zu isolieren.
- Mit einer Schere das Gewebe / Knochen parallel zur Wirbelsäule und klare Gewebe unter der Spalte abgeschnitten. Nehmen Sie diese Schnitte möglichst waagerecht. Es ist sehr wichtig, dass das Gewebe flach in der Kammer, so dass das Kabel Ebene für die Bildgebung.
- Verwenden Sie einen # 11 Skalpell, um den Hirnstamm durchschneiden (VergangenheitKündigung der Fasciculus gracilis Fasern) und an der oberen Brustniveau, um das Segment Halsmark zu isolieren (siehe 2F). Mit einer Schere Gewebe / Knochen an eben diesen zwei Punkten schneiden. Die isolierte Gewebe sollte 2/3 der Wirbelsäule umfasst das Schwanzhirnstamm, Halsanschwellung und oberen Brustrückenmarks (2G) enthalten.
- Legen Sie die isolierten Wirbelsäule in eine Petrischale von Carbogen blasigen, gekühlt niedrigen Ca 2+ aCSF. Wenn nötig, schneiden Sie die darunter liegende Gewebe der Wirbelsäule, bis es in die Schüssel wieder glatt ist.
- Übertragen der isolierten Wirbelsäule zur ex vivo Abbildungskammer und allmählich das Perfusat Temperatur während 1 h erhöht, um 36 bis 37 ° C. Halten Sie diese Temperatur während der Bildgebung.
4. Vermittlung von Ex vivo Rückenmark in Imaging Chamber und Myelin Markierung mit Nile Red
- Die Wirbelsäule vorsichtig zu sichern in der i-maging Kammer mit einem geeigneten Beschlag Scheibe halten Sie mit einer vertikalen Grid-Plattform, bestehend aus feinen Fäden Lycra modifiziert (entfernen mittleren Fäden der Grid-Plattform, um Platz für das Rückenmark zu ermöglichen; siehe 3A).
- Tauwetter ein Aliquot Nile Red (5 mM Stamm in DMSO und 0,22 um gefiltert, kann für 1 Monat bei 4 ° C oder 6 Monate bei -20 ° C im Dunkeln gelagert werden). Unmittelbar vor Zugabe Nilrot zur Abbildungskammer, reduzieren die Strömung der Perfusionspumpe und Einstellen der Vakuumleitung, um sicherzustellen, das Fluid in der Kammer umfasst immer das Rückenmark.
- In 5-10 ul Nilrot Stammansatzes auf den Imaging-Kammer in der Nähe der Schwanz Ende der Schnur (3B). Verwenden Sie eine 1 ml Pipette vorsichtig mischen Nilrot in der gesamten Kammer. Lassen Nilrot in Kammer für 1-2 min zu bleiben, dann legen Sie Druckleitung zurück und stellen Perfusionspumpe auf 1,5-2 ml pro Minute kontinuierlich durchströmen das Rückenmark.
- Den Mikroskoptisch vorsichtig anhebenund Ausrichten des Ziels mit der Mitte des Rückenmarksegment und medial über die dorsalen Säulen, bis die Wasserimmersionsobjektiv ist ungefähr 10 mm von der Oberfläche des aCSF in der Kammer. Verwenden Sie die Mikroskopobjektivrevolver Fokus Rad, um das Ziel langsam senken, bis sie ihn leicht berührt die Oberfläche des aCSF. Verwenden Sie ein epifluoreszenten Lichtquelle, um die Hinterstränge in das Sichtfeld (Abbildung 3C) zu konzentrieren.
5. Ex-vivo-Bildgebung der Maus Spinal Cord mit TPLSM und Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen (Liščí)
HINWEIS: Die posteriore Vene ein nützlicher Marker, um das Gewebe wie die gracilis fasciculus Fasern zu zentrieren (stammen vom Zellkörper der dorsalen Wurzelganglien und steigen von T6 und unten entlang der Mittellinie des Rückenmarks) parallel zu dieser Blutgefäßes. Die dickeren YFP + Halsalgan Projektionen bieten auch ein nützlicher Marker wie die Fasern und abstiegs seitlich zur YFP + gracilis fasciculus Fasern, die im Durchmesser kleiner sind.
- Sobald das Rückenmarksgewebe wird entsprechend ausgerichtet, Schalter Laser-Scanning-Modus Basislinie Abbildung der aufsteigend Fasciculus gracilis markhaltigen Fasern durchzuführen. Um sowohl YFP und Nilrot erregt, mit einem Zwei-Photonen-Laser-Quelle auf 950 nm Wellenlänge (~ 17 mW, gemessen bei der Ausfahrt eines 25X, 1,1 NA-Objektiv) und geeignete dichroitische (DM) und Bandpassfiltern abgestimmt, um die Fluoreszenzemission zu isolieren der Fluorophore (wir verwenden 525/50 DM560, DM640 600/60 und 685/70, zu YFP und Nilrot in gelb-orange, rot und erweiterte Kanäle jeweils getrennt).
- Wenn mehr als 3% der Axone axonalen Sphäroiden während der Baseline-Bildgebung (30-60 min) zeigen, entsorgen Sie die Vorbereitung durch Experimentator bedingte Artefakte.
- Induzieren eine Liščí durch Vergrößerung des Sichtfelds zu 30.3X (einen Durchmesser Ablation ~ 20 & mgr; m zu erzeugen). Stellen Sie den Laser bis 800 nm, und erhöhen Sie die Leistung des Lasers auf ~ 110 mW beidie Probe. Lassen Sie 5 komplette Sichtfeld Laserscans, um sicherzustellen, Fasern vollständig durchtrennt werden.
- Bestätigen Liščí indem Lasereinstellungen auf Bildeinstellungen (950 nm, 17 mW bei der Probe, 2.08X) und scannen Sie das Gewebe, um die Ablation zu visualisieren. Überprüfen der Durchmesser der Ablation und die Primär ablatiert Axone vollständig durchtrennt (siehe Figur 3D). Verwenden Sie Zeitraffereinstellungen am Mikroskop in Kombination mit z-Capture, um die Dynamik der Axone und Myelin um Verletzungen bis zu 8-10 + h nach der Verletzung zu erfassen.
HINWEIS: Wenn der Ablation ist unvollständig (dh unvollständige Durchtrennung von Fasern), entsorgen Sie die Vorbereitung, die Bestimmung von primären und sekundären Verletzungsmechanismen wird verwechselt werden. Außerdem isoliert Rückenmarksegmente kann bis zu 24 Stunden nach der Liščí mit nur leichten abgebildet werden bis mittel Liščí unabhängige Gewebeschäden.
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Representative Results
Einzelheiten einer geeigneten Labor einrichten musste isolieren, halten die Lebensfähigkeit und die Bild ex vivo Rückenmark ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Mikroskop muss mit einem abstimmbaren gepulsten Femtosekundenlaser, entsprechende dicroics und Emissionsfiltern und einem wasser ausgestattet werden Eintauchen Objektivlinse mit einer hohen numerischen Apertur (≥1.0). Die Lebensfähigkeit des Rückenmarks während der Präparation zu gewährleisten, sollte das Verfahren in Gegenwart von gekühlten Sauerstoff angereichert niedrigen Ca 2+ aCSF, die genug Ca 2+ ermöglicht für die isolierten axonalen Membranen zu versiegeln 42 durchgeführt werden. Bei Nichtbeachtung kann axomyelinic Schäden, einschließlich Trennung von Myelin aus dem Axolemm und axonalen Sphäroidbildung während der Baseline-Bildgebung deutlich sichtbar verursachen. Repräsentative Bilder der Dissektion Prozess und die Isolierung des ex vivo Rückenmark ist in Abbildung 2 dargestellt. Nach der Isolierung der Überlebensfähigkeit des Rückenmarks ist mdurch kontinuierliche Perfusion von oxygeniertem aCSF, die bei 36-37 ° C gehalten wird aintained. Die Myelin Fleck Nilrot 27,43 kann dann auf die Perfusionskammer hinzugefügt werden, und Basislinienaufnahmen des Fasciculus gracilis myelinisierten Axone kann (Bild 3) zu beginnen.
