测量水润谷胱甘肽诱导饲养响应

Protocol

在饲养响应1.水润文化与测量

1. 通过每天用卤虫喂养它们并保持它们在培养基（1毫摩尔Tris-HCl缓冲液，pH值7.6，1 mM氯化钠，1mM的_氯化钙 ，0.1mM的氯化钾，和0.1mM _硫酸镁 ）包含在保持在培养水螅息肉玻璃碗，在18℃下进行12小时光照，12小时黑暗周期如前所述^12。
2. 用于测量馈响应，传送一个成熟的具有5-6个触须到24孔板的单个孔水螅息肉。通过倾斜地取出从井的残余介质中，然后立即加入500μl的新鲜培养基。
3. 准备在九头蛇媒体9微米的谷胱甘肽的解决方案。由于谷胱甘肽溶液是容易氧化，通常使用为每个实验新鲜制备的谷胱甘肽溶液。
4. 板转移到具有用于图像记录规定一个显微镜的成像平台。使用深色背景，这样的行为Ò˚F水螅水螅可以清晰成像对对比背景。
5. 房间用于观察和成像水螅自由的行为与波动强度，气流和噪音的灯。这些干扰也可导致水螅息肉显示触手收缩 - 甚至在没有谷胱甘肽。
6. 让息肉5分钟放松。
7. 确保息肉位于沿井，使得行为可以清楚地拍摄的中心区域。如果息肉是在井的边缘，使之在中心通过使用移液管冲洗介质，并再次使其放松。
8. 捕捉在松弛状态下九头蛇的图像。这将是零时间点的观察。
9. 快速添加9微米谷胱甘肽溶液以达到在该井的3μM的终浓度。根据实验和响应由水螅示的目的，测试一系列不同浓度的谷胱甘肽和噗的瑟所需的适当的浓度。
10. 添加谷胱甘肽的解决方案，采集图像每隔15-30秒4-5分钟后后，立即启动定时器。时间推移成像过程中不要改变倍率设置。
11. 添加谷胱甘肽的溶液轻轻地和均匀的流动，使得在井的动物的位置将被最低限度地干扰在视显微镜的领域。然而，如果息肉添加谷胱甘肽溶液后广泛移动时，移动板轻轻地使息肉中的视图用于图像捕获的字段。
12. 在对照实验中，使用的介质缺乏谷胱甘肽，同时保持所有其他参数相同。
13. 要确保在第一天的一半执行所有上述实验步骤： - ：00之前，以避免昼夜节律对馈送响应的程度的可能影响。
14. 打开每个使用GNU图像处理程序（GIMP）拍摄的图像中。 使用“测量”工具，可从菜单>工具>测量来确定每个触角和hypostome的顶端末端之间的距离。如果嘴开口中的任何图像的观察，确定了开口的中心与所述触手的尖端之间的距离。请参考这个距离作为触手蔓延。
15. 之前，谷胱甘肽曝光后计算平均价差触须每个息肉。计算的平均触手蔓延在零时间点，以该比率在每个随后的时间点。这个比例将被称为相对触手蔓延。
16. 重复测量，至少20息肉。

2.方法验证使用饥饿型号

1. 对于饥饿，转移几水螅珊瑚虫为一个单独的玻璃碗里，不要喂它们5天。每日与卤虫饲料的几个息肉，对照组以同样大小的碗。改变介质从每日两实验的碗，以避免在培养基中的真菌生长。
2. 在实验当天，喂水螅的对照组与卤虫1小时，并从培养基中除去所有未吃掉的和死的卤虫后使用这些水螅用于后续实验。
3. 衡量饥饿水润与对照组按上面的步骤1.描述，以避免任何偏见的方法九头蛇比较饲养的反应，由于观测时间，每次交替的饥饿的测量和控制水螅珊瑚虫。

Representative Results

谷胱甘肽导致水螅表现出对嘴吞噬猎物的目的触手卷曲。触手卷曲等带来的触角更接近hypostome根尖末端。这将导致减少的触手蔓延，或的触手与hypostome（ 图1）顶端末端之间的直线距离。相对触手蔓延，或平均触手之比之前流传，并添加谷胱甘肽后，均在多个息肉减少随着时间的推移。相对触手蔓延除了缺乏谷胱甘肽培养基之后，但是，只减少瞬时和达到单元值在大约一分钟内（ 图2）。饥饿是已知会导致增强诱导谷胱甘肽^1,13取食行为的。测定此处描述的摄食行为的方法通过将饥饿模型进行了验证。触手分布在一分钟后加入谷胱甘肽是significantlÝ下为饥饿组相比，饱满组（p = 1×10 ^-16通过施加2尾t检验，以相等的方差）（ 图3）。

图1：测量平均值触手蔓延的方法。记录一个宽松水螅息肉的图像添加谷胱甘肽和嘴和每个息肉的触手的顶端末端之间的直线距离测定中使用的GIMP工具的像素数目计算之前。另一个图像添加GSH后获取，传播触手进行测量以类似的方式。

图2：在九头蛇的GSH-引起的摄食反应的定量。 Tentac文件添加如在图1中描述的和相对的触手蔓延记作触手的比之前传播并加入谷胱甘肽（14）后的GSH后测量扩散在不同的时间点。对于对照组的值表示加成水螅介质的未经谷胱甘肽（14）之后的相对触手蔓延。误差条代表±SEM。

图3：使用饥饿模型馈送响应的定量的方法的有效性。 X轴表示加入3μM的谷胱甘肽与饥饿（61例）和饱满（正= 66）组后的时间。

Discussion

在水螅摄食行为代表了最原始的化学感受系统的后生动物之一。虽然谷胱甘肽（GSH）后刺丝囊辅助捕获猎物释放的甲壳类流体存在检测前不久^1，无论是GSHR蛋白质也不是假定的编码基因/ S进行了表征，从九头蛇是最新的。一些尝试已经进行了表征谷胱甘肽结合蛋白在水螅^{8，14，15，}但是，这些推测的受体蛋白质的身份仍不清楚并且很少有其他分子组分，它有可能向馈送反应中，已经报道了¹⁶日^，17，唯一的特征GSHR在动物王国中是金鱼^18。经典的技术，如使用G蛋白偶联受体的信号级联的各种蛋白的抑制剂，以及先进的分子生物学技术（RNA干扰介导的基因沉默和CRISPR-Cas9介导的基因组编辑），可提供战俘强大的工具，用于识别GSH的分子成分的水润信号级联。该受体的这种改变的表达和功能，谷胱甘肽信令的其它组分的刻痕的读出将被改变摄食行为。因此，有必要设计一种方法，用于测量引起的GSH在水螅饲养响应。

表型上，馈送反应涉及朝向嘴和嘴的后续开口的触角卷曲。利用前者的观察，我们开发了定量涉及测量触手和嘴的顶端部之间的距离的馈送行为的简单且可靠的方法。至关重要的是（1）使用新鲜制备的GSH溶液，（2）使用谷胱甘肽的适当浓度，和（3）进行实验在实验室中具有均匀的光强度和没有强烈的气流，得到的可再现的测量GSH-准ð摄食行为。饲养反应般的行为也可以通过简单地增加媒体缺乏GSH在物理诱发。但是，这样的现象是短暂的，并经过15-30秒并不明显。因此，有必要对包括该控制在实验和测量馈送响应后才这样所造成的机械干扰的响应被完全停止。以最小化所引起的与谷胱甘肽溶液中加入可变流量的机械扰动引起的触手收缩的变化，这也将是可行的如前面¹⁹所描述来代替供试品溶液的手撒用的机械装置。的谷胱甘肽溶液机械化分配将使更严格地控​​制机械刺激的幅度和方向，使得它可以在所有的分配事件均匀，因此，内部标准化。

在该方法中，触手蔓延跨两个二测mensions;而在现实中，很少有触角也沿着第三个轴指向观察者传播。同样，触角的方向可以增加谷胱甘肽后更改。然而，平均触手分布在单个息肉的多个触须以及跨多个息肉归由二维测量以及触角的变化的方向引入的偏差。我们认为，这移至井，其中明确观察的触​​角并不总是可行的极端边缘的息肉，被排除在分析之外。此外，考虑相对触手蔓延，这是触手的比值之前，加入GSH的后扩散，并且不GSH处理后的触手蔓延的绝对值，作为馈送响应的测量值，可能会导致在最小化诱导的变异性的变化的在个别息肉的触手长度。测定谷胱甘肽诱导feedi这个协议NG应答可能是所有物种的水润同样有用。用于测量触手蔓延，从水螅的大量人口所获得的图像，它也有可能写出类似的可用于动物行为²⁰分析的计算机算法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cooled Incubator	Panasonic	MIR-254-PE
Microscope	Leica	S8AP0
Camera for the microscope	Leica	EC3
Reduced glutathione	Sigma	G4251	Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program	GIMP	Version 2.8