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Neuroscience

एक Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

घायल सीएनएस axons पुनर्जन्म और अक्सर दूर चोट साइट से इनकार करने के लिए असफल। प्रारंभिक चोट से बच axons बाद में माध्यमिक axonal अध: पतन से गुजरना कर सकते हैं। रीढ़ की हड्डी के भीतर विकास शंकु गठन, उत्थान, और अतिरिक्त मेलिनकृत axonal अनुमानों के नुकसान की कमी के कारण बहुत चोट के बाद न्यूरोलॉजिकल वसूली की सीमा। रीढ़ की हड्डी के मेलिनकृत एक्सोन चोट का जवाब कैसे केंद्रीय आकलन करने के लिए, हम के भाग्य दस्तावेज़ करने के लिए पीले रंग फ्लोरोसेंट axons में प्रोटीन और एक केंद्र और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लेजर प्रेरित रीढ़ की हड्डी में चोट है कि एक्सप्रेस ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग रीढ़ की हड्डी मॉडल रहने वाले एक पूर्व vivo विकसित दो photon उत्तेजना समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग axons और समय के साथ माइलिन (lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक नील लाल)। ऐसी तीव्र axonal चोट, axonal त्याग, और माइलिन अध: पतन के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं का सबसे अच्छा वास्तविक समय में अध्ययन कर रहे हैं। हालांकि, कुचलन आधारित चोटों और आंदोलन कलाकृतियों की गैर फोकल प्रकृति का सामना करना पड़ाउच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी चुनौतीपूर्ण का उपयोग करते हुए प्राथमिक और माध्यमिक axonal चोट प्रतिक्रियाओं का फर्क में विवो रीढ़ की हड्डी इमेजिंग बनाने के दौरान। यहाँ वर्णित पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी मॉडल axonal सूजन, अंडाकार आकृति गठन, axonal transection, और वास्तविक समय में इन गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराने सूजन पेरी-axonal सहित नैदानिक ​​प्रासंगिक कुचलन / संपीड़न प्रेरित axonal विकृतियों के कई पहलुओं mimics। इस मॉडल का प्रमुख लाभ सीधे axons और माध्यमिक चोट तंत्र घायल कि प्राथमिक अपमान के बीच भेदभाव की अनुमति देता है कि उत्कृष्ट spatiotemporal संकल्प कर रहे हैं; सीधे perfusate स्नान की हड्डी को अभिकर्मकों के नियंत्रित अर्क; पर्यावरणीय परिवेश की सटीक परिवर्तन (जैसे, कैल्शियम, सोडियम आयनों, axonal चोट करने के लिए है, लेकिन असंभव के पास जाना जाता योगदानकर्ताओं विवो में हेरफेर करने के लिए); वे कल्पना करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं और murine मॉडल भी एक लाभ प्रदान करते हैं औरआनुवंशिक रूप से पहचान सेल आबादी और subcellular संरचनाओं में हेरफेर। यहाँ, हम अलग-थलग करने और छवि चूहों से रहने वाले रीढ़ की हड्डी की तीव्र axonal चोट की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए कैसे का वर्णन।

Introduction

Axons की अध: पतन neurotrauma, स्ट्रोक, स्व-प्रतिरक्षित, और neurodegenerative रोगों सहित कई स्नायविक शर्तों फैले रुग्णता का एक प्रमुख कारण है। परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन), केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विपरीत (सीएनएस) एक्सोन एक बार वजह से आंतरिक और बाह्य बाधाओं (यानी, माइलिन अध: पतन के दौरान निशान गठन के दौरान उत्पादन और मुक्त axonal विकास के लिए निरोधात्मक अणुओं) 1 दोनों को घायल पुनर्जीवित करने के लिए एक सीमित क्षमता है -7। इन बाधाओं के कई बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है, जिसका उद्देश्य उपचारात्मक उपायों, सीएनएस axonal अध: पतन को रोकने के मजबूत axonal उत्थान को बढ़ावा देने, और कार्यात्मक connectively बहाल करने के लिए, सीमित रहते हैं।

एक बार उनके सोमा से अलग axons axonal सूजन, अंडाकार आकृति गठन और (8 में समीक्षा) अंतिम विखंडन की विशेषता है कि Wallerian अध: पतन के रूप में जाना अध: पतन का एक टकसाली प्रक्रिया से गुजरना। मेंइसके विपरीत, एक transected परिधीय अक्षतंतु की सोमा के साथ निरंतरता में रहता है कि समीपस्थ स्टंप, बाद में axonal उत्थान के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त आवश्यक है, एक उसके अंत में सूजन रूपों वापस Ranvier के निकटतम नोड के लिए मर जाता है, और फिर विकास शंकु गठन आरंभ कर सकते हैं 9-11। इसके विपरीत, कई केंद्रीय axons की समीपस्थ axonal अंत, विशेषता "endbulbs" या त्याग बल्ब फार्म विकास शंकु फार्म, और इसके बजाय दूर वे चोट 12-15 के बाद महीने के लिए रहना जहां चोट की साइट से इनकार करने के लिए असफल। प्राथमिक axonal चोट के अलावा, अतिरिक्त axonal क्षति / हानि भी काफी हद तक प्रारंभिक चोट से बच रहे थे कि axons के लिए हो सकता है। शुरू में बख्शा axons की इस देरी axonal हानि के रूप में माध्यमिक axonal अध: पतन के लिए भेजा है। चोट के सीएनएस axons की यह निहित प्रतिक्रिया कार्यात्मक axonal उत्थान मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में प्राप्त करने के लिए एक और भी अधिक मुश्किल लक्ष्य प्रदान करता है।

हा यद्यपिaxonal चोट (जैसे, अंडाकार आकृति गठन, त्याग बल्ब) के llmarks अच्छी तरह से पोस्टमार्टम ऊतक और axonal अध: पतन की प्रयोगात्मक मॉडल से विशेषता किया गया है, इन गतिशील प्रक्रियाओं अंतर्निहित आणविक तंत्र की व्याख्या प्रतिबंधित कर दिया गया है। इन अध्ययनों के अधिकांश स्वाभाविक समय के साथ अलग-अलग axonal प्रतिक्रियाओं पर कब्जा करने में विफल रहा है कि स्थिर समापन बिंदु टिप्पणियों पर भरोसा किया। हालांकि exogenously axonal ट्रेसर स्थिर वर्गों से और लाइव इमेजिंग के दौरान axonal प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी किया गया है आवेदन किया है, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग axonal मार्कर की उपलब्धता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग वास्तविक समय में axons कल्पना करने के लिए हमारी क्षमता में सुधार की बहुत गया है। दरअसल, Kerschensteiner और उनके सहयोगियों से एक लाभदायक रिपोर्ट पहले रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय कॉलम में उनके अनुमानों भेज कि न्यूरॉन्स के सबसेट में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि Thy1 -GFP-एस चूहों का उपयोग vivo में axonal अध: पतन और उत्थान के प्रत्यक्ष सबूत प्रदान कीकॉर्ड 16। , लाइव इमेजिंग दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (TPLSM) का उपयोग दृष्टिकोण और ब्याज की कोशिकाओं के आनुवंशिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग इस तरह के axonal अध: पतन, सीए 2 + संकेतन, axonal उत्थान, अस्थिकणिका शरीर क्रिया विज्ञान के रूप में कई विविध गतिशील प्रक्रियाओं में प्रत्यक्ष सबूत और यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी microglial फिजियोलॉजी, और चोट 17-25 के जवाब।

एक्सोन के विपरीत, बहुत कम वास्तविक समय में चोट के माइलिन प्रतिक्रियाओं के नाम से जाना जाता है। मेलिन पीएन में सीएनएस और श्वान कोशिकाओं में oligodendrocytes द्वारा निर्मित और बनाए रखा सफेद पदार्थ का एक महत्वपूर्ण घटक है। मेलिन axons की सतह के 99% insulates और ऐसा करके हाल ही में Buttermore एट अल। 26 द्वारा समीक्षा तेजी से और कुशल ऊबड़-खाबड़ आवेग प्रचार का समर्थन करता है कि एक उच्च प्रतिरोध, कम समाई सुरक्षा कवर प्रदान करता है। हम solvatochromic, lipophilic उपयोग चोट के माइलिन के गतिशील प्रतिक्रिया पर कब्जा करने के लिएफ्लोरोसेंट रंजक नील लाल 27। इस महत्वपूर्ण दाग की solvatochromic गुण भौतिक-रासायनिक वातावरण 28,29 पर निर्भर है कि अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के वर्णक्रम पारियों अनुमति देते हैं। इन गुणों axomyelinic चोट के तंत्र में जानकारी हासिल करने के लिए उपयोगी होते हैं और उचित रूप से चयनित dichroics और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कल्पना या वर्णक्रमीय माइक्रोस्कोपी 27 का उपयोग कर हल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नील लाल उत्सर्जन स्पेक्ट्रम नीली स्थानांतरित कर दिया ऐसे adipocytes और सामान्य सीएनएस माइलिन (पीक उत्सर्जन ~ 580-590 एनएम) 27 में पाए जाने वाले के रूप में कम ध्रुवीय, लिपिड युक्त वातावरण में है। इसके विपरीत, ~ 625 एनएम axons के रूप में गठन किया endbulbs में इस महत्वपूर्ण डाई का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम चोटियों axonal dieback 27 से गुजरना। सामान्य माइलिन बनाम endbulbs में विशेष रूप से इन वर्णक्रमीय पारियों अंतर्निहित सटीक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं हालांकि, इस तरह के वर्णक्रमीय परिवर्तन प्रोटीन संचय या गड़बड़ी करने के लिए अग्रणी में अंतर्निहित परिवर्तन प्रकट हो सकता हैहाइड्रोफोबिक बाध्यकारी साइटों 27 का जोखिम।

Vivo इमेजिंग में उनके पैतृक वातावरण में रीढ़ की हड्डी axonal चोट गतिशीलता के अवलोकन के लिए परम मीट्रिक है, यह तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है और पर्याप्त शल्य विशेषज्ञता की आवश्यकता है, और अक्सर (जैसे, सूजन और निशान प्रयोगात्मक कलाकृतियों परिचय हो सकता है कि पृष्ठीय स्तंभ को बेनकाब करने के लिए सर्जरी दोहराने गठन)। इसके अलावा, महंगे उपकरण अक्सर माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस के तहत एक अक्षुण्ण जानवर के निलंबन और स्थिति की अनुमति देने की जरूरत है। जानवरों को ध्यान से वे तरल पदार्थ मंगाया हैं सुनिश्चित करने के लिए, और की वजह से लंबे समय तक anesthetized इमेजिंग सत्र के लिए हाइपोक्सिया के कोई संकेत नहीं हैं सुनिश्चित करने के लिए, गर्म रहना सुनिश्चित करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से नजर रखी जा करने की जरूरत है। axons और माइलिन बिल्कुल व्यवहार्य रहने के लिए निरंतर छिड़काव और पर्याप्त ऑक्सीजन स्तर की आवश्यकता के रूप में बाद अत्यंत महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस बार सूचित किया या करने के लिए vivo अध्ययन में अधिकांश में निगरानी नहीं कर रहा हैतारीख। इसके अलावा, के कारण हृदय गति और साँस लेने के लिए आंदोलन कलाकृतियों (isoflurane वयस्क माउस anesthetized: ~ मिनट प्रति 300-450 धड़कता है (बीपीएम) 97-98% ऑक्सीजन संतृप्ति (सामान्य दर ~ 632 बीपीएम) और बनाए रखने के लिए इष्टतम है ~ 55-65 साँस न्यूनतम प्रति अनिवार्यत: इन आंदोलन के अधीन हैं, क्रमशः)) के रूप में 30 भी तेजी से लेजर स्कैन को चुनौती देने के लिए उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्राथमिक और माध्यमिक axonal चोट प्रतिक्रियाओं का फर्क में विवो रीढ़ की हड्डी इमेजिंग बनाने के दौरान सामना (सामान्य दर ~ 163 मिनट प्रति साँस है) कलाकृतियों। जाग जानवरों में murine रीढ़ की हड्डी के इमेजिंग अनुमति दे सकता है एक implantable कठोर वर्टिब्रल फंसाया खिड़की के साथ संयुक्त ultrafast के गुंजयमान स्कैनर के क्षेत्र में अग्रिम, लेकिन तेजी से स्कैन बार अनिवार्य रूप से शोर अनुपात अपमानजनक छवि गुणवत्ता के लिए संकेत को कम। जैसा कि वर्तमान में मस्तिष्क इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया रीढ़ की हड्डी इमेजिंग तकनीक में और सुधार के लिए इन बाधाओं में से कई पर काबू पाने और आईएनए द्वारा शुरू की संभावित घालमेल सीमित कर सकता हैdequate ऊतक छिड़काव, जैसे, 31-33।

सफेद पदार्थ शरीर विज्ञान और सफेद पदार्थ चोट के तंत्र के बारे में जाना जाता है की ज्यादातर विट्रो या ऑप्टिक तंत्रिका, परिधीय तंत्रिका, और रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ 34-41 के स्ट्रिप्स से सफेद पदार्थ की पूर्व vivo तैयारी में उपयोग करके निर्धारित किया गया है। वे पर्यावरणीय कारकों में परिवर्तन, जीवित ऊतक में ड्रग्स और अभिकर्मकों के नियंत्रित आवेदन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर कार्यात्मक आकलन, और axons की प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों और माइलिन नियंत्रित अनुमति के रूप में इन तैयारियों सफेद पदार्थ चोट तंत्र की हमारे ज्ञान अग्रिम जारी है। फिर भी, कुछ पिछले दृष्टिकोण अनिवार्यत: बारीकी से विरोध किया axons की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं कि हटाने चरण के दौरान सतह एक्सोन घायल रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय स्तंभ स्ट्रिप्स या उदर सफेद पदार्थ स्ट्रिप्स से axons के निरीक्षण करने के लिए। ऊपर दिए गए प्रयोगात्मक जोड़तोड़ को भुनाने और ve को नुकसान से बचने के लिएयह हड्डी के पृष्ठीय पहलू के सीधे संपर्क रोकता के रूप में जांच के तहत RY फाइबर, हम एक पूर्व vivo ग्रीवा रीढ़ की हड्डी मॉडल का उपयोग करें। इस प्रकार, पिया मेटर और आसन्न सतही पृष्ठीय स्तंभ axons की वास्तुकला अलगाव के दौरान व्यवहार्य और बेफिक्र रहते हैं।