Repräsentative Bilder der Fasciculus gracilis myelinisierten Axone sind in Abbildung 4 dargestellt. Unter Ausgangsbedingungen Zeitraffer TPLSM Aufnahmen zeigen parallel ausgerichteten YFP + Axone im Myelin (Nile Red) mit weitgehend konstanten Durchmesser entlang der Länge des Axons umhüllt. Wenige axonalen Sphäroiden oder andere morphologische Zeichen der axonale Degeneration vorhanden. Aufgrund der solvatochromen Eigenschaften Nilrot und der Lipid- und Proteingehalt von Myelin wird Myelin gefärbt gelb-orange wohinReihen putative Oligodendrozyten Zellkörper erscheinen dunkel orange (4A). Feine Details wie Knoten Ranvier kann auch gelöst werden (beispielsweise Pfeile Bei 10 Minuten nach LISCI unmittelbar trennten Axone (Primärschäden) angeordnet rostral und kaudal der Ablationsstelle zu beginnen, sich von der Verletzungsstelle zurückzuziehen und bilden sigmoidale artigen Spulen innerhalb gequollenen Ballon Myelin. Myelin einhüllenden Axone Fernbedienung, um die Ablation scheint unverändert zu diesem Zeitpunkt. 40 min nach Liščí meisten primären trennten Axone und Axonen unterziehen sekundärer Degeneration (also zunächst von der Beleidigung aber später degenerierten verschont) bilden charakteristische endbulbs wie sie sich aus der Läsionsstelle (4B) zu widerrufen. Etwa ein Drittel dieser trennten Axone unterziehen pan-Fragmentierung, wo die proximalen Segments ersten schwillt an, bildet axonalen Sphäroiden und schließlich durchschneidet das Axon in mehrere unregelmäßigen Längen von Axon 43. Die Trennung von Myelin aus den Axonen (peri-axonalen Schwellungen) und vesikulärer Degeneration von Myelin ist auch offensichtlich. Im Laufe der Zeit, primäre und sekundäre tranWindparkbetrieb Axone weiter entfernt von der Läsion Zurückziehen, Axone unmittelbar flankierenden Ablationsstelle ziehen sekundärer Degeneration und peri-axonalen Schwellungen wird mehr im Vordergrund als auch Myelin Schwellungen und Blasendegeneration (4D-G, siehe auch 43). Ein deutlicher Unterschied im Ausmaß der axonalen Retraktion zeigt sich zwischen dem proximalen axonalen Stümpfe (kaudal Läsion) und ihrem distalen Segmente (rostral Läsion), die dazu bestimmt sind, Waller-Degeneration (4D-G) unterzogen. Axone zunächst vom LISCI verschont laufen verzögerten sekundären Degeneration (4H). Eine repräsentative Kontrollexperiment ohne Lisci, legt nahe, dass lange Imaging-Sitzungen (bis zu 13 Stunden nach Kabel Isolation in diesem Beispiel) sind, ohne dass es negative Auswirkungen auf die Integrität der weißen Substanz möglich (4I, J). Vertreter Hoch resosung Bilder axomyelinic Veränderungen nach LISCI sind in 5 gezeigt. Von 3 h nach LISCI wurden mehrere proximale (caudal) Axone vom Läsionsstelle wo sie innerhalb gequollenen Myelin Rohre, die sich von dem Axon abgetrennt wurden, bleiben eingefahren. Andere axonalen endbulbs scheinen von Myelin (5A) begrenzt. Axone neben dem Ablationsstelle ziehen sekundären Degeneration, während andere davon unberührt erscheinen. YFP niedrig / negativen vermeintlichen Vesikel (hellblau) innerhalb des Axons und axonalen endbulbs sind ebenfalls vorhanden. Im Gegensatz zu kaudal Einfahren Fasern, die Mehrheit der rostral Einfahren axonalen endbulbs und Sphäroide bei 3 Stunden nach der Liščí stark mit Nile Red beschriftet (weniger blau verschoben), das eine Umweltveränderungen im Axon (5B). Nile Red-markierten Bereiche innerhalb der aktiven Zurückziehen Axone scheinen hauptsächlich umgeben oder begrenzen die axonalen Kern. Obwohl die genaue Lage und identity dieser intra-axonalen Nile Red-markierten Strukturen sind derzeit nicht bekannt sind, können sie dichten Vesikel Akkumulation über axonalen Transport und / oder gespalten Proteine setzen ihre hydrophoben Kern 27 zu repräsentieren. Nile Red beschriftet Myelin bleibt hauptsächlich gelb-orange in normal erscheine Myelin. Im Unterschied dazu Nilrot sondiert vesikulären Myelin erscheint gelb (dh blau verschoben), das Umweltveränderungen innerhalb dieser Strukturen. Mit 7 Stunden nach Liščí Axonen weiterhin Zurückziehen von der Läsion; jedoch wird dies deutlicher in rostral (5D) in Abhängigkeit von caudal (5C) endbulbs. Andere Axone unterziehen vollständige oder teilweise Auflösung Verlassen eines leeren Markröhre oder einen dünnen Stiel mehreren Mikrometern von der Degeneration Segment. Verzögerte Anwendung Nilrot nach Liščí zeigt ähnliche axonalen Kennzeichnung als pre-Anwendung Nilrot suggestiv, dass die Ablation an sich und potenzielle Auswirkungen auf die thermische Denaturierung von Proteinen istwahrscheinlich für die Nilrot spektralen Verschiebungen im Myelin und Axonen nach Verletzungen (5E, F) verantwortlich. Zusammen zeigen diese Daten veranschaulichen die Nützlichkeit der ex vivo LISCI Modell bekannt, aber schlecht verstandenen Mechanismen akuter axomyelinic Verletzungen in Echtzeit zu simulieren. Das Modell kann daher sinnvoll, die Kenntnisse über die Pathophysiologie der weißen Substanz Verletzungen weiter zu sein, und entdecken molekulare Schlüsselziele zur weißen Substanz Integrität zu bewahren. 
Abbildung 1: Überblick über die Präparation und bildgebenden Einrichtung. (A) Ein Vorschlag für Set-up für die Ex-vivo-Bildgebung des Rückenmarks. Die wichtigsten Geräte notwendig beinhaltet ein Carbogen (95% O 2/5% CO 2) Gasleitung, um die aCSF, mit Sauerstoff eine Perfusionspumpe die Carbogen-bub liefernentlüftet aCSF durch eine in-line Heiz- / Temperatursteuervorrichtung mit einer Temperatur-Feedback-Sonde ausgestattet, und eine offene Wanne ausgebildet Abbildungskammer mit einer Vakuumquelle ausgestattet. (B) eine höhere Vergrößerung des Abbildungs Badkammer gezeigt. (C) Ein Vorschlag für Set-up für die Perfusion und Dissektion der ex vivo Rückenmark. Chilled niedrigen Ca 2+ aCSF wird mit Carbogen Sauerstoff angereichert und verwendet werden, um die Lebensfähigkeit des Rückenmarks bei der Präparation zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. 
Abb. 2: Isolation des Rückenmarks für die Bildgebung (A) unter ständigem Heiz-, sauerstoff niedrigen Ca 2+ Perfusion der skullcap ausgesetzt ist. (B) wird ein Einschnitt durch die Rückenfläche des Schädels auf der Höhe der Riechkolben (gestrichelte Linie) hergestellt. (C) Bilaterale Einschnitte werden dann durch die seitlichen Ränder der Schädeldecke gemacht, bis es leicht sein hob und zog nach kaudal (in der Pfeilrichtung), um den Hirnstamm aus. (D) weiter bilateralen Einschnitte mit feiner Spitze Schere, um die seitliche Aspekte der Wirbel geschnitten und setzen die Hinterstränge (Pfeilspitze). (E) Die exponierte Hirnstamm und gesamte Halsanschwellung auf den oberen Brustsegment des Rückenmarks werden gezeigt. (F) zwei Schnitte mit einer Reihe 11-Skalpellklinge gemacht werden, um das Rückenmark im Hirnstamm isolieren, über die grazile fasciculus axonalen Kündigungen und oberen Brustniveau ( gestrichelte Linien). (G) Die isolierten Rückenmark wird dann auf eine Petrischale mit Kalt niedrigen Ca 2+ übertragen aCSF sprudelte mitCarbogen Gas. Cervical hinteren Wurzeln (zB Pfeilspitzen), Hinterwurzelganglien, und das Rückenmark von der oberen Brustsegment zum Hirnstamm (~ 15-20 mm) bleiben intakt. Maßstabsbalken in G:. 2 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. 
