Protocol
1. هيدرا الثقافة وقياس الاستجابة التغذية
- الحفاظ على الاورام الحميدة هيدرا في الثقافة عن طريق تغذية لهم يوميا مع الأرتيميا وابقائها في المتوسط (1 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة، ودرجة الحموضة 7.6، 1 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم CaCl 2، 0.1 ملم بوكل، و 0.1 ملي MgSO 4) الواردة في زجاج وعاء عند 18 درجة مئوية تحت 12 ساعة ضوء لمدة 12 ساعة دورات مظلمة كما هو موضح سابقا (12).
- لقياس استجابة للتغذية، ونقل احد تنضج سليلة هيدرا وجود بين 5 و 6 مخالب لبئر واحد من 24 لوحة جيدا. إزالة المتوسطة المتبقية من البئر عن طريق إمالة، ثم تضاف على الفور 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
- تحضير 9 ميكرومتر حل الجلوتاثيون في المتوسط حيدرة. منذ حل الجلوتاثيون هو عرضة للأكسدة، استخدم دائما حل الجلوتاثيون الطازجة لكل تجربة.
- نقل لوحة لمنصة التصوير من المجهر وجود أحكام لتسجيل الصورة. استخدام خلفية داكنة تلك التي س السلوكو سليلة هيدرا يمكن تصويرها بشكل واضح على خلفية المتناقضة.
- غرفة تستخدم للمراقبة والتصوير سلوك هيدرا خالية من الأضواء من تذبذب شدة، وتيارات الهواء والضوضاء. يمكن لهذه الاضطرابات أيضا أن يسبب ورم هيدرا لتظهر انكماش مخالب - حتى في حالة عدم وجود الجلوتاثيون.
- السماح للورم للاسترخاء لمدة 5 دقائق.
- تأكد من أن ورم يقع على طول المنطقة الوسطى من مثل جيدا أن السلوك يمكن تصويرها بشكل واضح. إذا كانت سليلة هو على حافة البئر، وإحضاره إلى المركز من قبل بيغ المتوسطة باستخدام ماصة والسماح لها مرة أخرى للاسترخاء.
- التقاط صورة من هيدرا في حالة استرخاء. وستكون هذه الملاحظة نقطة الصفر مرة.
- بسرعة إضافة 9 ميكرومتر حل الجلوتاثيون للوصول إلى تركيز النهائي من 3 ميكرومتر في البئر. اعتمادا على الغرض من التجربة والرد الذي أبداه هيدرا، واختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من الجلوتاثيون وتشوحد ذاته تركيز مناسب المطلوبة.
- بدء الموقت فورا بعد إضافة حل الجلوتاثيون والتقاط الصور بعد كل 15-30 ثانية لمدة 4-5 دقيقة. لا تغيير إعدادات التكبير خلال الوقت الفاصل بين التصوير.
- إضافة محلول الجلوتاثيون بلطف ومع تدفق موحد من هذا القبيل أن موقف الحيوان في البئر سوف تضطرب طفيفة في مجال الرؤية من المجهر. ومع ذلك، إذا يتحرك سليلة على نطاق واسع بعد إضافة حل الجلوتاثيون، حرك لوحة بلطف جدا لجلب ورم في مجال الرؤية لالتقاط الصور.
- في تجربة السيطرة، واستخدام تفتقر المتوسطة الجلوتاثيون مع الحفاظ على جميع المعلمات أخرى مماثلة.
- تأكد من تنفيذ كافة الخطوات التجريبية السابقة خلال النصف الأول من اليوم - قبل 13:00 لتجنب التأثير المحتمل لإيقاع الساعة البيولوجية على مدى استجابة التغذية.
- فتح كل واحدة من الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج التلاعب جنو صورة (الأعرج). استخدام "القياس" وسيلة متاحة من القائمة> الأدوات> قياس لتحديد المسافة بين نهاية قمية كل من مخالب والكارح. إذا لاحظت فتحة الفم في أي من الصور، وتحديد المسافة بين وسط الفم وافتتح نهاية قمية من اللامسة. الرجوع إلى هذه المسافة مع انتشار اللامسة.
- حساب معدل انتشار اللامسة لكل ورم قبل وبعد التعرض الجلوتاثيون. حساب متوسط نسبة انتشار اللامسة عند نقطة الصفر مرة لأنه في كل لاحقة نقاط الوقت. وسوف يطلق هذا نسبة انتشار اللامسة النسبي.
- تكرار القياسات لا يقل عن 20 البوليبات.
2. طريقة التحقق من صحة استخدامالمجاعة نموذج
- لالمجاعة، ونقل بعض الاورام الحميدة هيدرا إلى وعاء زجاجي منفصل ولا إطعامهم لمدة 5 أيام. إطعام مجموعة مراقبة من بضعة الاورام الحميدة يوميا مع الأرتيميا في وعاء مماثل الحجم. تغيير المتوسطة من كلا التجريبية الأوعية يوميا لتجنب نمو الفطريات في المتوسط.
- في يوم من التجربة، وإطعام مجموعة مراقبة من هيدرا مع الأرتيميا لمدة 1 ساعة واستخدام هذه هيدرا لتجارب لاحقة بعد إزالة جميع الأرتيميا غير مأكول وميت من المتوسط.
- قياس استجابة للتغذية هيدرا تجويع بالمقارنة مع هيدرا من المجموعة الضابطة التي كتبها الطريقة الموضحة في الخطوة 1. في وقت سابق لتفادي أي تحيز بسبب وقت الرصد، بالتناوب قياسات كل من تجويع الاورام الحميدة والسيطرة هيدرا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسبب الجلوتاثيون هيدرا لتظهر الشباك من مخالب نحو الفم لغرض تجتاح فريسة. مثل هذا الشباك من مخالب يجلب نهايات قمية من مخالب أقرب إلى الكارح. هذا يؤدي إلى انخفاض في انتشار اللامسة، أو المسافة الخطية بين نهاية قمية من اللامسة والكارح (الشكل 1). انتشار اللامسة النسبي، أو نسبة متوسط اللامسة انتشر قبل وبعد إضافة الجلوتاثيون، بلغ متوسط عبر الاورام الحميدة متعددة يقلل بمرور الوقت. انتشار اللامسة النسبي بعد إضافة وسيلة تفتقر الجلوتاثيون، ومع ذلك، يقلل بشكل عابر فقط ويبلغ قيمة الوحدة في حوالي دقيقة واحدة (الشكل 2). ومن المعروف أن يسبب المجاعة تعزيز سلوك التغذية الناجم عن الجلوتاثيون 1،13. تم التحقق من صحة طريقة لقياس سلوك التغذية الموصوفة هنا من النموذج المجاعة. نشر اللامسة دقيقة واحدة بعد أن كان مضيفا الجلوتاثيون significantlذ أقل للمجموعة تجويع بالمقارنة مع مجموعة الاشباع (ع = 1 × 10 -16 من خلال تطبيق اثنين من الذيل اختبار t مع تباين يساوي) (الشكل 3).
الشكل 1: طريقة قياس معدل انتشار اللامسة. وسجلت صورة لورم هيدرا استرخاء قبل إضافة GSH وتم قياس المسافة الخطية بين الفم ونهاية قمية كل من اللامسة للورم من حيث عدد البكسل باستخدام أداة الأعرج. تم القبض على صورة أخرى بعد إضافة GSH وتم قياس انتشار اللامسة بطريقة مماثلة.
الشكل 2: الكميات من الاستجابة التغذية الناجم عن GSH في حيدرة. Tentacنشر جنيه في نقاط زمنية مختلفة، بعد إضافة تم قياس GSH كما هو موضح في الشكل (1) وكان يرمز انتشار اللامسة النسبي كنسبة من اللامسة انتشر قبل وبعد إضافة GSH (ن = 14). القيم لتمثل المجموعة الضابطة انتشار اللامسة النسبي بعد إضافة المتوسطة هيدرا دون GSH (ن = 14). الحانات الأخطاء تمثل ± SEM.
