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Neuroscience

Una Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

Axones lesionados del SNC no se regeneran y, a menudo retraer lejos del sitio de la lesión. Los axones se salvaron de la lesión inicial más tarde pueden sufrir degeneración axonal secundaria. La falta de formación del cono de crecimiento, la regeneración, y la pérdida de proyecciones axonales mielinizadas adicionales dentro de la médula espinal limita en gran medida la recuperación neurológica después de una lesión. Para evaluar la forma en el centro de axones mielinizados de la médula espinal responden a las lesiones, hemos desarrollado un modelo ex vivo vivir médula espinal utilizando ratones transgénicos que expresan la proteína amarilla fluorescente en los axones y una focal y lesión medular inducida por láser altamente reproducible para documentar el destino de axones y mielina (colorante fluorescente lipofílica Rojo Nilo) con el tiempo utilizando excitación de dos fotones time-lapse microscopía. Los procesos dinámicos tales como lesión aguda axonal, la retracción axonal, y la degeneración de la mielina están mejor estudiados en tiempo real. Sin embargo, la naturaleza no focal de las lesiones a base de contusión y artefactos de movimiento encontródurante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria utilizando microscopía de alta resolución desafiante. El modelo ex vivo de la médula espinal aquí descrita replica varios aspectos de la contusión / patologías axonal clínicamente relevantes inducida por compresión, incluyendo inflamación axonal, la formación de esferoides, transección axonal, y peri-axonal hinchazón proporcionando un modelo útil para estudiar estos procesos dinámicos en tiempo real. Las principales ventajas de este modelo son una excelente resolución espacial y temporal que permite la diferenciación entre el insulto primaria que lesiona directamente los axones y los mecanismos de lesión secundaria; infusión controlada de reactivos directamente al baño perfundido el cable; alteraciones precisas del medio ambiente (por ejemplo, calcio, iones de sodio, los contribuyentes que se sabe que la lesión axonal, pero casi imposible de manipular en vivo); y modelos murinos también ofrecen una ventaja, ya que proporcionan la oportunidad de visualizar ymanipular las poblaciones de células identificadas genéticamente y estructuras subcelulares. A continuación, describimos cómo aislar e imagen viviente de la médula espinal de los ratones para capturar la dinámica de lesión axonal aguda.

Introduction

La degeneración de los axones es una causa importante de morbilidad que abarca varias condiciones neurológicas incluyendo neurotrauma, accidente cerebrovascular, enfermedades autoinmunes, y enfermedades neurodegenerativas. A diferencia del sistema nervioso periférico (PNS), el sistema nervioso central (SNC) axones tienen una capacidad limitada para regenerar una vez heridos debido tanto a las barreras intrínsecas y extrínsecas (es decir, moléculas inhibidoras del crecimiento axonal producido durante la formación de la cicatriz y liberado durante la degeneración de mielina) 1 -7. Aunque varias de estas barreras se han explorado ampliamente, las intervenciones terapéuticas dirigidas a prevenir CNS degeneración axonal, promover la regeneración axonal robusta, y restaurar connectively funcional, siguen siendo limitados.

Los axones una vez separados de su soma someten a un proceso estereotipada de la degeneración conocida como degeneración walleriana que se caracteriza por hinchazón axonal, la formación de esferoides y eventual fragmentación (revisado en 8). EnPor el contrario, el muñón proximal que permanece en continuidad con el soma de un axón periférico seccionado, forma una hinchazón en su extremo, muere de nuevo al nodo más cercano de Ranvier y, a continuación puede iniciar la formación del cono de crecimiento, un requisito previo vital necesaria para la regeneración axonal subsiguiente 9-11. En contraste, las terminaciones axonales proximales de muchos axones centrales forman "endbulbs" característicos o bombillas de retracción, no se forman conos de crecimiento, y en lugar de retraer lejos del sitio de la lesión donde permanecen durante meses después de la lesión 12-15. Además de la lesión axonal primaria, daño axonal / pérdida adicional también puede ocurrir a los axones que se salvaron en gran parte de la lesión inicial. Esta pérdida axonal retraso de los axones librado inicialmente se denomina degeneración axonal como secundario. Esta respuesta inherente de los axones del SNC a una lesión hace que la regeneración axonal funcional un objetivo aún más difícil de lograr en el cerebro y la médula espinal.

Aunque hallmarks de lesión axonal (por ejemplo, la formación de esferoides, bombillas de retracción) han sido bien caracterizados a partir de modelos experimentales de la degeneración axonal tejido post-mortem y, elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos dinámicos ha sido restringido. La mayoría de estos estudios se basó en observaciones de punto final estáticas que intrínsecamente no lograron capturar respuestas axonal individuales en el tiempo. Aunque aplicadas exógenamente trazadores axonal han sido útiles para dilucidar las respuestas axonal de secciones estáticas y durante imágenes en vivo, la disponibilidad de marcadores axonal codificados genéticamente ha mejorado en gran medida nuestra capacidad de visualizar los axones en tiempo real, utilizando microscopía de fluorescencia. De hecho, un informe seminal de Kerschensteiner y colegas proporcionan primera evidencia directa de la degeneración axonal y la regeneración in vivo utilizando ratones Thy1 GFP-S que codifican la proteína fluorescente verde en subconjuntos de neuronas que envían sus proyecciones en las columnas dorsales de la médulacable de 16. Imágenes en vivo enfoques utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (TPLSM) y genéticas etiquetado proteína fluorescente de células de interés continúa proporcionando evidencia directa y visión mecanicista en muchos diversos procesos dinámicos tales como la degeneración axonal, Ca 2 + señalización, la regeneración axonal, la fisiología de los astrocitos, fisiología microglial, y la respuesta a la lesión 17-25.

A diferencia de los axones, se sabe muy poco de las respuestas a la lesión de la mielina en tiempo real. La mielina es un componente vital de la sustancia blanca producida y mantenida por los oligodendrocitos en las células del sistema nervioso central y de Schwann en el SNP. La mielina aísla 99% de la superficie de los axones y de esta manera proporciona una alta resistencia, la cubierta protectora de baja capacitancia que soporta rápida y eficaz la propagación del impulso saltatoria, revisado recientemente por Buttimore et al., 26. Para capturar la respuesta dinámica de la mielina a las lesiones usamos la solvatocrómico, lipófilocolorante fluorescente Nilo 27 Red. Las propiedades solvatocrómico de este colorante vital permiten desplazamientos espectrales de su espectro de emisión que es dependiente del entorno físico-químico 28,29. Estas propiedades son útiles para comprender mejor los mecanismos de lesión axomyelinic y pueden ser visualizados usando dicroicas adecuadamente seleccionados y filtros de emisión o resolverse mediante microscopía espectral 27. Por ejemplo, el espectro de emisión del Rojo Nilo es desplazada al azul en entornos menos polares, ricas en lípidos tales como los encontrados en los adipocitos y la mielina del SNC normal (pico de emisión ~ 580-590 nm) 27. En contraste, los picos del espectro de emisión de este colorante vital en ~ 625 nm en endbulbs formados como axones sufren muerte regresiva axonal 27. Aunque los mecanismos exactos que subyacen a estos desplazamientos espectrales específicamente en endbulbs frente a la mielina normal, siguen sin estar claros, tales cambios espectrales pueden revelar alteraciones subyacentes en la acumulación de proteínas o desorganización que lleva ala exposición de sitios de unión hidrófobos 27.

Mientras imágenes in vivo es la métrica final para la observación de la dinámica de la médula espinal de lesión axonal en su entorno nativo, es técnicamente difícil y requiere experiencia quirúrgica considerable y, a menudo repetir cirugías para exponer la columna dorsal que puede introducir artefactos experimentales (por ejemplo, la inflamación y la cicatriz formación). Además, un equipo costoso es a menudo necesaria para permitir la suspensión y posicionamiento de un animal intacto bajo la lente del objetivo de microscopio. Los animales deben ser supervisados ​​cuidadosamente, así como asegurar que se mantienen cálidas, para garantizar los líquidos se reponen, y para garantizar que no haya signos de hipoxia debido a las sesiones de formación de imágenes anestesiados prolongados. Esto último es muy importante como axones y mielina absolutamente requieren perfusión constante y los niveles de oxígeno adecuados para seguir siendo viable. Sin embargo, esto a menudo no se informó ni controlado en la mayoría de los estudios in vivo afecha. Además, los artefactos de movimiento debido a la frecuencia cardíaca y la respiración (isoflurano anestesiados ratón adulto: ~ 300 a 450 latidos por minuto (BPM) es óptima para mantener la saturación de oxígeno 97 a 98% (normal tasa de ~ 632 BPM) y ~ 55-65 respiraciones por minuto (tarifa normal es de ~ 163 respiraciones por minuto), respectivamente)) 30 encontrados durante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución desafiante ya que incluso los más rápidos escaneos láser inevitablemente están sujetos a estos movimientos artefactos. Los avances en los escáneres de resonancia ultrarrápidos combinados con un vertebral rígida ventana enmarcada implantable puede permitir imágenes de la médula espinal murino en animales despiertos, pero los tiempos de exploración más rápido reducen inevitablemente la relación señal a ruido de calidad de imagen degradante. Otras mejoras en las técnicas de imagen de la médula espinal se utilizan en la actualidad para las imágenes cerebrales pueden superar muchos de estos obstáculos y limitar posibles confusiones introducidas por inala perfusión tisular dequate, por ejemplo, 31-33.