Abb. 3: Visualisierung der ex vivo Rückenmark (A) einmal in die Kammer eingebracht, wird die Rückenmarksgewebe mit einer veränderten Gewebe / Scheibe halten Sie mit Lycra Gewinde ausgestattet gesichert ist (B) Die Myelin Fleck Nilrot direkt mit aufgenommen. die Abbildungskammer. (C) Ein Wasserimmersionsobjektiv in die aCSF getaucht und in den Fasciculus gracilis Fasern positioniert. 
Abb. 4: Liščí Modell der zentralen markhaltigen Axonen Verletzungen TPLSM wurde verwendet, um die Dynamik von Axon und Myelinantworten nach Liščí (*) zu erfassen. Repräsentative Bilder werden als maximale Intensität Projektionen von fünf 1 um dicke optische Schnitte erfasst bei 0,24 um / Pixel mit einer Nikon A1RMP + Multiphotonen / Konfokalmikroskop mit einem 25X ausgestattet angezeigt; NA: 1,1; WD: 2 mm Wasserimmersionsobjektiv. Standard-Kaltlichtlampen und Emissionsfiltern wurden verwendet, um YFP + Axone (525/50 DM560, in blau dargestellt) und die solvatochromen lipophilen Fluoreszenzfarbstoff-Nil-R zu trennened in kürzere (600/60 DM640, grün dargestellt) und länger (685/70 nm, rot) Emissions Kanäle. Die letzteren beiden Filterkombinationen sind vorteilhaft, da sie zu erfassen Nilrot der bekannten spektralen Verschiebungen in den verschiedenen physikalisch-chemischen Umgebungen. (A) In Ausgangsbedingungen Axone (YFP +, blau) und Myelin (NR, gelb-orange) erscheinen in der Regel mit wenigen Sphäroide oder orientierte andere Zeichen der axomyelinic Verletzungen. Reihen von Glia charakteristische Morphologie der weißen Substanz Oligodendrozyten (NR, dunkelorange, zB Pfeilspitzen) sind ebenfalls sichtbar (der Klarheit halber einige markiert), und feine Strukturen, wie Knoten Ranvier werden ebenfalls gelöst (zB Pfeile). (B) bei 10 min nach LISCI, trennten Axone befindet rostral und kaudal zur Läsion beginnen im gequollenen Myelins entfernt von der Verletzungsstelle zurückzuziehen und bilden sigmoidale artigen Spulen (Pfeile). Myelin einhüllenden Axone fernen Ablation erscheinen unverändert zu diesem Zeitpunkt. (C) By 40 min nach Liščí meisten primären trennten Axone und Axonen unterziehen sekundärer Degeneration Form charakteristisch endbulbs, wie sie von der Läsion (Pfeilspitzen) zurückzuziehen. Einige trennten Axone bilden ebenfalls Sphäroide entlang der Länge ihrer Axone (Pfeile). Die Trennung von Myelin aus dem Axon (peri-axonalen Schwellungen) und vesikulärer Degeneration von Myelin ist auch offensichtlich, (+). (DG). Im Laufe der Zeit, primäre und sekundäre verletzten Axonen weiterhin Zurückziehen von der Verletzungsstelle, und wie von yz Projektionen gezeigt der Liščí zunächst verschont Axone flankierenden Ablationsstelle unterziehen verzögert sekundärer Degeneration (H, linken Bereich vor Liščí Mittelteil 10 Minuten nach der Lisci und rechten Feld 7 h nach Liščí; weißen Punkte markieren die Anfangs Lisci, roten Punkte zeigen die Verlust der Axone von 10 min und grünen Punkte zeigen das Ausmaß der Verzögerung sekundärer Degeneration von Axonen von 7 h). Peri-axonalen Schwellungen wird zu späteren Zeitpunkten nach der Liščí mehr im Vordergrund. Das Ausmaß of axonale Retraktion und Morphologie der axonalen endbulbs zwischen proximalen Axon Stümpfe und deren distalen Segmenten zeigt sich auch (siehe auch Abbildung 5 für Bilder mit höherer Vergrößerung). Maßstab:. 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. 