الرقم 3: التحقق من طريقة الكميات الاستجابة التغذية باستخدام نموذج المجاعة. المحور السيني يمثل الزمن بعد إضافة 3 ميكرومتر GSH للتجويع (ن = 61) والاشباع (ن = 66) مجموعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سلوك التغذية في حيدرة يمثل واحدا من أكثر أنظمة حسي كيميائي الأجداد في metazoans. على الرغم من أن تم الكشف عن وجود الجلوتاثيون في السائل القشريات صدر بعد بمساعدة كيسة خيطية التقاط الفريسة منذ فترة طويلة 1، وقد تميزت أيا من البروتين GSHR ولا المفترض الجين الترميز / ث من هيدرا حتى الآن. وقد بذلت محاولات قليلة لوصف GSH البروتينات ملزمة في هيدرا 8 و 14 و 15. ومع ذلك، فإن هوية هذه البروتينات المستقبلة المفترضة تبقى المكونات الجزيئية الأخرى غامضة وقليلة جدا، والتي من المحتمل أن تساهم في تغذية رد الفعل، وقد أبلغ ل تاريخ 16 و 17. وGSHR يتميز فقط في المملكة الحيوانية هو من 18 ذهبية. التقنيات التقليدية، مثل استخدام مثبطات البروتينات المختلفة للإشارات شلال النوع من الاختزال، وكذلك التقنيات البيولوجية الجزيئية المتقدمة (رني بوساطة إسكات الجينات وكريسبر-Cas9 بوساطة تحرير الجينوم)، يمكن أن توفر الأسرىأدوات erful لتحديد المكونات الجزيئية للGSH يشير شلال في حيدرة. إن قراءات scorable من مثل هذا التعبير تغير وظيفة من وظائف مستقبلات والمكونات الأخرى للإشارة GSH يتم تغيير السلوك التغذية. ولذلك كان من الضروري ابتكار طريقة لقياس استجابة للتغذية في هيدرا الناجمة عن GSH.
ظاهريا، واستجابة للتغذية تتضمن الشباك من مخالب نحو الفم وافتتاح احق من الفم. الاستفادة من الملاحظة السابقة قمنا بتطوير طريقة بسيطة وقوية من quantitating سلوك التغذية الذي ينطوي على قياس المسافة بين طرفي قمية من اللامسة والفم. لا بد من (1) استخدام الحل GSH الطازجة، (2) استخدام التركيز المناسب من GSH، و (3) إجراء تجربة في المختبر وجود شدة الضوء موحدة وليس التيارات الهوائية القوية في الحصول على قياس استنساخه ل GSH-الزميلةد سلوك التغذية. ويمكن أيضا أن سلوك التغذية مثل استجابة يكون ذلك حافزا ماديا ببساطة عن طريق إضافة المتوسطة تفتقر GSH. ومع ذلك، فإن مثل هذا السلوك هو عابر وليس ملحوظ بعد 15-30 ثانية. لذا، كان من الضروري أن تشمل هذه الرقابة في التجربة وقياس مدى استجابة التغذية إلا بعد هذا الرد سببها اضطراب الميكانيكية وتوقفت تماما. لتقليل التباين في الميكانيكي الناجم عن اضطراب tentacular الانكماش الناجم عن معدل التدفق المتغير الذي يضاف حل الجلوتاثيون، سيكون من الممكن أيضا أن تكون بديلا الاستغناء اليدوي من محلول الاختبار مع جهاز ميكانيكي كما هو موضح سابقا (19). صرف الآلي من شأنه حل الجلوتاثيون تمكين تشديد الرقابة على حجم واتجاه التحفيز الميكانيكي بحيث أنها يمكن أن تكون موحدة في جميع الأحداث والاستغناء بالتالي تطبيع داخليا.
في هذه الطريقة، يتم قياس انتشار اللامسة عبر جهازي ديأبعادها. في حين أنه في الواقع، كما انتشر عدد قليل من مخالب على طول المحور الثالث لافتا نحو المراقب. وبالمثل، فإن التوجه من مخالب يمكن أن تتغير بعد إضافة الجلوتاثيون. ومع ذلك، في المتوسط اللامسة المنتشرة في أرجاء متعددة من مخالب سليلة واحدة وكذلك عبر الاورام الحميدة متعددة تطبيع التحيز الذي عرضته قياسات ثنائية الأبعاد فضلا عن التوجه تغير من مخالب. نقترح أن الاورام الحميدة التي تتحرك على هامش الشديد من البئر، حيث الملاحظة واضحة عن مخالب ليست دائما ممكنة، يتم استبعادها من التحليل. وعلاوة على ذلك، مع انتشار اللامسة النسبي، وهي نسبة اللامسة انتشر قبل وبعد إضافة GSH، وليس القيمة المطلقة للانتشار اللامسة بعد العلاج GSH، كمقياس للاستجابة التغذية قد يؤدي إلى التقليل من التباين الناجم عن تقلب في طول اللامسة من الاورام الحميدة الفردية. هذا البروتوكول لقياس feedi الناجم عن الجلوتاثيونرد نانوغرام يمكن أن يكون مفيدا أيضا للجميع الأنواع هيدرا. لقياس انتشار اللامسة في الصور التي تم الحصول عليها من عدد كبير من السكان من هيدرا، سيكون من الممكن أيضا لكتابة الخوارزمية الكمبيوتر مماثلة لتلك المتاحة لتحليل سلوك الحيوان 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