Mucho de lo que se conoce sobre blanco fisiología y mecanismos de la lesión de la sustancia blanca cuestión se ha determinado utilizando in vitro o preparados ex vivo de la sustancia blanca del nervio óptico, el nervio periférico, y tiras de la médula espinal de la sustancia blanca 34-41. Estas preparaciones continúan avanzar en el conocimiento de los mecanismos de lesión de la sustancia blanca, ya que permiten cambios en los factores ambientales, la aplicación controlada de fármacos y reactivos, evaluaciones funcionales utilizando electrofisiología, y observaciones de microscopía de fluorescencia directa de los axones y mielina en el tejido vivo controlados. Sin embargo, algunos de los enfoques anteriores para observar los axones de las tiras de la columna dorsal de la médula espinal o las tiras de materia blanca ventral inevitablemente dañar los axones superficiales durante la etapa de eliminación que pueden influir en la respuesta de los axones de cerca opuestos. Para sacar provecho de las manipulaciones experimentales anteriores y evitar daños en el cincofibras ry bajo investigación, utilizamos un modelo de la médula espinal cervical ex vivo, ya que evita el contacto directo de la cara dorsal de la médula. Por lo tanto, la arquitectura de la piamadre y axones columna dorsal superficial adyacentes permanecen viables e imperturbable durante el aislamiento.

Aquí se describe un enfoque relativamente simple que permite la visualización directa de los axones mielinizados centrales para que puedan responder dinámicamente a una lesión focal en tiempo real hasta 8 - 10+ horas después del daño. El modelo de lesión medular inducida por láser (Lisci) permite la diferenciación entre los mecanismos de lesión axonal primaria y secundaria como el (lugar de ablación) lesión primaria permanece espacialmente limitadas en el tiempo. La cámara de imágenes en baño abierto es accesible para la intervención terapéutica, la entrega de reactivos y manipulaciones ambientales. Agentes protectores axomyelinic putativos pueden ser evaluados rápidamente en tiempo real por observaciones directas frente a experimentos largos y costosos que implican proceso de tejidoing, seccionamiento, inmunotinción, captura de imágenes, y el análisis y por lo tanto proporciona un modelo sustituto útil para evaluar las respuestas agudas y manipulaciones de protección antes de probar los agentes experimentales en animales vivos.

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Protocol

NOTA: Todos los animales procedimientos se realizaron bajo las directrices establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional de la Universidad de Louisville, conforme a las normativas federales.

1. Preparación de Baja Ca 2+ y 2 mM de Ca 2+ líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) perfundidos

  1. Preparar 2x bajo Ca 2 + (0,1 mM) Stock tampón C, 2x Ca normales 2+ (2 mM) Stock un tampón, y tampón 2x Stock B como se describe en la Tabla 1. Las soluciones madre individuales permiten la modificación del contenido de iones (por ejemplo, bajo o cero Ca 2+) y puede almacenarse a 4 ° C durante un máximo de un mes.
  2. Para la perfusión intracardiaca durante la disección, añadir 100 ml de 2x bajo Ca 2+ Stock C y 100 ml de 2x Stock B en una botella de plástico a fin de bajo Ca 2 + 1x LCRa. Mezclar y guardar toda la noche a 4 ° C o hacer fresco.
  3. Para la perfusión ex vivo de la médula espinal durante imagING, añadir 500 ml de 2x normal de Ca 2+ Stock A y 500 ml de 2x Stock B en una botella de vidrio de 1 L para generar 1x LCRa. Mezclar y almacenar durante la noche a temperatura ambiente o hacer fresco.
  4. Ajustar el pH de los tampones aCSF a 7,4. Mientras se mantiene el LCRa a temperatura ambiente, colocar el bajo Ca 2 + LCRa en hielo y luego burbuja ambos buffers con gas carbógeno (95% O 2; 5% de CO 2) durante 30 min antes de su uso y continuamente durante la perfusión.

2. Preparación de Ex Vivo cámara de imágenes

  1. Envuelva una manta de calefacción (sin apagado automático) alrededor de la botella LCRa y ajustar el fuego a bajo entorno / medio.
  2. Inserte una línea dedicada de perfusión LCRa en la botella conectado a una bomba de perfusión y calentador en línea que es controlada por una sonda de temperatura controlador de temperatura y la retroalimentación bipolar como se muestra en la Figura 1A.
  3. Adjunte una etapa de inserción microscopio plana (152 x 102 mm) a la de 2 fotones de excitación / confplatina del microscopio vecinal equipado con un contenedor de derrame.
  4. Colocar una cámara de perfusión en baño abierto grande (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) en el recipiente de derrame para acomodar y proporcionar un flujo continuo de fresca oxigenada LCRa a la médula espinal ex vivo (véase la Figura 1B para una ex adecuado vivo de imágenes diseño de la cámara).
  5. Conectar el puerto de salida de metal del calentador en línea a la cámara de formación de imágenes ex vivo usando un tubo apropiado. Coloque una almohadilla absorbente delgada debajo de la cámara de formación de imágenes ex vivo para ayudar a mantener la temperatura del tampón / tejido durante la formación de imágenes.
  6. Adherir la cámara de formación de imágenes ex vivo a la parte inferior del inserto recipiente derrame / etapa usando extraíble tachuela pegajosa. La maleabilidad de la tachuela pegajosa permitirá que la cámara sea ajustada como sea necesario para asegurar la trayectoria de la luz del objetivo es perpendicular a la superficie del tejido. Si es necesario, utilice un nivel diana para ajustar la cámara.
  7. Asegure unsonda en-línea de realimentación calentador de temperatura cerca de la cámara de entrada de fluido y un tubo de succión de acero inoxidable conectado a una línea de vacío en la salida de la cámara. Titulares de cinta magnética y micropipeta apropiada son útiles a este respecto. Encienda la fuente de vacío.
  8. Encienda la bomba de perfusión para comenzar a llenar la cámara de imágenes con LCRa oxigenada. Ajuste la bomba de perfusión de 1,5 a 2 ml por min.
  9. Controlar el volumen de LCRa en la cámara de formación de imágenes mediante el ajuste de la línea de vacío. Es importante que haya suficiente LCRa en la cámara de formación de imágenes para cubrir el segmento de la médula espinal y permitir suficiente distancia de trabajo entre un objetivo de inmersión de agua y la superficie del tejido. La mielina y axones pueden verse afectadas negativamente si el segmento de tejido no está completamente sumergido en fresco oxigenada LCRa líder artefactos inducidos por el experimentador.
  10. Ajuste el controlador de temperatura del calentador en línea para que la temperatura perfundido en la cámara de formación de imágenes es a temperatura ambiente.
<p class = "jove_title"> 3. Disección de adulto murino cervical de la médula espinal

  1. La eutanasia a un adulto 6-10 semanas de edad thy1-YFP ratón transgénico (uso cepa apropiada que tiene la expresión de la proteína fluorescente en las neuronas ganglionares de la raíz dorsal) mediante la inyección de una sobredosis de la anestesia pentobarbital sódico (200 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal.
  2. Una vez bajo el nivel adecuado de anestesia (por ejemplo, ninguna reacción a pizca dedo del pie y pérdida de reflejo de parpadeo), afeitado cuidadosamente la piel que cubre la médula espinal y el cerebro con una maquinilla quirúrgicos. Limpie la piel usando betadine y 70% de etanol almohadillas.
  3. Rocíe pecho / área del abdomen con etanol al 70%, entonces perfundir el tema transcardially usando refrigeradas, bajo Ca carbógeno-burbujear 2+ LCRa. (Vea la figura 1C para banco de disección sugerido superior configurado).
  4. Como palidece el hígado, asegure la aguja de perfusión en el corazón con un pequeño clip. Gire el tema para tener acceso al lado dorsal afeitada deel sujeto y limpie la zona afeitada con etanol al 70%.
  5. Hacer una incisión en la piel dorsal a lo largo de la línea media a partir de la nariz a la cadera utilizando tijeras de disección para exponer el cerebro y la columna vertebral (Figura 2). Asegurar la preparación mediante la colocación de pasadores en la nariz y la cadera.
  6. Utilizando un microscopio de disección partir de este punto, firmemente cortar a través de la superficie dorsal del cráneo a nivel de los bulbos olfativos. Inserte una de las puntas de las tijeras en los bordes laterales de la incisión y cortar a lo largo de los bordes de la bóveda del cráneo bilateralmente hasta el cerebelo.
    NOTA: No extirpar completamente la bóveda del cráneo, ya que se necesita después de levantar el tejido que recubre desde la médula espinal a lo largo de la disección (ver Figura 2B).
  7. Levante la tapa del cráneo para exponer el cerebro. Cortar suavemente los bordes izquierdo y derecho de la médula interparietal (situado en el cerebelo) y tire de él hacia atrás en sentido caudal para exponer el tronco cerebral / de la médula espinal (Figura 2C
  8. Con unas tijeras de punta fina celebradas en un ángulo de 45 ° respecto a la superficie de la mesa y cortar las vértebras bilateralmente justo por debajo de las raíces nerviosas posterior.
    NOTA: Evite el contacto con las columnas dorsales de color blanco brillante. Estas fibras son las que serán fotografiadas (Figura 2D) y se pueden dañar fácilmente.
  9. Levante la superficie de casquete y dorsal de la columna vertebral con unas pinzas de punta fina, tirando suavemente el tejido suprayacente en una sola pieza como se hacen cortes para exponer la médula espinal. Continuar para cortar las vértebras a nivel torácico superior para aislar un segmento de 1-2 cm de la médula cervical para la posterior formación de imágenes (Figura 2E).
  10. Utilice unas tijeras para cortar el paralelo tejido / hueso de la columna vertebral y el tejido transparente debajo de la columna. Hacer estos recortes como nivel posible. Es muy importante que el tejido esté plana en la cámara de modo que el cable es el nivel de formación de imágenes.
  11. Utilice un bisturí # 11 para seccionar el tronco cerebral (más allá de lala terminación de las fibras fascículo gracile) y en el nivel superior torácica para aislar el segmento de la médula espinal cervical (Ver Figura 2F). Utilice unas tijeras para cortar el tejido / hueso en estos mismos dos puntos. El tejido aislado debe contener 2/3 de la columna vertebral que abarca el tronco cerebral caudal, la ampliación cervical, y la médula espinal torácica superior (Figura 2G).
  12. Colocar la columna vertebral aislado en una placa Petri de carbógeno-burbujeó, bajo Ca 2 + LCRa refrigerada. Si es necesario, cortar el tejido debajo de la columna vertebral hasta que quede plana en el plato.
  13. Transferir la columna vertebral aislada a la cámara de formación de imágenes ex vivo y aumentar gradualmente la temperatura perfundido durante 1 hora a 36-37 ° C. Mantener esta temperatura durante la exploración.

4. Colocación de los ex vivo de la médula espinal en la Cámara de Imágenes e mielina Etiquetado con Rojo Nilo

  1. Asegurar cuidadosamente la columna vertebral en el icámara maging con una rodaja de ajuste apropiado mantenga presionada modificado con una plataforma de rejilla vertical que consiste en hilos de lycra fina (quitar las hebras medias de rejilla plataforma para dar espacio a la médula espinal; ver Figura 3A).
  2. Descongelar una alícuota de Rojo Nilo (madre 5 mM en DMSO y 0,22 micras filtrada; pueden almacenarse durante 1 mes a 4 ° C, o 6 meses a -20 ° C en la oscuridad). Justo antes de la adición de Rojo Nilo a la cámara de formación de imágenes, reducir el flujo de la bomba de perfusión y ajustar la línea de vacío para asegurar el fluido en la cámara siempre cubre la médula espinal.
  3. Añadir 5-10 l solución madre de Rojo Nilo a la cámara de formación de imágenes cerca del extremo caudal de la cuerda (Figura 3B). Utilice una pipeta de 1 ml para mezclar suavemente Rojo Nilo en toda la cámara. Permita Rojo Nilo para permanecer en la cámara durante 1-2 minutos, luego coloque la línea de vacío, retroceder y ajustar la bomba de perfusión de 1,5 a 2 ml por minuto para la perfusión continua de la médula espinal.
  4. Levante con cuidado la platina del microscopioy alinear el objetivo con el centro del segmento de la médula espinal y medialmente sobre las columnas dorsales hasta que el objetivo de inmersión en agua es de aproximadamente 10 mm de la superficie de la LCRa en la cámara. Utilice el microscopio rueda de enfoque revólver para llevar lentamente el objetivo hasta que toque suavemente la superficie de la LCRa. Utilice una fuente de luz de epifluorescencia para enfocar las columnas dorsales en el campo de visión (Figura 3C).

5. Ex vivo de imágenes de la médula espinal de ratón con TPLSM y la médula espinal inducida por láser Lesiones (Lisci)

NOTA: La vena posterior proporciona un marcador útil para centrar el tejido a medida que las fibras fascículo grácil (originados por el cuerpo celular de ganglios de la raíz dorsal y ascienden desde T6 y por debajo a lo largo de la línea media de la médula espinal) en paralelo a este vaso sanguíneo. Los más gruesas YFP + proyecciones de la raíz dorsal cervical también proporcionan un marcador útil como fibras ascienden y descienden lateralmente a la YFibras de PF + fascículo grácil que son más pequeños de diámetro.

  1. Una vez que el tejido de la médula espinal está alineado apropiadamente, cambie al modo de escaneo láser para realizar las imágenes de referencia de el fascículo grácil fibras mielinizadas ascendentes. Para excitar tanto YFP y Rojo Nilo, utilizar una fuente de láser de dos fotones sintonizado a 950 nm de longitud de onda (~ 17 mW medida en la salida de un 25X, 1,1 objetivo NA) y dicroicos apropiados (DM) y los filtros de paso de banda para aislar la emisión fluorescente de los fluoróforos (usamos DM560 525/50, 600/60 DM640, y 685/70, para separar YFP, y Rojo Nilo en amarillo-naranja, y canales rojo extendidas, respectivamente).
    1. Si más de 3% de los axones muestran esferoides axonales durante la exploración de línea de base (30-60 min), desechar la preparación debido a los artefactos inducidos por el experimentador.
  2. Inducir un aumento Lisci por el campo de visión a 30.3X (para crear una ablación ~ 20 m de diámetro). Tune el láser a 800 nm, y aumentar la potencia del láser a ~ 110 mW ala muestra. Permitir 5 campo completo de exploraciones visión láser para asegurar fibras están completamente seccionados.
  3. Confirme Lisci cambiando la configuración de láser a los ajustes de imagen (950 nm, 17 mW en la muestra, 2.08X) y escanear el tejido de visualizar la ablación. Compruebe el diámetro de la ablación y que los axones primarios ablación se secciona completamente (véase la figura 3D). Utilice la configuración de lapso de tiempo en el microscopio combinado con captura z para registrar la respuesta dinámica de los axones y mielina a la lesión hasta 10.8 + horas después del daño.
    NOTA: Si la ablación es incompleta (es decir, la transección incompleta de fibras), desechar la preparación, como la determinación de los mecanismos de lesión primaria y secundaria se confundió. Además, aislados segmentos de la médula espinal se pueden obtener imágenes de hasta 24 horas después de la Lisci con sólo leves daños en los tejidos Lisci-independiente a moderada.