Abb. 5: Vertreter hochauflösenden Bildern von axomyelinic Änderungen nach Liščí TPLSM wurde verwendet, um komplizierten Details der Axon und Myelin erfassen ändert Schwanz (A, C) und rostral (B, D), um Verletzungen zu 3 Stunden (A, B) und 7 h (C, D) folgende Liščí. Repräsentative Bilder werden als maximale Intensität Projektionen von drei 1 um dicke optische Sektionenbei 0,0832 um / Pixel mit einer Nikon A1RMP + Multiphotonen / Konfokalmikroskop erfasst. (A) Caudal auf die Liščí (*), mehrere Axone (blau) von der Läsion entfernt Zurückziehen (große Pfeile) innerhalb geschwollene Myelin Rohre (gelb-orange ), die von der axonalen endbulb getrennt haben. Einige Axone neben dem Ablationsstelle ziehen sekundärer Degeneration (kleine Pfeile), während andere davon unberührt erscheinen. YFP niedrig / negativen vermeintlichen Vesikel (hellblau) innerhalb des Axons und axonalen endbulbs vorhanden sind (Pfeile). Ein zentraler Knoten Ranvier (n) ist ebenfalls deutlich sichtbar mit diesen bildgebenden und Markierungstechnik. (B) Im Gegensatz zu kaudal Einfahren Fasern, die Mehrzahl der rostral Einfahren axonalen endbulbs und Sphäroide nach 3 h nach LISCI stark mit Nile markierten Rot (Rosa). Nile Red-markierten Bereiche in den Rückzugs Axone scheinen hauptsächlich umgeben oder Kappe YFP Axone (blau, große Pfeilspitzen). Obwohl die Natur dieser Nile Red-Label-ed Strukturen ist derzeit nicht bekannt, so können sie dichten Vesikel Akkumulation über axonalen Transport und / oder gespalten Proteine setzen ihre hydrophoben Kern darstellen. Im Unterschied dazu Nilrot beschriftet vesikulären Myelin (Pfeile) erscheint gelb (dh Spektrum ist blau verschoben) im Vergleich zu normalen Myelin (gelb-orange), was auf eine vermeintliche Umweltveränderungen in der ehemaligen. Peri-axonalen Schwellungen zeigt sich auch (kleine Pfeilspitzen). Um 7 Stunden nach Lisci, Axonen weiterhin Zurückziehen von der Läsion; jedoch wird dies deutlicher in rostral (D) gegen die kaudale (C) endbulbs. Einige Axone unterziehen vollständige oder teilweise Auflösung Verlassen eines leeren Markrohr (Pfeil C) oder einen dünnen Stiel mehreren Mikrometern von der Degeneration Segment (kleine Pfeile in D) auf. Verzögerte Anwendung Nilrot zu ähnlichen spektralen Verschiebungen in Schwanz gegen rostral zentralen markhaltigen Axonen (E und F
| 2x Lizenz A (2 mM Ca 2+) | Reagens | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCl | 6 | |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 4 | |
| 2x Lizenz B | NaH 2 PO 4 | 2.5 |
| MgSO 4 | 4 | |
| NaHCO3 | 52 | |
| Dextrose (D-Glucose) | 20 | |
| 2x niedrigen Ca 2+ Lizenz C (0,1 mM Ca 2+) | NaCl | 252 |
| KCl | 6 | |
| MgCl • 6H 2 O | 3.8 | |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 0.2 |
Tabelle 1: Künstliche Liquor (aCSF) Puffer.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
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