चोट के बाद 10 + घंटा - यहाँ हम वे गतिशील करने के लिए 8 वास्तविक समय में एक केंद्र चोट का जवाब के रूप में केंद्रीय मेलिनकृत axons की प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है कि एक अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण का वर्णन है। लेजर प्रेरित रीढ़ की हड्डी की चोट (LiSCI) मॉडल स्थानिक समय के साथ विवश रहता प्राथमिक घाव (पृथक साइट) के रूप में प्राथमिक और माध्यमिक axonal चोट तंत्र के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। खुले स्नान इमेजिंग कक्ष चिकित्सकीय हस्तक्षेप, अभिकर्मक वितरण, और पर्यावरण जोड़तोड़ के लिए सुलभ है। ख्यात axomyelinic सुरक्षात्मक एजेंट जल्दी ऊतक प्रक्रिया से जुड़े लंबा और महंगा प्रयोगों बनाम प्रत्यक्ष टिप्पणियों द्वारा वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जा सकताआईएनजी, इसलिए, immunostaining, छवि पर कब्जा, और विश्लेषण सेक्शनिंग और जीवित पशुओं में प्रयोगात्मक एजेंटों के परीक्षण से पहले तीव्र प्रतिक्रियाएं और सुरक्षात्मक जोड़तोड़ का आकलन करने के लिए एक उपयोगी सरोगेट मॉडल प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं संघीय नियमों के पालन, Louisville के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के तहत प्रदर्शन किया गया।

कम Ca 2 और 2 मिमी सीए 2 + कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के 1. तैयारी Perfusates

  1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में 2x कम Ca 2 (0.1 मिमी) स्टॉक सी बफर, 2x सामान्य सीए 2 + (2 मिमी) स्टॉक एक बफर, और 2x स्टॉक बी बफर तैयार करते हैं। व्यक्तिगत स्टॉक समाधान आयन सामग्री के संशोधन की अनुमति (जैसे, कम या शून्य सीए 2 +) और एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  2. विच्छेदन के दौरान intracardiac छिड़काव के लिए, 1x कम सीए 2 + aCSF बनाने के लिए एक प्लास्टिक की बोतल में 2x कम सीए 2 + स्टॉक सी की 100 मिलीलीटर और 2x स्टॉक बी के 100 मिलीलीटर जोड़ें। मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दुकान या नए सिरे से बनाने के।
  3. Imag के दौरान पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी के छिड़काव के लिएआईएनजी, 1x aCSF उत्पन्न करने के लिए एक एक एल कांच की बोतल में 2x सामान्य सीए 2 + स्टॉक ए की 500 मिलीलीटर और 2x स्टॉक बी के 500 मिलीलीटर जोड़ें। मिक्स और कमरे के तापमान पर रातोंरात दुकान या नए सिरे से बनाने के।
  4. 7.4 aCSF बफ़र्स के पीएच को समायोजित करें। कमरे के तापमान पर aCSF रखते हुए, बर्फ पर कम सीए 2 + aCSF जगह और फिर बुलबुला carbogen गैस के साथ दोनों बफ़र्स (95% ओ 2, 5% सीओ 2) 30 मिनट के लिए पूर्व छिड़काव के दौरान लगातार इस्तेमाल करते हैं और करने के लिए।

पूर्व vivo इमेजिंग कक्ष की 2. तैयारी

  1. ACSF बोतल के चारों ओर एक हीटिंग कंबल (कोई स्वत: बंद बंद) लपेटें और कम / मध्यम स्थापित करने के लिए गर्मी को समायोजित।
  2. चित्रा 1 ए में दिखाया गया के रूप में एक द्विध्रुवी तापमान नियंत्रक और प्रतिक्रिया तापमान जांच द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो हीटर एक छिड़काव पंप करने के लिए और इन-लाइन जुड़ा बोतल में एक समर्पित aCSF छिड़काव लाइन डालें।
  3. 2 फोटॉन / उत्तेजना conf के लिए एक फ्लैट खुर्दबीन मंच डालने (152 X 102 मिमी) संलग्न करेंocal खुर्दबीन मंच एक फैल कंटेनर के साथ लगाया।
  4. एक बड़े खुले स्नान छिड़काव चैम्बर प्लेस (डब्ल्यू एक्स एल एक्स एच, 12 x 24 x 8 मिमी) गिर कंटेनर में (एक उपयुक्त पूर्व के लिए चित्रा 1 बी को देखने को समायोजित करने और पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी के लिए ताजा ऑक्सीजन aCSF के निरंतर प्रवाह प्रदान करने के लिए ) चैम्बर डिजाइन इमेजिंग vivo।
  5. उपयुक्त ट्यूबिंग का उपयोग करते हुए पूर्व vivo इमेजिंग चैम्बर के लिए लाइन में हीटर की धातु उत्पादन बंदरगाह से कनेक्ट करें। इमेजिंग के दौरान बफर / ऊतक का तापमान बनाए रखने में मदद करने के लिए पूर्व vivo इमेजिंग कक्ष के नीचे एक पतली शोषक पैड रखें।
  6. हटाने योग्य चिपचिपा कील का उपयोग कर गिर कंटेनर / चरण डालने की तह तक पूर्व vivo इमेजिंग कक्ष पालन करें। चिपचिपा कील के बढ़ने की योग्यता उद्देश्य के प्रकाश पथ ऊतक सतह सीधा करने के लिए है सुनिश्चित करने के लिए जरूरत के रूप में चैम्बर को समायोजित करने की अनुमति देगा। यदि आवश्यक हो, चैम्बर समायोजित करने के लिए एक बुल्सआई स्तर का उपयोग करें।
  7. सुरक्षित एकचैम्बर द्रव इनलेट के पास लाइन में हीटर प्रतिक्रिया के तापमान जांच और चैम्बर आउटलेट पर एक निर्वात लाइन से जुड़ा एक स्टेनलेस स्टील सक्शन ट्यूब। चुंबकीय टेप और उपयुक्त micropipette धारकों को इस संबंध में उपयोगी होते हैं। वैक्यूम स्रोत पर बारी।
  8. Oxygenated aCSF साथ इमेजिंग कक्ष भरने शुरू करने के लिए छिड़काव पंप पर बारी। न्यूनतम प्रति 1.5-2 मिलीलीटर छिड़काव पंप सेट करें।
  9. वैक्यूम लाइन का समायोजन करके इमेजिंग कक्ष में aCSF की मात्रा पर नियंत्रण। यह रीढ़ की हड्डी खंड को कवर किया और एक पानी की सूई उद्देश्य और ऊतक सतह के बीच पर्याप्त दूरी काम अनुमति देने के लिए इमेजिंग कक्ष में पर्याप्त aCSF वहाँ होना जरूरी है। ऊतक खंड पूरी तरह से करने के लिए प्रयोगकर्ता प्रेरित कलाकृतियों अग्रणी ताजा ऑक्सीजन aCSF में पानी में डुबोया नहीं है, तो मेलिन और axons हानिकारकतापूर्वक प्रभावित हो सकते हैं।
  10. इमेजिंग कक्ष में कि perfusate तापमान के पास कमरे के तापमान पर है तो लाइन में हीटर तापमान नियंत्रक को समायोजित करें।
<पी वर्ग = "jove_title"> 3। वयस्क Murine ग्रीवा रीढ़ की हड्डी का विच्छेदन

  1. Intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से संज्ञाहरण सोडियम pentobarbital (200 मिलीग्राम / किग्रा) की एक ज्यादा इंजेक्शन लगाने के द्वारा एक वयस्क 6-10 सप्ताह पुरानी Thy1 -YFP ट्रांसजेनिक माउस (पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति है कि उपयोग के लिए उपयुक्त तनाव) euthanize।
  2. एक बार संज्ञाहरण के उचित स्तर (जैसे, पैर के अंगूठे चुटकी और झपकी पलटा के नुकसान की कोई प्रतिक्रिया), ध्यान से शल्य कतरनी के साथ रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क overlying त्वचा दाढ़ी के तहत। Betadine के और 70% इथेनॉल पैड का उपयोग कर त्वचा को साफ।
  3. 70% इथेनॉल के साथ सीने में / पेट क्षेत्र स्प्रे, तो ठंडा, carbogen-bubbled कम सीए का उपयोग कर transcardially विषय छिड़कना 2 + aCSF। (देखें चित्र -1 सी का सुझाव दिया विच्छेदन बेंच के लिए शीर्ष स्थापित)।
  4. जिगर pales के रूप में, एक छोटी सी क्लिप का उपयोग कर दिल में छिड़काव सुई सुरक्षित। की मुंडा पृष्ठीय पक्ष का उपयोग करने के विषय पर बारीविषय और 70% इथेनॉल के साथ मुंडा क्षेत्र पोंछे।
  5. मस्तिष्क और कशेरुका स्तंभ (2A चित्रा) को बेनकाब करने विच्छेदन कैंची का उपयोग कूल्हे को नाक से शुरू midline के साथ एक पृष्ठीय त्वचा चीरा बनाओ। नाक और जांघ पर पिन रखकर तैयारी सुरक्षित।
  6. इस बात पर से एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, मजबूती से घ्राण बल्ब के स्तर पर खोपड़ी के पृष्ठीय सतह भर में कटौती। चीरा के पार्श्व किनारों में कैंची सुझावों में से एक डालें और द्विपक्षीय सेरिबैलम तक skullcap के किनारों के साथ काटा।
    नोट: यह विच्छेदन के दौरान रीढ़ की हड्डी से overlying ऊतक लिफ्ट करने के लिए बाद में की जरूरत है के रूप में पूरी तरह से skullcap आबकारी मत (चित्रा 2B देखें)।
  7. मस्तिष्क का पर्दाफाश करने skullcap लिफ्ट। धीरे (सेरिबैलम पर स्थित) interparietal हड्डी के बाएँ और दाएँ किनारों में कटौती और (brainstem / रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने दुमदारी वापस चित्रा -2 यह पुल
  8. मेज की सतह के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर आयोजित ठीक इत्तला दे दी कैंची का प्रयोग करें और पीछे तंत्रिका जड़ों को द्विपक्षीय स्तर पर सिर्फ अवर कशेरुकाओं काटा।
    नोट: सफेद चमकीले पृष्ठीय कॉलम के साथ संपर्क से बचें। इन तंतुओं (चित्रा 2 डी) imaged किया जाएगा और आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है कि लोगों को कर रहे हैं।
  9. कटौती रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए बना रहे हैं के रूप में धीरे एक टुकड़ा में overlying ऊतक खींच, ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ कशेरुका स्तंभ के skullcap और पृष्ठीय सतह लिफ्ट। बाद इमेजिंग (चित्रा 2 ई) के लिए गर्भाशय ग्रीवा की हड्डी के एक 1-2 सेमी खंड को अलग-थलग करने के लिए ऊपरी वक्ष स्तर तक कशेरुकाओं में कटौती करने के लिए आगे बढ़ें।
  10. स्तंभ के नीचे कशेरुका स्तंभ और स्पष्ट ऊतक के लिए ऊतक / हड्डी समानांतर कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। संभव के रूप में स्तर के रूप में इन कटौती करें। यह गर्भनाल इमेजिंग के लिए स्तर इतना है कि ऊतक कक्ष में फ्लैट निहित है कि बहुत महत्वपूर्ण है।
  11. अतीत (ब्रेन स्टेम आड़ा काट करने के लिए एक # 11 स्केलपेल का उपयोगgracile पुलिका फाइबर की) और गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी खंड को अलग-थलग करने के लिए ऊपरी वक्ष स्तर पर समाप्ति () चित्रा 2 एफ देखें। ये वही दो बिंदुओं पर ऊतक / हड्डी में कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। पृथक ऊतक दुम brainstem, गर्भाशय ग्रीवा इज़ाफ़ा, और ऊपरी वक्ष रीढ़ की हड्डी (चित्रा 2 जी) को शामिल कशेरुका स्तंभ के 03/02 को शामिल करना चाहिए।
  12. Carbogen-bubbled, ठंडा कम सीए की एक पेट्री डिश 2 + aCSF में पृथक स्पाइनल कॉलम रखें। यदि आवश्यक हो यह डिश में फ्लैट निहित है, जब तक स्पाइनल कॉलम के नीचे ऊतक ट्रिम।
  13. पूर्व vivo इमेजिंग चैम्बर के लिए पृथक स्पाइनल कॉलम स्थानांतरण और धीरे-धीरे 36 को एक घंटा से अधिक perfusate तापमान में वृद्धि - 37 डिग्री सेल्सियस। इमेजिंग के दौरान इस तापमान को बनाए रखें।

नील लाल के साथ इमेजिंग कक्ष और मेलिन लेबल में पूर्व vivo स्पाइनल कॉर्ड 4. प्लेसमेंट

