Protocol
1. Hydra Cultuur en waardering van de Feeding Response
- Handhaaf hydra poliepen in kweek door ze dagelijks met artemia en bewaar ze in een medium (1 mM Tris-HCl buffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,1 mM KCl en 0,1 mM MgSO4) in een glazen schaal bij 18 ° C onder 12 uur licht 12 uur donker cycli zoals eerder 12 beschreven.
- Voor het meten van de voedingsreactie transfer een volwassen hydra poliep met 5-6 tentakels een enkel putje van een 24-wells plaat. Verwijder de resten van het medium uit de put door het kantelen van het, en dan meteen voeg 500 ul van vers medium.
- Bereid 9 uM glutathion oplossing in hydra medium. Aangezien de glutathion oplossing is gevoelig voor oxidatie, gebruik altijd vers bereide glutathion oplossing voor elk experiment.
- Breng de plaat aan de imaging platform van een microscoop met voorzieningen voor het opnemen van beelden. Gebruik een donkere achtergrond zodanig dat het gedrag of hydra poliep kan duidelijk worden afgebeeld tegen de contrasterende achtergrond.
- De ruimte wordt gebruikt voor het observeren en beeldvorming van het gedrag van de hydra vrij van lichten van wisselende intensiteit, luchtstromen en lawaai. Dergelijke verstoringen kunnen ook leiden tot de hydra poliep contractie van de tentakels tonen - zelfs bij afwezigheid van glutathion.
- Laat de poliep te ontspannen voor 5 min.
- Zorg ervoor dat de poliep is gelegen langs het centrale gebied van de bron, zodat de werking duidelijk kan worden afgebeeld. Als de poliep is aan de rand van de put, brengen naar het centrum van spoelen het medium met een pipet en opnieuw laat het ontspannen.
- Maak een foto van Hydra in de ontspannen toestand. Dit zal de zero-tijdstip observatie zijn.
- Voeg snel 9 uM glutathion oplossing tot een eindconcentratie van 3 uM bereiken in de put. Afhankelijk van het doel van het experiment en de respons getoond door hydra, test een reeks van verschillende concentraties van glutathion en choose de juiste concentratie vereist.
- Start de timer onmiddellijk na het toevoegen van glutathion oplossing en foto's maken na elke 15-30 sec voor 4-5 min. Laat de vergroting instellingen niet aanpassen tijdens de time-lapse imaging veranderen.
- Voeg de glutathion oplossing voorzichtig en uniforme stroming zodat de positie van het dier in de put minimaal zou worden verstoord in het gezichtsveld van de microscoop. Echter, als de poliep beweegt uitgebreid na het toevoegen van glutathion oplossing om de plaat heel voorzichtig om de poliep in het gezichtsveld voor het vastleggen van beelden te brengen.
- In het controle-experiment gebruikt medium zonder glutathion terwijl alle andere parameters gelijk.
- Zorg ervoor dat al het bovenstaande experimentele stappen uit te voeren tijdens de eerste helft van de dag - voor 13:00 naar de mogelijke invloed van de circadiane ritme van de mate van het voeden reactie te voorkomen.
- Open elk van de gemaakte foto's met behulp van de GNU Image Manipulation Program (GIMP). Gebruik de "Measure" tool die beschikbaar zijn vanaf Menu> Extra> Meet de afstand tussen de apicale einde van elk van de tentakels en hypostoom bepalen. Indien de mondopening waargenomen in elk van de beelden, bepalen de afstand tussen het middelpunt van de geopende mond en het apicale uiteinde van de tentakel. Raadpleeg deze afstand als de tentakel spread.
- Bereken de gemiddelde tentakel verspreid voor elke poliep vóór en na blootstelling glutathion. Bereken de verhouding van gemiddelde tentakel spread op nul tijdstip dat bij elk van de volgende tijdstippen. Deze verhouding zal worden genoemd relatieve tentakel spread.
- Herhaal metingen minimaal 20 poliepen.
2. Methode Validatie met behulp van deVerhongering Model
- Voor honger, overdragen enkele hydra poliepen om een aparte glazen kom en laat ze niet te voeden gedurende 5 dagen. Voer de controle groep van een paar poliepen dagelijks met artemia in een vergelijkbare omvang kom. Verander het medium van zowel experimentele kommen dagelijks om schimmelgroei in het medium te voorkomen.
- Op de dag van het experiment, voeden de controlegroep van hydra met Artemia 1 uur en deze gebruiken hydra de volgende experimenten na verwijderen van alle niet opgegeten en dode Artemia van het medium.
- Meet de voedingsreactie van de uitgehongerde hydra ten opzichte van de hydra van controlegroep door de eerder in stap 1 beschreven Om vertekening te voorkomen toegepast gezien waarnemingstijd, wisselen de metingen van elk van de uitgehongerd en controle hydra poliepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glutathion veroorzaakt hydra tot krullen van de tentakels vertonen op de bek ten behoeve van overspoelt de prooi. Dergelijke curling tentakels brengt apicale uiteinden van de tentakels dichter bij de hypostoom. Dit resulteert in afname van de tentakel spread of de lineaire afstand tussen apicale uiteinde van de tentakel en hypostoom (figuur 1). De relatieve tentakel spread of de verhouding van gemiddelde tentakel voor verspreiden en na het toevoegen van glutathion, gemiddeld over meerdere poliepen vermindert de tijd. De relatieve tentakel verspreiding na toevoeging van het medium zonder glutathion, maar vermindert slechts tijdelijk en bereikt eenheidswaarde in ongeveer een minuut (Figuur 2). Verhongering is bekend dat verhoging van het eetgedrag, geïnduceerd door glutathion 1,13 veroorzaken. De methode voor het meten van het eetgedrag hier beschreven werd gevalideerd door de hongerdood model. De tentakel verspreidde een minuut na het toevoegen van glutathion was significantly lager voor de uitgehongerde groep vergeleken met de verzadigd groep (p = 1 x 10 -16 door toepassing tweezijdige t-toets met gelijke variantie) (figuur 3).
Figuur 1: Methode voor het meten van de gemiddelde tentakel spread. Een beeld van een ontspannen hydra poliep werd opgenomen voor het toevoegen van GSH en de lineaire afstand tussen mond en apicale einde van elk van de tentakel van de poliep werd gemeten in termen van het aantal pixels met behulp van het GIMP tool. Een ander beeld werd gevangen na het toevoegen van GSH en de tentakel smeersel werd gemeten op soortgelijke wijze.
Figuur 2: Kwantificering van de GSH-geïnduceerde voedingsoplossing in hydra. Tentacle gespreid op verschillende tijdstippen na toevoeging van GSH werd gemeten zoals beschreven in figuur 1 en relatieve tentakel smeersel werd aangeduid als een verhouding tentakel voor verspreiden en na toevoeging van GSH (n = 14). De waarden voor de controlegroep stellen de relatieve tentakel verspreiding na toevoeging van hydra medium zonder GSH (n = 14). Fouten balken geven ± SEM.
Figuur 3: Validatie van de methode van kwantificering van de voeding respons gebruikmaken van uithongering model. X-as is de tijd na toevoeging van 3 uM GSH voor uitgehongerde (n = 61) en verzadigd (n = 66) groepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voedingsgedrag in hydra is een van de meest voorouderlijke chemosensory systemen in de Metazoa. Hoewel de aanwezigheid van GSH in de schaaldieren vloeistof vrijgelaten na-nematocyst bijgestaan hun prooi vangen werd lang geleden ontdekt 1, hebben noch de GSHR eiwit, noch de vermeende coderende gen / s gekarakteriseerd van hydra-to-date. Weinig pogingen gedaan om karakteriseren GSH bindingseiwitten hydra 8, 14, 15. De identiteit van deze vermeende receptor eiwitten blijft onduidelijk en weinig andere moleculaire componenten die kunnen bijdragen tot het voederen reactie zijn, is gemeld date 16, 17. Het enige kenmerk GSHR in het dierenrijk is van goudvis 18. Klassieke technieken, zoals het gebruik van remmers van diverse eiwitten van de GPCR signaalcascade en de geavanceerde moleculair biologische technieken (RNAi-gemedieerde silencing en CRISPR-Cas9 gemedieerde genoom bewerking), kunnen Pow biedenvloedrijke hulpmiddelen voor de identificatie van de moleculaire componenten van de GSH signalering cascade in hydra. De meetbare uitlezing van dergelijke veranderde expressie en functie van de receptor en de andere componenten van de GSH signalering zou eetgedrag worden gewijzigd. Het was dan ook van essentieel belang om een methode te ontwikkelen voor het meten van de voeding respons in hydra veroorzaakt door GSH.
Fenotypisch, de voedingsreactie gaat krullen van de tentakels op de bek en de daaropvolgende mondopening. Gebruik makend van de voormalige waarneming wij ontwikkelden een eenvoudige en robuuste methode van kwantificeren voedingsgedrag die omvat het meten van de afstand tussen het apicale uiteinde van de tentakel en mond. Het is essentieel om (1) gebruikt de vers bereide GSH oplossing (2) gebruik de juiste concentratie van GSH en (3) voert het experiment in het laboratorium met uniforme lichtintensiteit en geen sterke luchtstromingen de reproduceerbare meting van de verkregen GSH-associated voedingsgedrag. Feeding response-achtig gedrag kan ook fysiek worden opgewekt door het simpelweg toevoegen van medium zonder GSH. Echter, een dergelijk gedrag is van voorbijgaande aard en niet merkbaar na 15-30 sec. Derhalve was het noodzakelijk om deze controle in het experiment omvat en de voedingsreactie nadat deze de respons veroorzaakt door de mechanische verstoring volledig gestaakt meten. De verandering van de mechanische storing geïnduceerde contractie door tentakels variabel debiet waarmee glutathion oplossing wordt toegevoegd minimaliseren, zou het ook mogelijk zijn om handmatige afgifte van de testoplossing te vervangen door een mechanische inrichting zoals eerder 19 beschreven. Machinaal afgifte van glutathion oplossing strengere controle van de grootte en oriëntatie van mechanische stimulus zodat het uniform over alle gebeurtenissen afgeven en daarom tevens genormaliseerd zou kunnen inschakelen.
In deze methode wordt de tentakel spreiding gemeten over twee diqua afmetingen; terwijl in werkelijkheid, op een paar van de tentakels zijn ook verspreid langs de derde as de richting van de waarnemer. Evenzo kan de oriëntatie van de tentakels na toevoeging glutathion veranderen. Echter, de gemiddelde tentakel verspreid over meerdere tentakels van een poliep en meerdere poliepen normaliseert de vertekening die door tweedimensionale metingen als de gewijzigde oriëntatie van de tentakels. We suggereren dat de poliepen die naar de uiterste rand van de put, waar duidelijk observatie van de tentakels is niet altijd mogelijk, uit de analyse uitgesloten. Bovendien blijkt de relatieve spreiding tentakel, welke de verhouding van tentakel vóór en na het toevoegen GSH verspreiden, en niet de absolute waarde van de tentakel verspreiding na GSH behandeling, als maat voedingsoplossing kan leiden tot minimalisering van de variatie geïnduceerd door variabiliteit in de tentakel lengte van de individuele poliepen. Dit protocol voor het meten van de glutathion geïnduceerde feeding reactie kan ook nuttig voor hydra soort. Voor het meten tentakel spreiding in de verkregen beelden van grote populaties van hydra, zou het ook mogelijk zijn om een computeralgoritme gelijk aan die beschikbaar zijn voor de analyse van diergedrag 20 schrijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
