Protocol
1. Hydra culture et la mesure de la réponse d'alimentation
- Maintenir polypes hydra en culture en les alimentant tous les jours avec des artémias et les conserver dans un moyen (1 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 0,1 mM de KCl, 0,1 mM et MgSO 4) contenu dans un bol verre à 18 ° C sous la lumière 12 h 12 cycles sombres de h comme décrit plus haut 12.
- Pour mesurer la réponse d'alimentation, de transfert d'âge mûr polype hydre ayant 5 à 6 tentacules à un seul puits d'une plaque de 24 puits. Retirez le moyen résiduel du bien en l'inclinant, puis ajouter immédiatement 500 pi de milieu frais.
- Préparer la solution de glutathion 9 uM dans le milieu hydre. Etant donné que la solution de glutathion est sujette à l'oxydation, en utilisant toujours une solution fraîchement préparée de glutathion pour chaque expérience.
- Transférer la plaque de la plate-forme de formation d'image d'un microscope comportant des dispositifs pour l'enregistrement de l'image. Utilisez un fond sombre telle que le comportement opolype hydre f peut être clairement illustré dans le contexte contrasté.
- La salle utilisée pour l'observation et l'imagerie du comportement de Hydra gratuit de feux dont l'intensité, la fluctuation des courants d'air et le bruit. De telles perturbations peuvent également causer le polype hydre à afficher contraction des tentacules - même en l'absence de glutathion.
- Laisser le polype pour se détendre pendant 5 min.
- Assurez-vous que le polype est situé le long de la région centrale du bien telle que le comportement peut être imagée clairement. Si le polype est au bord du puits, apporter au centre par le moyen de rinçage à l'aide d'une pipette de nouveau et lui permettre de se relaxer.
- Capturer une image de l'hydre à l'état détendu. Ce sera l'observation du point zéro-temps.
- Ajouter rapidement 9 uM solution de glutathion pour atteindre une concentration finale de 3 uM dans le puits. Selon le but de l'expérience et de la réponse montre hydre, tester une gamme de différentes concentrations de glutathion et chooSE concentration appropriée requise.
- Lancer le chronomètre immédiatement après addition d'une solution de glutathion et de capturer des images après chaque 15-30 sec pour 4-5 min. Ne pas modifier les paramètres d'agrandissement au cours de l'imagerie time-lapse.
- Ajouter la solution de glutathion doucement et avec un débit uniforme de telle sorte que la position de l'animal dans le puits serait très peu perturbé dans le champ de vision du microscope. Toutefois, si le polype se déplace largement après addition d'une solution de glutathion, déplacer la plaque très doucement pour amener le polype dans le champ de vision pour la capture d'image.
- Dans l'expérience de contrôle, utilisez défaut moyen glutathion tout en gardant tous les autres paramètres identiques.
- Assurez-vous d'effectuer toutes les étapes expérimentales ci-dessus au cours de la première moitié de la journée - avant 13 heures pour éviter l'effet possible du rythme circadien sur la mesure de la réponse de l'alimentation.
- Ouvrez chacune des images capturées à l'aide de l'Image Manipulation Program GIMP (GNU). Utilisez la fonction "Mesure" disponible à partir de Menu> Outils> Mesurer pour déterminer la distance entre l'extrémité apicale de chacun des tentacules et hypostome. Si l'ouverture de la bouche est observée dans aucune des images, déterminer la distance entre le centre de la bouche ouverte et l'extrémité apicale du tentacule. Reportez-vous à cette distance que la propagation de tentacule.
- Calculer la propagation de tentacule moyenne pour chaque polype avant et après exposition de glutathion. Calculer le rapport de la propagation de tentacule moyenne au point zéro de temps pour que à chacun des points de temps ultérieurs. Ce rapport sera appelé rapport tentacule propagation.
- Répétez mesures pour au moins 20 polypes.
2. Validation de la méthode utilisant leLa famine modèle
- Pour la famine, transférer quelques polypes hydra dans un bol en verre séparée et ne les nourrissez pas pendant 5 jours. Nourrir le groupe de quelques polypes de contrôle quotidien avec artémias dans un bol de taille similaire. Changer le support à la fois expérimentale bols par jour pour éviter le développement de champignons dans le milieu.
- Le jour de l'expérience, nourrir le groupe de l'hydre de commande avec artémias pendant 1 heure et utiliser ces hydre pour les expériences ultérieures après avoir retiré artémias non consommés et mort du milieu.
- Mesurer la réponse d'alimentation de l'hydre de faim par rapport à l'hydre de groupe de contrôle par la méthode décrite précédemment à l'étape 1. Pour éviter tout biais dû au temps de l'observation, alterner les mesures de chacun des affamés et contrôler polypes Hydra.
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Representative Results
Le glutathion provoque hydre exposer curling des tentacules vers la bouche dans le but d'engloutir la proie. Cette curling de tentacules apporte extrémités apicales des tentacules plus près de la hypostome. Cela se traduit par la réduction de la propagation du tentacule, ou la distance linéaire entre l'extrémité apicale du tentacule et hypostome (figure 1). La propagation de tentacule relative, ou le rapport de tentacule moyenne réparties avant et après l'ajout de glutathion, en moyenne sur plusieurs polypes réduit au fil du temps. Le tentacule écart relatif après l'addition du milieu dépourvu de glutathion réduit toutefois uniquement de façon transitoire et atteint la valeur unitaire en une minute (Figure 2). La faim est connu pour provoquer la mise en valeur de la conduite d'amenée induite par le glutathion 1,13. La méthode de mesure de la conduite d'alimentation décrite ici a été validée par le modèle de famine. Le tentacule répandre une minute après l'ajout de glutathion était significantly inférieur pour le groupe de faim par rapport au groupe rassasié (p = 1 x 10 -16 en appliquant deux test t bilatéral avec la même variance) (Figure 3).
Figure 1: Méthode de mesure de la propagation de tentacule moyenne. Une image d'un polype hydre détendue a été enregistré avant d'ajouter GSH et la distance linéaire entre la bouche et extrémité apicale de chacun des tentacules du polype a été mesurée en termes de nombre de pixels à l'aide de l'outil de GIMP. Une autre photo a été prise après l'ajout de GSH et la propagation de tentacule a été mesurée de manière similaire.
Figure 2: La quantification de la réponse de l'alimentation induit GSH-à Hydra. TentacLe réparties à différents points de temps après l'ajout de GSH a été mesurée comme décrit dans la figure 1 et par rapport tentacule propagation a été notée comme un rapport de tentacule se propager avant et après l'ajout de GSH (n = 14). Les valeurs pour le groupe de contrôle représentent la tentacule écart relatif après addition de milieu hydre sans GSH (n = 14). Erreurs barres représentent ± SEM.
Figure 3: Validation de la méthode de quantification de la réaction de l'alimentation en utilisant le modèle de famine. L'axe des X représente le temps après l'addition de 3 uM de GSH affamés (n = 61) et rassasié (n = 66) des groupes.
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Discussion
Comportement alimentaire dans hydre représente l'un des systèmes les plus chimiosensoriels ancestrales dans les métazoaires. Bien que la présence de GSH dans le liquide crustacé libéré après la capture des proies assisté nématocyste-été détecté depuis longtemps 1, ni la protéine GSHR ni le gène codant putatif / s ont été caractérisés à ce jour de Hydra. Quelques tentatives ont été effectuées pour caractériser GSH protéines de liaison à hydre 8, 14, 15. Cependant, l'identité de ces protéines de récepteurs putatifs reste d'autres composants moléculaires obscurs et très peu, qui sont susceptibles de contribuer à la réaction de l'alimentation, ont été rapportés à Date 16, 17. La seule GSHR caractérisé dans le règne animal est de 18 poissons rouges. Les techniques classiques, telles que l'utilisation des inhibiteurs de diverses protéines de la cascade de signalisation des RCPG ainsi que les techniques de biologie moléculaire de pointe (ARNi de l'inactivation de gène à médiation et CRISPR-Cas9 édition du génome médiation), peut fournir powoutils erful pour l'identification des composants moléculaires de la GSH cascade de signalisation à Hydra. La lecture d'un tel scorable expression altérée et de la fonction du récepteur et les autres composants de la signalisation GSH serait modifié le comportement alimentaire. Il était donc essentiel de mettre au point une méthode pour mesurer la réponse d'alimentation en hydre induite par GSH.
Phénotypique, la réponse alimentaire curling comporte des tentacules vers l'embouchure et l'ouverture subséquente de la bouche. En utilisant l'ancienne observation, nous avons développé une méthode simple et robuste de quantifier le comportement alimentaire qui consiste à mesurer la distance entre les extrémités apicale de la tentacule et la bouche. Il est essentiel de (1) utiliser la solution GSH fraîchement préparée, (2) utiliser la concentration appropriée de GSH, et (3) réaliser l'expérience en laboratoire ayant des intensités de lumière uniforme et pas forts courants d'air pour obtenir la mesure reproductible de la GSH-associéD comportement alimentaire. Le comportement alimentaire de réponse comme pourrait également être physiquement induite en ajoutant simplement un milieu dépourvu de GSH. Cependant, un tel comportement est transitoire et ne se remarque pas après 15-30 sec. Par conséquent, il était nécessaire d'inclure ce témoin dans l'expérience et à mesurer la réponse de l'alimentation uniquement après comme la réponse provoquée par la perturbation mécanique est complètement cessé. Pour réduire au minimum la variation de la contraction induite par une perturbation tentaculaire-mécanique due à débit variable avec une solution de glutathion qui est ajouté, il serait également possible de remplacer la distribution manuelle de la solution d'essai avec un dispositif mécanique 19 tel que décrit précédemment. Distribution mécanisée de solution de glutathion permettrait un contrôle plus strict de l'ampleur et de l'orientation de stimulus mécanique de telle sorte qu'il pourrait être uniforme pour tous les événements de distribution et donc normalisée de façon interne.
Dans cette méthode, la propagation de tentacule est mesurée à travers deux dimensions; alors qu'en réalité, quelques-uns des tentacules sont également répartis le long de la troisième axe pointant vers l'observateur. De même, l'orientation des tentacules peut changer après l'ajout de glutathion. Cependant, la moyenne de la tentacule répartis sur plusieurs tentacules d'un polype, ainsi que sur plusieurs polypes normalise le biais introduit par des mesures en deux dimensions ainsi que l'orientation modifiée des tentacules. Nous suggérons que les polypes qui se déplacent à l'extrême périphérie du puits, où l'observation claire des tentacules est pas toujours possible, être exclus de l'analyse. En outre, en prenant l'écart de tentacule relative qui est le rapport du tentacule propagation avant et après l'ajout de glutathion, et non la valeur absolue de l'écart de tentacule après traitement GSH, en tant que mesure de réponse d'alimentation peut entraîner une réduction de la variation induite par la variabilité à la longueur de tentacule des polypes individuels. Ce protocole de mesure de la feedi induite glutathionréponse ng pourrait être également utile pour toutes les espèces d'hydres. Pour mesurer tentacule propagation dans les images obtenues à partir de grandes populations d'hydre, il serait également possible d'écrire un algorithme informatique semblable à celles disponibles pour l'analyse du comportement des animaux 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
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