  1. ध्यान से मैं में कशेरुका स्तंभ सुरक्षितएक उचित फिटिंग टुकड़ा के साथ maging चैम्बर नीचे ठीक लाइक्रा धागे से मिलकर एक ऊर्ध्वाधर ग्रिड मंच के साथ संशोधित पकड़ (; चित्रा 3A देखने के रीढ़ की हड्डी के लिए अंतरिक्ष की अनुमति के लिए ग्रिड मंच के मध्य धागे निकालने के लिए)।
  2. (DMSO में 5 मिमी शेयर और फ़िल्टर 0.22; 4 डिग्री सेल्सियस, या अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने में एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है) नील लाल के एक विभाज्य पिघलना। बस इमेजिंग चैम्बर के लिए नील लाल जोड़ने से पहले, छिड़काव पंप के प्रवाह को कम करने और चैम्बर में तरल पदार्थ हमेशा रीढ़ की हड्डी को शामिल किया गया यह सुनिश्चित करने के लिए वैक्यूम लाइन समायोजित करें।
  3. कॉर्ड (3B चित्रा) की दुम अंत के पास इमेजिंग चैम्बर के लिए 5-10 μl नील लाल शेयर समाधान जोड़ें। धीरे चैम्बर भर में नील लाल मिश्रण करने के लिए एक एक एमएल पिपेट का प्रयोग करें। नील लाल, फिर 1-2 मिनट के लिए चैम्बर में रहने वापस निर्वात लाइन जगह है और लगातार रीढ़ की हड्डी छिड़कना के लिए न्यूनतम प्रति 1.5-2 मिलीलीटर छिड़काव पंप को समायोजित करने की अनुमति दें।
  4. ध्यान खुर्दबीन मंच बढ़ापानी विसर्जन उद्देश्य कक्ष में aCSF की सतह से लगभग 10 मिमी है जब तक और रीढ़ की हड्डी खंड के केंद्र के साथ और मध्यवर्ती पृष्ठीय स्तंभों से अधिक उद्देश्य संरेखित। यह धीरे aCSF की सतह को छूता है जब तक धीरे धीरे नीचे उद्देश्य लाने के लिए माइक्रोस्कोप nosepiece फोकस व्हील का प्रयोग करें। देखने के क्षेत्र (चित्रा -3 सी) में पृष्ठीय कॉलम ध्यान केंद्रित करने के लिए एक epifluorescent प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।

TPLSM और लेजर प्रेरित स्पाइनल कॉर्ड चोट के साथ माउस स्पाइनल कॉर्ड की 5. पूर्व vivo इमेजिंग (LiSCI)

नोट: पीछे की नस gracile पुलिका फाइबर के रूप में ऊतक केंद्र के लिए एक उपयोगी मार्कर प्रदान करता है (पृष्ठीय रूट ganglia की सेल शरीर से उत्पन्न और T6 से चढ़ना और नीचे रीढ़ की हड्डी के midline के साथ) इस रक्त वाहिनियों के समानांतर चला रहे हैं। मोटा YFP + ग्रीवा पृष्ठीय रूट अनुमानों भी फाइबर चढ़ना के रूप में एक उपयोगी मार्कर प्रदान करते हैं और Y के लिए पार्श्व उतरनाव्यास में छोटे होते हैं कि एफपी + gracile पुलिका फाइबर।

  1. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को उचित रूप से गठबंधन किया है एक बार, लेजर स्कैनिंग मोड के लिए स्विच आरोही gracile पुलिका मेलिनकृत फाइबर की आधारभूत इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए। दोनों YFP और नील लाल उत्तेजित करने के लिए, फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को अलग-थलग करने के लिए 950 एनएम तरंगदैर्ध्य (~ एक 25x, 1.1 एनए उद्देश्य के बाहर निकलने पर मापा जाता है 17 मेगावाट) और उपयुक्त dichroics (डीएम) और bandpass फिल्टर से परिचित एक दो photon लेजर स्रोत का उपयोग fluorophores के (हम पीला, नारंगी, और विस्तारित लाल चैनलों, क्रमशः में YFP, और नील नदी लाल अलग करने के लिए, 525/50 DM560, 600/60 DM640, और 685/70 का उपयोग करें)।
    1. Axons की अधिक से अधिक 3% आधारभूत इमेजिंग (30-60 मिनट) के दौरान axonal spheroids दिखाने के लिए, कारण प्रयोगकर्ता प्रेरित कलाकृतियों के लिए तैयारी त्यागें।
  2. 30.3X को देखने के क्षेत्र शीशा द्वारा एक LiSCI प्रेरित (एक ~ 20 माइक्रोन व्यास पृथक बनाने के लिए)। ट्यून 800 एनएम लेजर, और कम से ~ 110 मेगावाट करने के लिए लेजर की शक्ति में वृद्धिनमूना। फाइबर पूरी तरह से transected कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए देखें लेजर स्कैन के 5 पूरा क्षेत्र की अनुमति दें।
  3. (नमूना, 2.08X पर 950 एनएम, 17 मेगावाट) इमेजिंग सेटिंग्स को वापस लेजर सेटिंग बदलकर LiSCI की पुष्टि करें और पृथक कल्पना करने के लिए ऊतक स्कैन। पृथक के व्यास को सत्यापित करने और प्राथमिक ablated एक्सोन पूरी तरह से transected रहे हैं कि (चित्रा 3 डी देखें)। चोट के बाद 8-10 + घंटा अप करने के लिए चोट के axons और माइलिन के गतिशील प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए Z पकड़ने के साथ संयुक्त माइक्रोस्कोप पर समय चूक सेटिंग्स का उपयोग करें।
    नोट: पृथक अधूरा है (यानी, फाइबर का अधूरा transection), चकित किया जाएगा प्राथमिक और माध्यमिक चोट तंत्र के दृढ़ संकल्प के रूप में, तैयारी त्यागें। इसके अलावा, पृथक रीढ़ की हड्डी खंडों LiSCI स्वतंत्र ऊतकों को नुकसान करने के लिए उदार केवल हल्के के साथ 24 घंटे के बाद LiSCI अप करने के लिए imaged किया जा सकता है।

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Representative Results

एक उपयुक्त व्यवहार्यता, को अलग बनाए रखने की जरूरत के लिए स्थापित प्रयोगशाला, और छवि का विवरण पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी चित्र 1 में दिखाया गया है। माइक्रोस्कोप एक tunable स्पंदित femtosecond लेजर, उचित dicroics और उत्सर्जन फिल्टर, और एक पानी के साथ सुसज्जित करने की जरूरत है एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ उद्देश्य लेंस सूई (≥1.0)। विच्छेदन के दौरान रीढ़ की हड्डी की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया पृथक axonal झिल्ली 42 को सील करने के लिए 2 + पर्याप्त सीए की अनुमति देता है कि ठंडा ऑक्सीजन कम सीए 2 + aCSF की उपस्थिति में किया जाना चाहिए। ऐसा करने में विफलता अक्षतंतु का बाह्य आवरण से माइलिन की जुदाई और आधारभूत इमेजिंग के दौरान स्पष्ट रूप से दिखाई axonal अंडाकार आकृति गठन सहित axomyelinic नुकसान का कारण बन सकता है। विच्छेदन प्रक्रिया और पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी के अलगाव के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 2 में दिखाया गया है। निम्नलिखित अलगाव रीढ़ की हड्डी की व्यवहार्यता मीटर है36-37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है जो ऑक्सीजन aCSF के निरंतर छिड़काव द्वारा aintained। माइलिन दाग नील लाल 27,43 तो छिड़काव चैम्बर के लिए जोड़ा जा सकता है, और gracile पुलिका की आधारभूत रिकॉर्डिंग मेलिनकृत एक्सोन (चित्रा 3) शुरू कर सकते हैं।

Gracile पुलिका मेलिनकृत axons की छवियों प्रतिनिधि चित्रा 4 में दिखाया जाता है। आधारभूत शर्तों के तहत timelapse के TPLSM रिकॉर्डिंग अक्षतंतु की लंबाई के साथ काफी हद तक लगातार व्यास के साथ माइलिन (नील लाल) में ensheathed समानांतर गठबंधन YFP + एक्सोन प्रकट करते हैं। कुछ axonal spheroids या axonal अध: पतन के अन्य रूपात्मक लक्षण मौजूद हैं। ख्यात oligodendrocyte सेल शरीर की पंक्तियों के गहरे नारंगी (चित्रा -4 ए) दिखाई देते हैं, जबकि कारण नील लाल की solvatochromic गुण और माइलिन के लिपिड और प्रोटीन सामग्री के लिए, माइलिन पीला, नारंगी दाग है। ऐसे Ranvier की नोड्स के रूप में ठीक विवरण भी (जैसे, तीर में हल किया जा सकता है

LiSCI निम्नलिखित 10 मिनट पर, पृथक साइट पर व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम स्थित तुरंत transected एक्सोन (प्राथमिक चोट) दूर चोट साइट से वापस लेना शुरू करते हैं और सूजन गुब्बारों माइलिन के भीतर sigmoidal तरह coils के रूप में। पृथक करने के लिए दूरदराज के एक्सोन ensheathing मेलिन इस समय बिंदु पर अपरिवर्तित दिखाई देते हैं। वे घाव साइट (4B चित्रा) से वापस लेना रूप में 40 मिनट के बाद LiSCI सबसे प्राथमिक transected axons और माध्यमिक अध: पतन के दौर से गुजर एक्सोन द्वारा (यानी शुरू में अपमान, लेकिन बाद में पतित से बख्शा) विशेषता endbulbs के रूप में। समीपस्थ खंड प्रथम फूल जाती है, axonal spheroids रूपों, और अंततः अक्षतंतु 43 के कई अनियमित लंबाई में अक्षतंतु transects जहां लगभग इन transected axons की एक तिहाई पैन-विखंडन से गुजरना। एक्सोन (पेरी-axonal सूजन) और माइलिन के vesicular अध: पतन से माइलिन के पृथक्करण भी स्पष्ट है। समय के साथ, प्राथमिक और माध्यमिक ट्रॅनsected एक्सोन दूर घाव साइट से retracting जारी है, तुरंत पृथक साइट flanking एक्सोन माध्यमिक अध: पतन से गुजरना है, और पेरी-axonal सूजन सूजन माइलिन और vesicular अध: पतन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अधिक प्रमुख हो जाता है (चित्रा 4D जी, भी 43 देखें)। Axonal त्याग की हद में एक स्पष्ट अंतर समीपस्थ axonal स्टंप (घाव को दुम) और Wallerian अध: पतन (चित्रा 4D जी) से गुजरना करने के लिए किस्मत में हैं कि उनके बाहर का खंडों (घाव करने के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला) के बीच स्पष्ट हो जाता है। Axons शुरू में गुजरना LiSCI द्वारा बख्शा देरी माध्यमिक अध: पतन (चित्रा 4H)। LiSCI बिना एक प्रतिनिधि नियंत्रण प्रयोग, (अप करने के लिए 13 घंटे के इस उदाहरण में कॉर्ड अलगाव के बाद) लंबे इमेजिंग सत्र सफेद पदार्थ अखंडता के लिए प्रतिकूल प्रभाव के कारण के बिना संभव हो रहे हैं कि पता चलता है (चित्रा 4i, जे)।

प्रतिनिधि उच्च resoLiSCI के बाद axomyelinic परिवर्तन की lution छवियों चित्रा 5 में दिखाया जाता है।

LiSCI के बाद 3 घंटा तक, कई समीपस्थ (दुम) एक्सोन दूर वे दूर अक्षतंतु से अलग कर दिया है कि सूजन माइलिन नलियों के भीतर रहते हैं जहां घाव साइट से मुकर गए हैं। अन्य axonal endbulbs माइलिन (चित्रा 5A) से छाया हुआ होना दिखाई देते हैं। दूसरों अप्रभावित दिखाई देते हैं जबकि पृथक साइट के लिए आसन्न axons माध्यमिक अध: पतन से गुजरना। YFP अक्षतंतु के भीतर कम / नकारात्मक ख्यात पुटिकाओं (पीला नीला) और axonal endbulbs भी मौजूद हैं। इसके विपरीत फाइबर retracting दुमदारी करने के लिए, 3 घंटा के बाद LiSCI पर rostrally retracting axonal endbulbs और spheroids के बहुमत जोरदार नील लाल के साथ लेबल रहे हैं अक्षतंतु (चित्रा 5 ब) के भीतर एक पर्यावरण परिवर्तन का संकेत (कम नीले स्थानांतरित कर दिया)। नील सक्रिय रूप से retracting axons के भीतर क्षेत्रों में मुख्य रूप से चारों ओर या axonal कोर टोपी दिखाई देते रेड लेबल। सटीक स्थान और आईडीई यद्यपिइन इंट्रा-axonal नील रेड लेबल संरचनाओं के ntity वर्तमान में अज्ञात हैं, वे axonal परिवहन और / या उनके हाइड्रोफोबिक कोर 27 उजागर cleaved प्रोटीन के माध्यम से सघन पुटिका संचय का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। नील रेड लेबल वाली माइलिन मुख्य रूप से सामान्य दिखने के माइलिन में पीला, नारंगी बनी हुई है। भेद में, नील लाल (यानी नीले रंग परिवर्तित) इन संरचनाओं के भीतर पर्यावरण परिवर्तन का संकेत vesicular माइलिन पीला दिखाई देता है की जांच की। LiSCI एक्सोन दूर घाव साइट से retracting जारी रखने के बाद 7 घंटा तक; हालांकि, इस दुम (चित्रा 5C) endbulbs बनाम व्याख्यान चबूतरे वाला (चित्रा 5D) में और अधिक स्पष्ट है। अन्य axons के एक खाली माइलिन ट्यूब या कई माइक्रोन दूर degenerating खंड से एक पतली डंठल छोड़ने पूर्ण या आंशिक विघटन से गुजरना। LiSCI के बाद नील लाल की देरी आवेदन नील लाल की पूर्व आवेदन के रूप में इसी तरह की axonal लेबलिंग पृथक से प्रति और प्रोटीन विकृतीकरण पर संभावित थर्मल प्रभाव है कि विचारोत्तेजक का पता चलता हैचोट के बाद माइलिन और axons में नील लाल वर्णक्रमीय पाली (चित्रा 5E, एफ) के लिए जिम्मेदार संभावना नहीं है।

सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों को वास्तविक समय में तीव्र axomyelinic चोट की अच्छी तरह से जाना जाता है लेकिन खराब समझ तंत्र की नकल करने के पूर्व vivo LiSCI मॉडल की उपयोगिता को वर्णन। मॉडल इसलिए सफेद पदार्थ चोट के pathophysiology के हमारे ज्ञान और आगे के लिए उपयोगी हो सकता है, और सफेद पदार्थ अखंडता की रक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण आणविक लक्ष्य को उजागर कर सकते हैं।

चित्रा 1
चित्रा 1: विच्छेदन और इमेजिंग सेटअप का अवलोकन। (ए) एक रीढ़ की हड्डी के पूर्व vivo इमेजिंग के लिए सेट-अप का सुझाव दिया। आवश्यक प्रमुख उपकरण carbogen-bub वितरित करने के लिए एक छिड़काव पंप aCSF, आक्सीजन के साथ एक carbogen (95% 2 हे / 5% सीओ 2) गैस लाइन भी शामिल हैएक तापमान प्रतिक्रिया जांच के साथ सुसज्जित एक लाइन में हीटर / तापमान नियंत्रक उपकरण, और एक वैक्यूम स्रोत के साथ लगे एक खुले स्नान डिजाइन किए इमेजिंग कक्ष के माध्यम से aCSF लहूलुहान। (बी) इमेजिंग स्नान चैंबर के एक उच्च बढ़ाई दिखाया गया है। (सी) छिड़काव और पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी के विच्छेदन के लिए एक सुझाव सेट अप। ठंडा कम सीए 2 + aCSF carbogen साथ ऑक्सीजन और विच्छेदन के दौरान रीढ़ की हड्डी की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2:। इमेजिंग के लिए रीढ़ की हड्डी के अलगाव (ए) निरंतर ठंडा, ऑक्सीजन कम सीए अंडर Skul छिड़काव 2 +lcap अवगत कराया है। (ख) एक चीरा घ्राण बल्ब (धराशायी लाइन) के स्तर पर खोपड़ी के पृष्ठीय सतह के माध्यम से किया जाता है। यह धीरे हो सकता है जब तक (सी) द्विपक्षीय चीरों तो skullcap के पार्श्व सीमाओं के माध्यम से बना रहे हैं उठा लिया और ब्रेन स्टेम पर्दाफाश करने के लिए (तीर की दिशा में) दुमदारी खींच लिया। (डी) पृष्ठीय कॉलम कशेरुकाओं के पार्श्व पहलुओं कटौती और पर्दाफाश करने के लिए ठीक इत्तला दे दी कैंची (नोक) के साथ द्विपक्षीय चीरों जारी रखें। (ई) उजागर रीढ़ की हड्डी के ऊपरी वक्ष खंड के लिए brainstem और पूरे ग्रीवा इज़ाफ़ा दिखाए जाते हैं। (एफ) एक नंबर 11 स्केलपेल ब्लेड के साथ दो चीरों gracile पुलिका axonal समाप्ति और ऊपरी वक्ष स्तर (परे, brainstem में रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग करने के लिए बना रहे हैं धराशायी लाइनों)। (जी) पृथक रीढ़ की हड्डी तो ठंडा कम सीए युक्त एक पेट्री डिश को सौंप दिया है 2 + aCSF के साथ bubbledcarbogen गैस। सरवाइकल पृष्ठीय जड़ों (जैसे, तीर), पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि, और brainstem (~ 15-20 मिमी) करने के लिए ऊपरी वक्ष खंड से रीढ़ की हड्डी बरकरार रह गए हैं। जी में स्केल बार:। 2 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3:। पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी इमेजिंग (ए) एक बार कक्ष में रखा गया, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को एक संशोधित ऊतक / टुकड़ा लाइक्रा धागे के साथ फिट नीचे पकड़ का उपयोग कर सुरक्षित है (बी) माइलिन दाग नील लाल को सीधे जोड़ा गया है। इमेजिंग चैम्बर। (सी) एक पानी विसर्जन उद्देश्य aCSF में डूबे हुए और gracile पुलिका फाइबर के ऊपर स्थित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। केंद्रीय मेलिनकृत अक्षतंतु चोट TPLSM की LiSCI मॉडल LiSCI (*) निम्नलिखित अक्षतंतु और माइलिन प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रतिनिधि छवियों को एक 25x से लैस एक Nikon A1RMP + multiphoton / confocal खुर्दबीन के साथ 0.24 माइक्रोन / पिक्सेल पर कब्जा कर लिया पाँच एक माइक्रोन मोटी ऑप्टिकल वर्गों की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं; एनए: 1.1; WD: 2 मिमी पानी विसर्जन उद्देश्य। Dichroics और उत्सर्जन फिल्टर स्टैंडर्ड YFP + एक्सोन (525/50 DM560, नीले रंग में दिखाया गया है) और solvatochromic lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक नील आर अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गयाउत्सर्जन चैनल (लाल रंग में दिखाया 685/70 एनएम), कम (हरे रंग में दिखाया 600/60 DM640,) और अब में एड। दो उत्तरार्द्ध फिल्टर संयोजन वे विभिन्न भौतिक-रासायनिक वातावरण में नील लाल के नाम से जाना जाता वर्णक्रमीय पारियों पकड़ने के रूप में फायदेमंद हैं। आधारभूत स्थितियों axons में (ए) (YFP + नीला) और माइलिन (एनआर, पीला, नारंगी) आम तौर पर कुछ spheroids या साथ केंद्रित दिखाई axomyelinic चोट के अन्य लक्षण। सफेद पदार्थ oligodendrocytes (एनआर, अंधेरे नारंगी, जैसे तीर) की विशेषता आकृति विज्ञान के साथ glia की पंक्तियाँ भी (कुछ स्पष्टता के लिए चिह्नित) दिखाई दे रहे हैं, और इस तरह के Ranvier की नोड्स के रूप में ठीक संरचनाओं भी (जैसे तीर) हल कर रहे हैं। (बी) 10 से कम न्यूनतम LiSCI के बाद, घाव को व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम स्थित transected एक्सोन सूजन माइलिन के भीतर दूर चोट साइट से वापस लेना और sigmoidal-तरह के coils (तीर) आकार लेने लगते हैं। पृथक से दूरस्थ एक्सोन ensheathing मेलिन इस समय बिंदु पर अपरिवर्तित दिखाई देते हैं। (सी) बीY 40 मिनट के बाद LiSCI सबसे प्राथमिक transected axons और वे घाव साइट (तीर) से वापस लेना ही माध्यमिक अध: पतन फार्म विशेषता endbulbs के दौर से गुजर एक्सोन। कुछ transected एक्सोन भी उनके एक्सोन (तीर) की लंबाई के साथ spheroids के रूप में। अक्षतंतु (पेरी-axonal सूजन) और माइलिन के vesicular अध: पतन से माइलिन के पृथक्करण भी (+)। (डीजी)। समय के साथ, प्राथमिक और माध्यमिक घायल एक्सोन दूर retracting YZ अनुमानों के द्वारा दिखाया जारी घाव साइट से, और के रूप में स्पष्ट है LiSCI की, पृथक साइट flanking शुरू में बख्शा एक्सोन माध्यमिक अध: पतन देरी गुजरना (एच, LiSCI पहले बाएं पैनल, मध्यम पैनल में 10 मिनट के बाद LiSCI, और LiSCI के बाद सही पैनल 7 घंटा, सफेद डॉट्स प्रारंभिक LiSCI निशान, लाल डॉट्स का संकेत 10 मिनट के लिए और हरे रंग डॉट्स द्वारा axons की हानि) 7 घंटा से axons की देरी माध्यमिक अध: पतन की हद से संकेत मिलता है। पेरी-axonal सूजन बाद में समय बिंदुओं के बाद LiSCI में और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है। हद ओएफ axonal त्याग और समीपस्थ अक्षतंतु स्टंप और उनके बाहर का खंडों के बीच axonal endbulbs की आकृति विज्ञान भी स्पष्ट हो जाता है (इसके अलावा उच्च बढ़ाई छवियों के लिए 5 चित्रा देखें)। स्केल बार:। 