מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Protocol

1. הידרה תרבות ומדידה של תגובת ההאכלה

1. לשמור על פוליפים מפלצת בתרבות על ידי האכלה להם מדי יום עם הארטמיה ולשמור אותם במדיום (חיץ 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6, 1 מ"מ NaCl, 1 מ"מ CaCl _2, 0.1 מ"מ KCl, ו0.1 מ"מ MgSO ₄₎ הכלולים ב קערת זכוכית על 18 מעלות צלזיוס תחת מחזורים כהים שעות אור-12 12 שעות כפי שתוארה קודם לכן ^12.
2. למדידת תגובת ההאכלה, להעביר את אחד להבשיל פוליפ מפלצת שיש 5 עד 6 זרועות ולבודדות של צלחת 24 גם. הסר את מדיום השייר מהבאר על ידי הטיית אותו, ולאחר מכן להוסיף באופן מיידי 500 μl של מדיום חדש.
3. הכן פתרון גלוטתיון 9 מיקרומטר במדיום מפלצת. מאז פתרון גלוטתיון הוא נוטה לחמצון, תמיד להשתמש בפתרון גלוטתיון מוכן טרי עבור כל ניסוי.
4. העבר את הצלחת לפלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ שיש הפרשות להקלטת תמונה. השתמש ברקע כהה באופן שo ההתנהגותפוליפ מפלצת F ניתן הדמיה בבירור על הרקע המנוגד.
5. החדר המשמש לצפייה והדמית ההתנהגות חופשית מפלצת מאורות בעוצמות משתנות, זרמי אוויר ורעש. הפרעות כאלה עלולות לגרום גם פוליפ המפלצת להראות התכווצות של זרועות - גם בהיעדרו של גלוטתיון.
6. לאפשר פוליפ להירגע במשך 5 דקות.
7. ודא שפוליפ ממוקם לאורך האזור המרכזי של הבאר, כך שההתנהגות ניתן הדמיה ברורה. אם פוליפ הוא בקצה של הבאר, להביא אותה למרכז על ידי שטיפה הבינוני באמצעות פיפטה ושוב לאפשר לו להירגע.
8. ללכוד תמונה של מפלצת במצב רגוע. זה יהיה תצפית נקודת אפס-הזמן.
9. להוסיף במהירות 9 מיקרומטר פתרון גלוטתיון להגיע לריכוז סופי של 3 מיקרומטר בבאר. בהתאם לצורך של הניסוי והתגובה מוצג על ידי מפלצת, לבדוק מגוון של ריכוזים שונים של גלוטתיון וChoose הריכוז המתאים הנדרש.
10. להפעיל את הטיימר מייד לאחר הוספת פתרון גלוטתיון וללכוד תמונות אחרי כל שניות 15-30 ל4-5 דקות. אין לשנות את הגדרות ההגדלה במהלך ההדמיה הזמן לשגות.
11. מוסיף את פתרון גלוטתיון בעדינות ובזרימה אחידה כך שעמדתו של בעל החיים ובתהיה מוטרדת מינימאלית בשדה הראייה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם פוליפ נע בהרחבה לאחר הוספת פתרון גלוטתיון, להזיז את הצלחת בעדינות רבה כדי להביא את פוליפ בשדה הראייה ללכידת תמונה.
12. בניסוי השליטה, להשתמש במדיום חסר גלוטתיון תוך שמירה על כל הפרמטרים האחרים זהים.
13. הקפד לבצע את כל שלבי ניסוי מעל במחצית הראשונה של היום - לפני 13:00 להימנע ההשפעה האפשרית של קצב היממה על מידת היענות האכלה.
14. פתח כל אחת מהתמונות שנתפסו באמצעות תכנית GNU תמונת מניפולציה (GIMP). השתמש בכלי "מדוד" זמין מתפריט> כלים> למדוד כדי לקבוע את המרחק בין קצה קודקוד של כל אחד מהזרועות וhypostome. אם פתיחת הפה הוא ציין בכל אחת מהתמונות, לקבוע את המרחק בין המרכז של הפה נפתח וסוף הפסגה של הזרוע. עיין במרחק זה כמו התפשטות הזרוע.
15. לחשב את התפשטות הזרוע הממוצעת לכל פוליפ לפני ואחרי חשיפת גלוטתיון. לחשב את היחס של התפשטות זרוע ממוצעת בנקודת אפס זמן לזה שבכל אחד מנקודתי הזמן שלאחר מכן. יחס זה נקרא התפשטות זרוע היחסית.
16. חזור על מדידות לפחות 20 פוליפים.

2. שיטת אימות באמצעותדגם רעב

1. לרעב, להעביר כמה פוליפים הידרה לקערת זכוכית נפרדת ולא להאכיל אותם במשך 5 ימים. להאכיל את קבוצת הביקורת של כמה פוליפים יומיים עם הארטמיה בקערה בגודל דומה. לשנות את המדיום משני ניסויי קערות יומיים, כדי למנוע צמיחת פטרייה במדיום.
2. ביום של הניסוי, להאכיל את קבוצת הביקורת של מפלצת עם הארטמיה עבור שעה 1 ולהשתמש בהידרה אלה לניסויים הבאים לאחר הסרת כל הארטמיה לא נאכלה ומת מהמדיום.
3. למדוד את תגובת ההאכלה של המפלצת הרעבה בהשוואה למפלצת מקבוצת ביקורת בשיטה שתוארה קודם לכן בשלב 1. כדי למנוע כל הטיה בשל זמן של התבוננות, להחליף את המידות של כל אחד מרעב ולשלוט פוליפים מפלצת.

Representative Results

גלוטתיון גורם מפלצת להציג סלסול של זרועות לכיוון הפה לצורך שוטף את הטרף. סלסול כזה של זרועות מביא קצות הפסגה של זרועות קרובה יותר לhypostome. התוצאה היא ההפחתה במרווח הזרוע, או את המרחק ליניארי בין סוף הפסגה של הזרוע וhypostome (איור 1). ההתפשטות היחסית הזרוע, או היחס של זרוע ממוצעת להתפשט לפני ואחרי הוספת גלוטתיון, בממוצע על פני פוליפים מרובים מפחיתה לאורך זמן. התפשטות הזרוע היחסית לאחר תוספת של המדיום חסר גלוטתיון, לעומת זאת, מפחיתה רק זמנית ומשיגה ערך יחידה בתוך כדקה (איור 2). רעב ידוע כגורם לשיפור של ההאכלה הנגרמת על ידי גלוטתיון ^1,13 ההתנהגות. שיטת מדידת ההאכלה מתוארת כאן ההתנהגות שאומתה על ידי מודל הרעב. הזרוע להפיץ דקה אחת לאחר גלוטתיון הוספה היה significantly נמוך יותר עבור הקבוצה הרעבה בהשוואה לקבוצה שבע (p = 1 x 10 ^-16 על ידי יישום שני מבחן t זנב עם שונות שווים) (איור 3).

איור 1: שיטה למדידת התפשטות זרוע ממוצעת. תמונה של פוליפ מפלצת רגוע נרשמה לפני הוספת GSH ומרחק ליניארי בין הפה וסיום הפסגה של כל אחד מהזרוע של פוליפ נמדד במונחים של מספר הפיקסלים שימוש באפשרות GIMP. תמונה נוספת נתפסה לאחר הוספת GSH והתפשטות הזרוע נמדדה באופן דומה.

איור 2: Quantitation של תגובת ההאכלה מושרה GSH במפלצת. Tentacle התפשט בזמן נקודות שונות לאחר הוספת GSH נמדד כמתואר באיור 1 והתפשטות זרוע יחסית מסומנת כיחס של זרוע להפיץ לפני ואחרי הוספת GSH (n = 14). הערכים לקבוצת הביקורת מייצגים את התפשטות הזרוע היחסית לאחר תוספת של מדיום מפלצת ללא GSH (n = 14). ברים שגיאות מייצגים ± SEM.

איור 3: תיקוף השיטה לכמת את תגובת ההאכלה באמצעות מודל רעב. ציר ה- X מייצג את הזמן לאחר תוספת של 3 מיקרומטר GSH ל( n = 66) קבוצות מורעבות (n = 61) והשבעה.

Discussion

התנהגות אכילה בהידרה מייצגת את אחת ממערכות chemosensory האבות ביותר בmetazoans. למרות הנוכחות של GSH בנוזל הסרטנים שוחרר לאחר לכידת טרף בסיוע nematocyst זוהתה מזמן ^1, לא חלבון GSHR ולא את גן הקידוד המשוער / s מתאפיינת ממפלצת עד כה. ניסיונות מעטים שנעשו לאפיין GSH מחייב חלבונים במפלצת ^{8, 14, 15.} עם זאת, זהותם של חלבוני הקולטן המשוערים אלה נשאר רכיבים מעורפלים ומעט מאוד אחרים מולקולריים, אשר עשוי לתרום לתגובת ההאכלה, כבר דיווחו ל תאריך ^{16, 17.} GSHR המאופיין רק בממלכת החי הוא מדג הזהב ^18. טכניקות קלאסיות, כגון שימוש במעכבים של חלבונים שונים של מפל איתות GPCR כמו גם השיטות ביולוגיות מולקולריות המתקדמות (השתקת RNAi בתיווך גן ועריכת הגנום תיווך CRISPR-Cas9), יכול לספק powכלים עוצמתית במיוחד, לזיהוי המרכיבים המולקולריים של GSH מפל איתות במפלצת. קריאת scorable על כך ביטוי שינה ותפקוד של הקולטן ורכיבים האחרים של איתות GSH היה משתנה התנהגות האכלה. לכן היה חיוני להמציא שיטה למדידת תגובת ההאכלה במפלצת הנגרמת על ידי GSH.

Phenotypically, תגובת ההאכלה כרוכה סלסול של זרועות לכיוון הפה והפתיחה הבאה של הפה. ניצול התצפית לשעבר פיתחנו שיטה פשוטה וחזקה של quantitating התנהגות ההאכלה הכוללת מדידת המרחק בין קצות הפסגה של הזרוע והפה. זה חיוני כדי (1) להשתמש בפתרון GSH מוכן הטרי, (2) להשתמש בריכוז המתאים של GSH, ו- (3) לבצע את הניסוי במעבדה שיש עוצמות אור אחידות ואין זרמי אוויר חזקים כדי להשיג את המדידה לשחזור של GSH-עמיתד התנהגות אכילה. התנהגות אכילה כמו תגובה-גם יכולה להיגרם מבחינה פיזית פשוט על ידי הוספה בינונית חסר GSH. עם זאת, התנהגות כזו היא זמנית ולא מורגשת אחרי 15-30 שניות. לכן, היה צורך לכלול בקרה זו בניסוי וכדי למדוד את תגובת ההאכלה רק לאחר התגובה כזו נגרמת על ידי ההפרעה המכאנית חדלה לחלוטין. כדי למזער את השינוי בהתכווצות זרועות הציד המכנית הנגרמת הפרעה שנגרמה על ידי קצב זרימה משתנה עם איזה פתרון גלוטתיון הוא הוסיף, זה יהיה גם אפשרי להחליף מחלק ידני של פתרון המבחן עם מכשיר מכאני כפי שתואר קודם לכן ^19. מחלק ממוכן של פתרון גלוטתיון יאפשר שליטה טובה יותר על הגודל והכיוון של גירוי מכאני כך שזה יכול להיות אחיד על פני כל אירועי הניפוק ולכן מנורמלים פנימי.

בשיטה זו, התפשטות הזרוע נמדדת על פני שני dimensions; ואילו במציאות, כמה מזרועותיהם התפשטו גם לאורך הציר השלישי והצביע לעבר הצופה. בדומה לכך, הכיוון של זרועות יכול לשנות לאחר הוספת גלוטתיון. עם זאת, ממוצע של הזרוע התפשטה על פני זרועות מרובות של פוליפ אחת, כמו גם על פני פוליפים מרובים מנרמל את ההטיה הוצגה על ידי מדידות דו-ממדיות, כמו גם את כיוון השינוי של זרועות. אנו מציעים כי הפוליפים שיעברו לפריפריה הקיצונית של הבאר, שבו תצפית ברורה של זרועות היא לא תמיד אפשרית, להיות נכללים בניתוח. יתר על כן, לוקח את ההתפשטות היחסית זרוע, שהוא היחס של זרוע להפיץ לפני ואחרי הוספת GSH, ולא את הערך המוחלט של זרוע ההתפשטות לאחר טיפול GSH, כמדד לתגובת האכלה עלול לגרום למזעור הווריאציה הנגרמת על ידי השתנות באורך הזרוע של הפוליפים הבודדים. פרוטוקול זה של מדידת feedi מושרה גלוטתיוןתגובת ng יכולה להיות באותה מידה שימושית לכל מיני המפלצת. למדידת זרוע התפשטות בתמונות המתקבלות מאוכלוסיות גדולות של מפלצת, זה יהיה גם אפשר לכתוב אלגוריתם מחשב דומה לאלה זמינים עבור הניתוח של התנהגות בעלי החיים ^20.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cooled Incubator	Panasonic	MIR-254-PE
Microscope	Leica	S8AP0
Camera for the microscope	Leica	EC3
Reduced glutathione	Sigma	G4251	Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program	GIMP	Version 2.8