Protocol
1. Hydra Cultura y medición de la respuesta de alimentación
- Mantener pólipos Hydra en cultivo mediante la alimentación diariamente con artemia y mantenerlos en un medio (mM de tampón Tris-HCl 1, pH 7,6, NaCl 1 mM, 1 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl, y 0,1 mM MgSO 4) contenida en una tazón de vidrio a 18 ° C por debajo de 12 hr hr luz-12 ciclos oscuros como se describe anteriormente 12.
- Para la medición de la respuesta de alimentación, transferir uno maduro pólipo hidra que tiene de 5 a 6 tentáculos a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Retire el medio residual del bien por la inclinación, y luego añadir inmediatamente 500 l de medio fresco.
- Prepare la solución de glutatión 9 M en medio hidra. Dado que la solución de glutatión es propenso a la oxidación, siempre utilizar la solución de glutatión recién preparado para cada experimento.
- Transferencia de la placa a la plataforma de imágenes de un microscopio que tiene disposiciones para la grabación de imágenes. Utilice un fondo oscuro de manera que el comportamiento of pólipo hidra puede ser claramente fotografiado contra el fondo de contraste.
- La sala utilizada para observar y obtener imágenes del comportamiento de hidra libre de las luces de intensidades fluctuantes, las corrientes de aire y el ruido. Tales perturbaciones también podrían causar el pólipo hidra para mostrar la contracción de los tentáculos - incluso en ausencia de glutatión.
- Deje que el pólipo se relaje durante 5 min.
- Asegúrese de que el pólipo se encuentra a lo largo de la región central del pozo de manera que el comportamiento se pueden obtener imágenes con claridad. Si el pólipo está en el borde del pozo, llevarlo al centro de lavado del medio utilizando una pipeta y otra vez permitir que se relaje.
- Captura de una imagen de la hidra en el estado relajado. Este será el punto de observación en tiempo cero.
- Añadir rápidamente 9 M solución de glutatión para llegar a una concentración final de 3 mM en el pozo. Dependiendo de la finalidad del experimento y la respuesta mostrada por hydra, ensayar una serie de diferentes concentraciones de glutatión y ChooSE La concentración apropiada requerida.
- Inicie el temporizador inmediatamente después de añadir la solución de glutatión y capturar imágenes después de cada 15-30 segundos durante 4-5 min. No cambie la configuración de ampliación durante el time-lapse.
- Añadir la solución de glutatión suavemente y con flujo uniforme de tal manera que la posición del animal en el pozo se vería perturbado mínimamente en el campo de visión del microscopio. Sin embargo, si el pólipo se mueve ampliamente después de la adición de solución de glutatión, mover muy suavemente la placa para llevar el pólipo en el campo de visión para la captura de imagen.
- En el experimento de control, utilice medio que carece de glutatión, manteniendo todos los demás parámetros idénticos.
- Asegúrese de realizar todos los pasos experimentales anteriores durante la primera mitad del día - antes de 13:00 para evitar el posible efecto del ritmo circadiano de la magnitud de respuesta de alimentación.
- Abra cada una de las imágenes capturadas utilizando el GNU Image Manipulation Program (GIMP). Utilice la herramienta de "Medida" disponible en Menú> Herramientas> Medir para determinar la distancia entre el extremo apical de cada uno de los tentáculos y hipostoma. Si se observa la abertura de boca en cualquiera de las imágenes, determinar la distancia entre el centro de la boca abierta y el extremo apical de la tentáculo. Consulte esta distancia como la propagación tentáculo.
- Calcular el diferencial medio tentáculo para cada pólipo antes y después de la exposición glutatión. Calcular la relación de promedio propagación tentáculo en el punto de tiempo cero para que en cada uno de los puntos de tiempo posteriores. Esta relación se denomina propagación tentáculo relativa.
- Repetir las mediciones para al menos 20 pólipos.
2. Método de validación mediante elEl hambre Modelo
- Para el hambre, transferir unos pólipos hidra a un recipiente de vidrio separada y no darles de comer durante 5 días. Pase el grupo de control de unos pólipos diario con artemia en un recipiente de tamaño similar. Cambie el medio de copas de ambos experimental diaria para evitar el crecimiento de hongos en el medio.
- En el día del experimento, alimentar al grupo de control de hidra con artemia durante 1 hora y utilizar estos hidra para los experimentos posteriores después de la eliminación de todos artemia sin comer y muertos desde el medio.
- Medir la respuesta de alimentación de la hidra de hambre en comparación con la hidra de grupo de control por el método descrito anteriormente en el paso 1. Para evitar cualquier sesgo debido a momento de la observación, alternar las mediciones de cada uno de los hambrientos y controlar pólipos hidra.
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Representative Results
El glutatión provoca hydra exponer rizado de los tentáculos hacia la boca con el propósito de que envuelve la presa. Tal rizado de tentáculos trae extremos apicales de los tentáculos más cerca de la hipostoma. Esto resulta en la reducción de la propagación tentáculo, o la distancia lineal entre el extremo apical del tentáculo y hipostoma (Figura 1). La propagación tentáculo relativa, o la relación de tentáculo promedio propagan antes y después de la adición de glutatión, promediados a través de múltiples pólipos reduce con el tiempo. La propagación tentáculo relativa después de la adición del medio que carece de glutatión, sin embargo, reduce sólo transitoriamente y alcanza el valor unitario en alrededor de un minuto (Figura 2). El hambre se sabe que causa la mejora de la conducta alimentaria inducida por el glutatión 1,13. El método de medir el comportamiento de alimentación descrito aquí fue validado por el modelo de inanición. El tentáculo se extendió un minuto después de la adición de glutatión era significantly menor para el grupo de hambre, en comparación con el grupo saciado (p = 1 x 10 -16 mediante la aplicación de dos colas t-test con igual varianza) (Figura 3).
Figura 1: Método de medición de promedio propagación tentáculo. Una imagen de un pólipo hidra relajado se registró antes de la adición de GSH y la distancia lineal entre la boca y el extremo apical de cada uno de los tentáculos del pólipo se midió en términos de número de píxeles con la herramienta GIMP. Otra imagen fue capturada después de la adición de GSH y la propagación tentáculo se midió de manera similar.
Figura 2: La cuantificación de la respuesta de alimentación inducida GSH-en hidra. TentacLe extendió en diferentes puntos de tiempo después de la adición de GSH se midió como se describe en la Figura 1 y la propagación tentáculo relativa se denota como una proporción de tentáculo extendido antes y después de la adición de GSH (n = 14). Los valores para el grupo de control representan la propagación tentáculo relativa después de la adición de medio de hidra sin GSH (n = 14). Errores barras representan ± SEM.
Figura 3: Validación del método de cuantificación de la respuesta de alimentación utilizando el modelo de inanición. Eje X representa el tiempo después de la adición de 3 mM GSH para (n = 61) y saciadas (n = 66) grupos hambrientos.
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Discussion
La alimentación en el comportamiento hidra representa uno de los sistemas quimiosensoriales más ancestrales en los metazoos. Aunque la presencia de GSH en el fluido crustáceo en libertad después de la captura de presas nematocisto asistida se detectó hace mucho tiempo 1, ni la proteína GSHR ni los genes de codificación putativo / s se han caracterizado desde hidra hasta la fecha. Pocos intentos se han realizado para caracterizar las proteínas de unión GSH en Hydra 8, 14, 15. Sin embargo, la identidad de estas proteínas receptor putativo permanece otros componentes moleculares oscuras y muy pocos, que son propensos a contribuir a la reacción de alimentación, se ha informado de fecha 16, 17. La única GSHR caracterizado en el reino animal es de 18 peces de colores. Las técnicas clásicas, como el uso de los inhibidores de varias proteínas de la cascada de señalización de GPCR, así como las técnicas de biología molecular avanzada (RNAi silenciamiento génico mediado y edición genoma mediada CRISPR-Cas9), puede proporcionar powherramientas erful para la identificación de los componentes moleculares de la cascada de señalización de GSH en hidra. La lectura scorable de tal expresión alterada y función del receptor y los otros componentes de la señalización de GSH se alteraría el comportamiento de alimentación. Por consiguiente, era esencial para idear un método para medir la respuesta de alimentación en hidra inducida por GSH.
Fenotípicamente, la respuesta de alimentación implica rizado de los tentáculos hacia la boca y la posterior apertura de la boca. Utilizando la observación anterior hemos desarrollado un método simple y robusto de cuantificar el comportamiento de alimentación que consiste en medir la distancia entre los extremos apicales del tentáculo y la boca. Es esencial (1) utilizar la solución recién preparada GSH, (2) utilizar la concentración apropiada de GSH, y (3) realizar el experimento en el laboratorio que tiene intensidades de luz uniforme y no hay fuertes corrientes de aire para obtener la medida reproducible de la GSH-asociadod comportamiento de alimentación. Comportamiento de respuesta como la alimentación también puede ser inducida físicamente simplemente añadiendo medio que carece de GSH. Sin embargo, tal comportamiento es transitorio y no se nota después de 15 a 30 seg. Por lo tanto, era necesario incluir este control en el experimento y para medir la respuesta de alimentación sólo después de tales la respuesta provocada por la perturbación mecánica está completamente cesó. Para minimizar la variación de la contracción inducida tentacular perturbación mecánica causada por la tasa de flujo variable con el que se añadió una solución de glutatión, también sería factible sustituir dispensación manual de la solución de ensayo con un dispositivo mecánico como se describió anteriormente 19. Mecanizado de dispensación de la solución de glutatión permitiría un control más estricto de la magnitud y la orientación del estímulo mecánico de tal manera que podría ser uniforme a través de todos los eventos de dispensación y por lo tanto normalizado internamente.
En este método, la propagación tentáculo se mide a través de dos dimensiones; mientras que en realidad, algunos de los tentáculos también se extienden a lo largo del tercer eje que apunta hacia el observador. Del mismo modo, la orientación de los tentáculos puede cambiar después de la adición de glutatión. Sin embargo, promediando el tentáculo extendido a través de múltiples tentáculos de un solo pólipo, así como a través de múltiples pólipos normaliza el sesgo introducido por las mediciones de dos dimensiones, así como la orientación cambiante de los tentáculos. Sugerimos que los pólipos que se mueven a la extrema periferia del pozo, donde la observación clara de los tentáculos no siempre es factible, se excluyeron del análisis. Además, teniendo la propagación tentáculo relativa, que es la relación de tentáculo extendido antes y después de la adición de GSH, y no el valor absoluto de la propagación tentáculo después del tratamiento GSH, como medida de la respuesta de alimentación puede dar lugar a la minimización de la variación inducida por la variabilidad en la longitud de tentáculos de los pólipos individuales. Este protocolo de medición de la feedi inducida glutatión-ng respuesta podría ser igualmente útil para todas las especies de hidra. Para medir la extensión tentáculo en las imágenes obtenidas a partir de grandes poblaciones de hydra, también sería posible escribir un algoritmo informático similares a los disponibles para el análisis del comportamiento animal 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