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। LiSCI TPLSM के बाद axomyelinic परिवर्तन के प्रतिनिधि उच्च संकल्प छवियों 3 घंटा पर चोट करने के लिए दुम (ए, सी) और व्याख्यान चबूतरे वाला (बी, डी) में परिवर्तन अक्षतंतु और माइलिन के जटिल विस्तार पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (ए, बी) और 7 घंटा LiSCI निम्नलिखित (सी, डी)। प्रतिनिधि छवियाँ तीन एक माइक्रोन मोटी ऑप्टिकल वर्गों की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैंएक Nikon A1RMP + multiphoton / confocal खुर्दबीन के साथ 0.0832 माइक्रोन / पिक्सेल पर कब्जा कर लिया। सूज माइलिन नलियों के भीतर LiSCI (*), कई एक्सोन (नीला) के घाव साइट से दूर retracting कर रहे हैं (बड़े तीर) (पीला-नारंगी (ए) दुम ) axonal endbulb से दूर अलग कर लिया है। पृथक साइट से सटे कुछ axons दूसरों अप्रभावित दिखाई देते हैं, जबकि माध्यमिक अध: पतन (छोटे तीर) से गुजरना। YFP कम / नकारात्मक ख्यात पुटिकाओं अक्षतंतु के भीतर (नीला पीला) और axonal endbulbs वर्तमान (तीर) कर रहे हैं। Ranvier (एन) के एक केंद्रीय नोड इस इमेजिंग और लेबलिंग तकनीक का उपयोग भी स्पष्ट रूप से दिख रहा है। (बी) के विपरीत फाइबर retracting दुमदारी करने के लिए, 3 बजे के बाद LiSCI पर rostrally retracting axonal endbulbs और spheroids के बहुमत जोरदार नील के साथ चिह्नित कर रहे हैं लाल (गुलाबी)। Retracting axons में नील रेड लेबल क्षेत्रों में मुख्य रूप से लेबल axons (नीला, बड़े तीर) के चारों ओर या टोपी YFP दिखाई देते हैं। इन नील रेड-लेबल की प्रकृति यद्यपिएड संरचनाओं वर्तमान में अज्ञात है, वे axonal परिवहन और / या उनके हाइड्रोफोबिक कोर उजागर cleaved प्रोटीन के माध्यम से सघन पुटिका संचय का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। भेद में, नील लाल पूर्व भीतर ख्यात पर्यावरण परिवर्तन का संकेत vesicular माइलिन (तीर) पीले सामान्य माइलिन (पीला, नारंगी) की तुलना में (यानी स्पेक्ट्रम स्थानांतरित कर दिया नीला है) दिखाई देता है, लेबल। पेरी-axonal सूजन भी स्पष्ट (छोटे तीर) है। LiSCI के बाद सात घंटे से कम, एक्सोन घाव साइट से दूर retracting जारी; हालांकि, इस दुम (सी) endbulbs बनाम व्याख्यान चबूतरे वाला (डी) में और अधिक स्पष्ट है। कुछ axons क्रमश: (डी में छोटे तीर) degenerating खंड से कई माइक्रोन दूर एक खाली माइलिन ट्यूब (सी में तीर) या एक पतली डंठल छोड़ने पूर्ण या आंशिक विघटन से गुजरना। नील लाल की देरी आवेदन व्याख्यान चबूतरे वाला केंद्रीय मेलिनकृत एक्सोन (ई और एफ बनाम दुम में इसी प्रकार के वर्णक्रम पारियों का उत्पादन (सी, डी) के रूप में। स्केल बार:। 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2x स्टॉक ए (2 मिमी Ca 2) अभिकर्मक मिमी
NaCl 252
KCl 6
2 CaCl • 2H 2 हे 4
2x स्टॉक बी नाह 2 पीओ 4 2.5
MgSO 4 4
3 NaHCO 52
डेक्सट्रोज (ग्लूकोज़) 20
2x कम सीए 2 + स्टॉक सेल्सियस (0.1 मिमी Ca 2) NaCl 252
KCl 6
MgCl • 6H 2 हे 3.8
2 CaCl • 2H 2 हे 0.2

तालिका 1: कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) बफ़र्स।

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

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References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
  3. McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
  4. Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
  5. Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
  6. Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
  7. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  8. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  9. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
  10. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
  11. Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
  12. Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
  13. Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
  14. McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
  15. Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
  16. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  17. Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
  18. Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
  19. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
  20. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
  22. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  23. Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
  24. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  25. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
  26. Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
  27. Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
  28. Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
  29. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  30. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
  31. Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
  32. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
  33. Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
  34. Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
  35. Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
  36. Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
  37. Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
  38. Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
  39. Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
  40. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
  41. Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
  42. Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
  43. Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 93 रीढ़ की हड्डी में चोट अक्षतंतु माइलिन दो photon उत्तेजना माइक्रोस्कोपी नील लाल axonal अध: पतन axonal dieback axonal त्याग
एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; लेजर प्रेरित स्पाइनल कॉर्ड चोट मॉडल वास्तविक समय में axonal अध: पतन के तंत्र का आकलन करने के लिए
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Okada, S. L. M., Stivers, N. S.,… More

Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

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