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Representative Results

Los detalles de un laboratorio adecuado establecido necesario para aislar, mantener la viabilidad, y la imagen de la médula espinal ex vivo se muestran en la Figura 1. El microscopio debe estar equipado con un láser sintonizable de impulsos de femtosegundo, dicroics apropiados y filtros de emisión, y un agua sumergiendo lente objetivo con una apertura numérica (≥1.0). Para asegurar la viabilidad de la médula espinal durante la disección, el procedimiento se debe realizar en la presencia de frío bajo LCRa Ca 2+ oxigenada que permite suficiente Ca 2+ para las membranas axonales aislados para sellar 42. El no hacerlo puede causar daños axomyelinic incluyendo la separación de la mielina del axolema y la formación de esferoides axonal claramente visible durante la exploración basal. Imágenes representativas del proceso de disección y el aislamiento de la médula espinal ex vivo se muestran en la Figura 2. Aislamiento siguiente a la viabilidad de la médula espinal es maintained por perfusión continua de LCRa oxigenada que se mantiene a 36-37 ° C. La tinción de la mielina Rojo Nilo 27,43 puede entonces ser añadido a la cámara de perfusión, y las grabaciones de línea de base de la fascículo gracile axones mielinizados puede comenzar (Figura 3).

Imágenes representativas de fascículo los axones mielinizados gracile se muestran en la Figura 4. En condiciones basales grabaciones TPLSM timelapse revelan YFP + axones alineadas en paralelo ensheathed en la mielina (Rojo Nilo) con diámetros en gran medida constante a lo largo de la longitud del axón. Pocas esferoides axonales u otras señales morfológicas de degeneración axonal están presentes. Debido a las propiedades solvatocrómico de Rojo Nilo y los lípidos y proteínas de la mielina, la mielina se tiñe de color amarillo-naranja, mientras que las filas de los cuerpos celulares de oligodendrocitos putativo aparecen de color naranja oscuro (Figura 4A). Los detalles finos tales como nodos de Ranvier también pueden ser resueltos (por ejemplo, flechas en

A los 10 min siguientes Lisci, los axones inmediatamente seccionados (lesión primaria) situados rostral y caudal al sitio de la ablación comienzan a retraer lejos del sitio de la lesión y forman bobinas sigmoidal-como dentro de la mielina en globo hinchado. La mielina ensheathing axones a distancia para la ablación aparece sin cambios en este punto del tiempo. A los 40 minutos después de la Lisci axones y axones sometidos a la degeneración secundaria más primarios seccionados (es decir librado inicialmente desde el insulto pero degenerada después) forman endbulbs característicos como se retraen desde el lugar de la lesión (Figura 4B). Aproximadamente un tercio de estos axones seccionados se someten a pan-fragmentación donde el segmento proximal primero se hincha, forma esferoides axonales, y eventualmente transectos el axón en varias longitudes irregulares de axón 43. La separación de la mielina de los axones (peri-axonales hinchazón) y la degeneración de la mielina vesicular es también evidente. Con el tiempo, tran primaria y secundariaaxones diseccionados continuar retraer lejos del sitio de la lesión, los axones que flanquean inmediatamente el sitio de ablación se someten a la degeneración secundaria, y la inflamación peri-axonal se hace más prominente, así como hinchazón de mielina y degeneración vesicular (Figura 4D-G, véase también 43). Una clara diferencia en el grado de retracción axonal se hace evidente entre muñones proximales axonales (caudal a la lesión) y sus segmentos distales (rostral a la lesión) que están destinados a someterse a la degeneración walleriana (Figura 4D-G). Los axones inicialmente ahorrado por la Lisci someterse degeneración secundaria retardada (Figura 4H). Un experimento de control representativo sin Lisci, sugiere que son posibles sesiones de imágenes largos (hasta 13 horas después del aislamiento del cordón en este ejemplo) sin causar efectos adversos a la integridad de la materia blanca (Figura 4I, J).

Representante de alta resoimágenes Lution de cambios axomyelinic después Lisci se muestran en la Figura 5.

Por 3 horas después de Lisci, varios (caudal) axones proximales han retraída lejos del sitio de la lesión donde permanecen dentro de tubos de mielina hinchados que han separado lejos del axón. Otros endbulbs axonales parecen estar cubiertas por mielina (Figura 5A). Los axones adyacentes al sitio de ablación se someten a la degeneración secundaria mientras que otros parecen no afectado. YFP vesículas bajas / negativos putativos (azul pálido) dentro del axón y endbulbs axonal también están presentes. En contraste con caudalmente retracción de las fibras, la mayoría de los rostral de retracción axonal y endbulbs esferoides en 3 horas después de la Lisci están fuertemente marcado con Rojo Nilo (menos azul desplazado) indicativo de un cambio ambiental dentro del axón (Figura 5B). Nilo rojos marcados con áreas dentro de los axones de retracción activamente parecen rodear principal o tapar el núcleo axonal. Aunque la ubicación precisa y identity de estas estructuras marcadas con rojo Nilo intra-axonal son actualmente desconocidos, que pueden representar la acumulación de vesículas densa en transporte axonal y / o proteínas escindidas exponiendo su núcleo hidrofóbico 27. Rojo Nilo mielina etiquetado sigue siendo principalmente de color amarillo-naranja en la mielina de apariencia normal. En distinción, Rojo Nilo sondeó mielina vesicular aparece amarillo (es decir, azul cambió) indicativo de los cambios ambientales dentro de estas estructuras. A las 7 horas después de axones Lisci continúan retracción de distancia del lugar de la lesión; sin embargo, esto es más evidente en rostral (Figura 5D) versus caudal (Figura 5C) endbulbs. Otros axones sufren desintegración total o parcial dejando un tubo de mielina vacío o un tallo delgado varias micras de distancia del segmento de degeneración. Retraso en la aplicación de Rojo Nilo después Lisci revela etiquetado axonal similar previa a la solicitud de Rojo Nilo sugerente que la ablación por sí y potenciales efectos térmicos en la desnaturalización de proteínas espoco probable responsable de los cambios Rojo Nilo espectrales en la mielina y axones después de la lesión (Figura 5E, F).

Colectivamente, estos datos ilustran la utilidad del modelo ex vivo Lisci para imitar mecanismos bien conocidos pero mal entendido de lesión aguda axomyelinic en tiempo real. Por tanto, el modelo puede ser útil para promover el conocimiento de la fisiopatología de la lesión de la sustancia blanca, y descubrir dianas moleculares clave para preservar la integridad de la materia blanca.

Figura 1
Figura 1: Visión general de la configuración de la disección y de imagen. (A) A sugirió puesta a punto para ex vivo de imágenes de la médula espinal. El equipo pesado necesario incluye una carbógeno línea de gas (95% O 2 CO 2/5%) para oxigenar el LCRa, una bomba de perfusión para entregar el carbógeno-bubLCRa sangrado a través de un dispositivo en línea controlador de calentador / temperatura equipado con una sonda de realimentación de temperatura, y una cámara de formación de imágenes diseñado baño abierto equipado con una fuente de vacío. (B) Un aumento mayor de la cámara de baño de formación de imágenes se muestra. (C) A sugerido configuración para la perfusión y la disección de la médula espinal ex vivo. Bajo Ca 2+ Chilled LCRa se oxigena con carbógeno y se utiliza para mantener la viabilidad de la médula espinal durante la disección. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. El aislamiento de la médula espinal para la imagen (A) Bajo continuo refrigeradas, oxigenada bajo Ca 2+ Perfusión la SkulLCAP está expuesto. (B) Se realiza una incisión a través de la superficie dorsal del cráneo a nivel de los bulbos olfativos (línea discontinua). (C) incisiones bilaterales continuación, se realizan a través de los bordes laterales de la bóveda del cráneo hasta que pueda ser suavemente levantado y retirado caudalmente (en la dirección de la flecha) para exponer el tronco cerebral. (D) Continuar incisiones bilaterales con unas tijeras de punta fina para reducir los aspectos laterales de las vértebras y exponer las columnas dorsales (punta de flecha). (E) El expuesta se muestran tronco cerebral y toda ampliación cervical al segmento torácico superior de la médula espinal. (F) Se realizan dos incisiones con una cuchilla de bisturí número 11 para aislar la médula espinal en el tronco cerebral, más allá de las terminaciones axonales fascículo grácil y nivel torácico superior ( líneas de trazos). (G) El aislado de la médula espinal se transfiere luego a una placa de Petri que contiene bajo Ca 2 + LCRa refrigerada burbujeargas carbógeno. Raíces dorsales Cervical (por ejemplo, puntas de flecha), ganglio de la raíz dorsal y la médula espinal en el segmento torácico superior al tallo cerebral (~ 15 a 20 mm) se dejan intactos. La barra de escala en G:. 2 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3:. Imagine la médula espinal ex vivo (A) Una vez colocado en la cámara, el tejido de la médula espinal se asegura utilizando un tejido / rebanada modificado mantenga pulsada equipado con hilos de Lycra (B) La mancha mielina Rojo Nilo se añade directamente. la cámara de formación de imágenes (C) Un objetivo de inmersión en agua. se sumerge en el LCRa y se coloca sobre las fibras fascículo gracile. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. Lisci modelo de lesión axonal mielinizado centro TPLSM se utiliza para capturar la dinámica de las respuestas de los axones y mielina siguientes Lisci (*). Imágenes representativas se muestran como proyecciones de intensidad máxima de cinco 1 micras secciones ópticas gruesas capturados en 0,24 m / pixel con un microscopio + multifotón / confocal Nikon A1RMP equipado con un 25X; NA: 1,1; WD: 2 mm objetivo de inmersión en agua. Dicroicas y filtros de emisión estándar se utilizaron para separar YFP + axones (525/50 DM560, que se muestran en azul) y el colorante fluorescente lipofílica solvatocrómico Nilo Red en corto (600/60 DM640, se muestra en verde) y largo (685/70 nm, que se muestra en rojo) los canales de emisión. Las dos combinaciones de filtros últimos son ventajosas ya que la captura desplazamientos espectrales conocidas del Nilo rojas en diferentes entornos físico-químicas. (A) en condiciones basales axones (YFP +, azul) y la mielina (NR, amarillo-naranja) aparecerá normalmente orientado con pocos esferoides o otros signos de lesión axomyelinic. Filas de glía con morfología característica de los oligodendrocitos sustancia blanca (NR, naranja oscuro, por ejemplo, puntas de flecha) también son visibles (algunas marcadas para mayor claridad), y también se resuelven estructuras finas, como los nodos de Ranvier (por ejemplo, flechas). (D) A 10 min después de Lisci, los axones cortados transversalmente situados rostral y caudal a la lesión comienza a retraer lejos del sitio de la lesión y de forma sigmoidal como bobinas (flechas) dentro de la mielina hinchado. La mielina ensheathing axones alejado de la ablación aparece sin cambios en este punto de tiempo. (C) Baxones seccionados y 40 minutos después de la Lisci más primarios y axones sometidos forma degeneración secundaria endbulbs característicos como se retraen desde el lugar de la lesión (puntas de flecha). Algunos axones seccionados también forman esferoides a lo largo de la longitud de sus axones (flechas). Separación de la mielina del axón (hinchazón peri-axonales) y la degeneración vesicular de la mielina también es evidente (+). (DG). Con el tiempo, los axones primarios y secundarios lesionados siguen retraer lejos del sitio de la lesión, y como se muestra por las proyecciones yz del Lisci, axones librado inicialmente flanquean el sitio de ablación se someten retraso degeneración secundaria (H, panel de la izquierda antes de Lisci, panel central 10 minutos post-Lisci, y justo panel 7 hr después Lisci; puntos blancos marcan el inicial Lisci, puntos rojos indican la pérdida de axones por 10 min y puntos verdes indican el grado de retraso en la degeneración secundaria de los axones por 7 horas). Hinchazón Peri-axonal se hace más prominente en momentos posteriores post-Lisci. El grado of retracción axonal y la morfología de endbulbs axonal entre tocones axones proximales y sus segmentos distales también se hace evidente (véase también la Figura 5 para las imágenes de mayor aumento). Barra de escala:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Representante imágenes de alta resolución de los cambios axomyelinic después Lisci TPLSM se utilizó para capturar detalles intrincados de los axones y mielina cambia caudal (A, C) y rostral (B, D) a la lesión en 3 horas (A, B) y 7 horas (C, D) siguiente Lisci. Imágenes representativas se muestran como proyecciones de máxima intensidad de tres 1 micras secciones ópticas gruesascapturada en 0,0832 m / pixel con una Nikon A1RMP + multifotónica / microscopio confocal. (A) Caudal a la Lisci (*), varios axones (azul) se retracción lejos del sitio de la lesión (grandes puntas de flecha) dentro de tubos de mielina hinchados (amarillo-naranja ) que se han separado lejos de la endbulb axonal. Algunos axones adyacentes al sitio de ablación se someten a la degeneración secundaria (pequeñas puntas de flecha), mientras que otros parecen no afectado. YFP vesículas supuestos de baja / negativos (azul claro) dentro del axón y endbulbs axonal están presentes (flechas). Un nodo central de Ranvier (n) también es claramente visible utilizando esta técnica de imagen y etiquetado. (B) En contraste con caudalmente retracción de las fibras, la mayoría de los rostral de retracción axonal y endbulbs esferoides en 3 hrs post-Lisci están fuertemente marcado con Nilo Rojo (de color rosa). Áreas marcadas con rojo Nilo en los axones de retracción parecen rodear todo o gorra YFP axones marcados (azules, grandes puntas de flecha). Aunque la naturaleza de éstos Red-etiqueta del Niloestructuras Ed es actualmente desconocido, es posible que representan la acumulación de vesículas densa en transporte axonal y / o proteínas escindidas exponiendo su núcleo hidrofóbico. En distinción, Rojo Nilo etiquetado mielina vesicular (flechas) aparece de color amarillo (es decir, el espectro es azul desplazado) en comparación con la mielina normal (amarillo-naranja), indicativo de los cambios ambientales putativos dentro de los primeros. Hinchazón Peri-axonal es también evidentes (pequeñas puntas de flecha). A los 7 horas después de Lisci, los axones continúan retraer lejos del sitio de la lesión; sin embargo, esto es más evidente en rostral (D) versus caudal (C) endbulbs. Algunos axones sufren desintegración completa o parcial dejando un tubo vacío de mielina (flecha en C) o un delgado tallo varias micras de distancia desde el segmento de degeneración (flechas pequeñas en D), respectivamente. Retraso en la aplicación de Rojo Nilo produce desplazamientos espectrales similares en caudal versus axones mielinizados centrales rostral (E y F (C, D). Barra de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2x Stock A (2 mM Ca 2+) Reactivo mM
NaCl 252
KCl 6
CaCl 2 • 2H 2 O 4
2x Stock B NaH 2 PO 4 2.5
MgSO 4 4
NaHCO 3 52
Dextrosa (D-glucosa) 20
2x bajo Ca 2+ Stock C (0,1 mM Ca 2+) NaCl 252
KCl 6
De MgCl • 6H 2 O 3.8
CaCl 2 • 2H 2 O 0.2

Tabla 1: líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) tampones.

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

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References

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Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real
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