Protocol
1. Hydra, Kultur und Messung der Fütterung Antwort
- Aufrechtzuerhalten Hydra Polypen in Kultur durch tägliche Fütterung mit Artemia und halten sie in einem Medium (1 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl und 0,1 mM MgSO 4) in ein enthaltenes Glasschale bei 18 ° C unter 12 Stunden Licht-12 h Dunkel-Zyklen wie zuvor 12 beschrieben.
- Zur Messung der Fütterung Antwort übertragen Älterer Hydra Polypen mit 5 bis 6 Tentakeln zu einem einzelnen Well einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie die Restmittel aus dem Brunnen durch Kippen und dann sofort hinzuzufügen 500 ml frisches Medium.
- Bereiten 9 uM Glutathion-Lösung in Hydra Medium. Da die Glutathion-Lösung ist anfällig für Oxidation, immer frisch zubereitet Glutathion-Lösung für jedes Experiment.
- Übertragen Sie die Platte an der Imaging-Plattform eines Mikroskops mit Bestimmungen für die Bildaufzeichnung. Verwenden Sie einen dunklen Hintergrund, so dass das Verhalten of Hydra Polypen deutlich gegen den kontrastierenden Hintergrund abgebildet werden.
- Der Raum für die Beobachtung und Abbildung des Verhaltens von Hydra frei von Lichtern von schwankenden Intensitäten, Luftströmungen und Lärm gewöhnt. Solche Störungen könnten auch dazu führen, die Hydra Polypen zu einer Kontraktion der Tentakeln zeigen - auch in Abwesenheit von Glutathion.
- Lassen Sie die Polypen zu 5 min zu entspannen.
- Sicherzustellen, dass der Polyp ist entlang der zentralen Region der Vertiefung, so daß das Verhalten deutlich abgebildet werden entfernt. Wenn der Polyp ist am Rand des Brunnens, bringen Sie es in die Mitte durch Spülen des Mediums mit einer Pipette und wieder erlauben zu entspannen.
- Aufnehmen eines Bildes von Hydra im entspannten Zustand. Dies wird die Null-Zeitpunkt Beobachtung stehen.
- