Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra

Published: November 16, 2014 doi: 10.3791/52178

Protocol

1. Hydra Kultur og måling af Feeding Respons

  1. Opretholde hydraceller polypper i kultur ved dagligt at fodre dem med Artemia og holde dem i et medium (1 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,1 mM KCI og 0,1 mM MgSO4) indeholdt i en glasskål ved 18 ° C under 12 timers lys-12 timers mørke cykler som beskrevet tidligere 12.
  2. Til måling fodring respons overføre en modne hydra polyp med 5 til 6 fangarme til en enkelt brønd i en plade med 24 brønde. Fjerne tilbageværende medium fra brønden ved at vippe den, og derefter straks tilsættes 500 pi frisk medium.
  3. Forbered 9 uM glutathion opløsning i hydra medium. Da glutathion løsning er tilbøjelig til oxidation, altid bruge frisklavet glutathion løsning for hvert forsøg.
  4. Overfør pladen til imaging platform af et mikroskop, der har bestemmelser for billedoptagelse. Brug en mørk baggrund, således at adfærden of hydra polyp kan tydeligt afbildes mod kontrasterende baggrund.
  5. Rummet anvendes til observation og billeddannelse adfærd hydra fri fra lys af svingende intensitet, luftstrømme og støj. Sådanne forstyrrelser kan også forårsage hydra polyp at vise sammentrækning af fangarme - selv i fravær af glutathion.
  6. Lad polyp at slappe af 5 min.
  7. Sørg for at polyp er placeret langs den centrale region af brønden, således at adfærden kan afbildes tydeligt. Hvis polyp er på kanten af ​​brønden, bringe det til midten ved at skylle mediet ved anvendelse af en pipette og igen gøre det muligt at slappe af.
  8. Tage et billede af hydra i afslappet tilstand. Dette vil være nul-tidspunkt observation.
  9. Hurtigt tilføje 9 uM glutathion løsning til at nå frem til en endelig koncentration på 3 uM i brønden. Afhængigt af formålet med forsøget og reaktionen vist ved hydra, teste en række forskellige koncentrationer af glutathion og ChooSE passende koncentration påkrævet.
  10. Start timeren umiddelbart efter tilsætning af glutathion løsning og tage billeder efter hver 15-30 sekunder ved 4-5 min. Du må ikke ændre forstørrelsen indstillinger under time-lapse billeddannelse.
  11. Tilføj glutathion opløsning forsigtigt og med ensartet strøm, således at positionen af ​​dyret i brønden ville være minimalt forstyrrede i synsfeltet for mikroskopet. Men hvis polyp bevæger udstrakt efter tilsætning glutathion løsning, flyt pladen meget forsigtigt for at bringe polyp i synsfeltet for billedoptagelse.
  12. I kontroleksperimentet bruge medium, der mangler glutathion, samtidig med at alle de andre parametre er identiske.
  13. Sørg for at udføre alle de ovennævnte eksperimentelle skridt i løbet af første halvdel af dagen - før 1:00 for at undgå den mulige virkning af døgnrytme om omfanget af fodring respons.
  14. Åbn hvert af de optagne billeder ved hjælp af GNU Image Manipulation Program (GIMP). Brug "Measure" værktøj til rådighed fra Menu> Værktøjer> måles for at bestemme afstanden mellem apikale ende af hver af fangarme og hypostome. Hvis der observeres munden åbning i nogen af ​​billederne, bestemme afstanden mellem midten af ​​den åbne mund og den apikale ende af tentakel. Der henvises til denne afstand som fangarm spredning.
  15. Beregn den gennemsnitlige fangarm spread for hver polyp før og efter glutathion eksponering. Beregn forholdet mellem gennemsnittet fangarm spread på nul-tidspunkt til, at der på hver af de efterfølgende tidspunkter. Dette forhold vil blive kaldt relative fangarm spredning.
  16. Gentag målinger i mindst 20 polypper.

Ligning 1
Ligning 2

2. Metode Validation hjælp afSult Model

  1. For sult, overføre et par hydraceller polypper til en separat glasskål og ikke fodre dem i 5 dage. Feed kontrolgruppen af ​​nogle få polypper dagligt med Artemia i en lignende størrelse skål. Skift mediet fra både eksperimentelle skåle dagligt for at undgå svampevækst i mediet.
  2. På dagen for eksperimentet, fodre kontrolgruppen af ​​hydra med Artemia i 1 time og bruge disse hydra til de efterfølgende forsøg efter fjernelse af alle levnet og døde Artemia fra mediet.
  3. Mål fodring respons sultet hydra i sammenligning med hydra fra kontrolgruppen ved tidligere i trin 1. beskrevet at undgå enhver skævhed metode grundet tid af observation, suppleant målingerne af hver af de sultede og kontrollere hydraceller polypper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Glutathion forårsager hydra at udvise krølning af fangarme mod mundingen med henblik på at opsluge bytte. Sådan krølning af fangarme bringer apikale ender af fangarme tættere på hypostome. Dette resulterer i en reduktion i tentakelkrone spredning, eller den lineære afstand mellem apikale ende af tentakel og hypostome (figur 1). Den relative fangarm spredes, eller forholdet mellem gennemsnittet fangarm spredt før og efter tilsætning af glutathion gennemsnit på tværs af flere polypper reducerer over tid. Den relative tentakel spredning efter tilsætning af medium uden glutathion reducerer imidlertid kun forbigående og opnår enhed værdi på omkring et minut (figur 2). Sult er kendt for at forårsage forøgelse af ædeadfærden induceret af glutathion 1,13. Metoden til måling af adfærd fodring her beskrevet blev valideret af sult model. Fangarm bredte et minut efter tilsætning af glutathion var significantly lavere for sultet gruppe sammenlignet med mæt gruppe (p = 1 x 10 -16 ved anvendelse tohalet t-test med lige varians) (figur 3).

Figur 1
Figur 1: Metode til måling af gennemsnitlig fangarm spredning. Et billede af en afslappet hydra polyp blev registreret før tilsætning GSH og den lineære afstand mellem mund og apikale ende af hver af fangarm af polyp blev målt på antallet af pixels ved hjælp af GIMP værktøjet. Et andet billede blev taget efter tilsætning af GSH og tentakel spredning blev målt på lignende måde.

Figur 2
Figur 2: Kvantificering af GSH-induceret fodring respons i hydra. Tentacle spredt på forskellige tidspunkter efter tilsætning af GSH blev målt som beskrevet i figur 1 og relative tentakel spredning blev betegnet som et forhold af tentakel spredes før og efter tilsætning af GSH (n = 14). Værdierne for kontrolgruppen repræsenterer den relative tentakel spredning efter tilsætning af hydra medium uden GSH (n = 14). Fejl søjler repræsenterer ± SEM.

Figur 3
Figur 3: Validering af metoden til kvantificering af fodring respons ved hjælp af sult model. X-aksen repræsenterer tiden efter tilsætning af 3 uM GSH for Starved (n = 61) og mætte (n = 66) grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spiseadfærd i hydra repræsenterer en af ​​de mest ancestral chemosensory systemer i metazoans. Selv om tilstedeværelsen af GSH i krebsdyr væske frigivet efter nematocyst-assisteret byttefangst blev opdaget for længe siden 1 har hverken GSHR protein eller de formodede kodende gen / s blevet karakteriseret fra hydra til dato. Der er gjort få forsøg på at karakterisere GSH bindende proteiner i hydra 8, 14, 15., Identiteten af disse formodede receptor proteiner er imidlertid fortsat uklar og meget få andre molekylære komponenter, som vil kunne bidrage til fodring reaktion, er blevet rapporteret at dato 16, 17. Den eneste karakteriserede GSHR i dyreriget er fra guldfisk 18. Klassiske teknikker, såsom anvendelse af inhibitorer af forskellige proteiner i GPCR signaleringskaskade samt de avancerede molekylærbiologiske teknikker (RNAi-medieret gendæmpning og CRISPR-Cas9 medieret genom redigering), kan give powerful værktøjer til identifikation af de molekylære komponenter i GSH signalering kaskade i hydra. Den scorable udlæsning af en sådan ændret ekspression og funktion af receptoren og de andre bestanddele af GSH signalering ville blive ændret spiseadfærd. Det var derfor vigtigt at udvikle en metode til måling af fodring respons i hydra induceret af GSH.

Fænotypisk fodring reaktion involverer krølning af fangarme over munden og efterfølgende åbning af munden. Udnytte den tidligere observation vi udviklet en enkel og robust metode til kvantificering ædeadfærden som involverer måling af afstanden mellem de apikale ender af tentakel og mund. Det er vigtigt at (1) anvende frisk fremstillet GSH opløsning, (2) anvende den passende koncentration af GSH, og (3) at udføre forsøget i laboratoriet har ensartede lysintensiteter og ingen stærke luftstrømme for at opnå reproducerbar måling af GSH-associeretd spiseadfærd. Fodring respons-lignende adfærd kan også være fysisk fremkaldt ved simpelthen at tilsætte medium uden GSH. Men en sådan adfærd er forbigående og ikke mærkbar efter 15-30 sek. Derfor var det nødvendigt at medtage denne kontrol i eksperimentet og måle fodring respons efter sådan respons forårsaget af den mekaniske forstyrrelse er helt ophørt. For at minimere variationen i den mekaniske forstyrrelser induceret tentacular kontraktion forårsaget af variabel strømningshastighed som tilsættes glutathion opløsning, ville det også være muligt at erstatte manuel dispensering af testopløsningen med en mekanisk anordning som beskrevet tidligere 19. Mekaniserede dispensering af glutathion løsning ville muliggøre en strammere kontrol af størrelsen og orienteringen af ​​mekanisk stimulus sådan, at det kunne være ensartet på tværs af alle dispenseringsbegivenheder og derfor normaliseret internt.

I denne metode, er den fangarm spredt målt over to dimensioner; mens den i virkeligheden er nogle af de tentakler også spredes langs den tredje akse peger mod iagttageren. Tilsvarende kan orienteringen af ​​fangarme ændre sig efter tilsætning af glutathion. Men gennemsnit fangarm spredt over flere fangarme en enkelt polyp samt på tværs af flere polypper normaliserer forspændingen indført ved todimensionelle målinger samt den ændrede orientering af fangarme. Vi foreslår, at de polypper, der bevæger sig til det yderste periferi godt, hvor klar observation af tentakler er ikke altid muligt, være udelukket fra analysen. Endvidere kunne tage den relative tentakel spredning, som er forholdet mellem tentakel spredes før og efter tilsætning af GSH, og ikke den absolutte værdi af fangarm spredning efter GSH behandling, som et mål for fodring reaktion resultere i minimering af variationen induceret af variabilitet i tentakel længden af ​​de enkelte polypper. Denne protokol til måling af glutathion-induceret feeding reaktion kunne være lige så anvendelig for alle hydra arter. Til måling fangarm spredes i billederne opnået fra store bestande af hydra, ville det også være muligt at skrive en computer algoritme svarende til dem, til rådighed for analyse af dyrs adfærd 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cooled Incubator Panasonic  MIR-254-PE
Microscope Leica S8AP0 
Camera for the microscope Leica  EC3
Reduced glutathione Sigma G4251 Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program GIMP Version 2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
  2. Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
  3. Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
  4. Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
  5. Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
  6. Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
  7. Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
  8. Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
  9. Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
  10. Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
  11. Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
  12. Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
  13. Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
  14. Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
  15. Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
  16. Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
  17. Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
  18. Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
  19. Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
  20. Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).

Tags

Grundlæggende protokoller Hydra chemosensation fodring respons fodring status glutathion bytte sult
Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, R., Galande, S. MeasuringMore

Kulkarni, R., Galande, S. Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra. J. Vis. Exp. (93), e52178, doi:10.3791/52178 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter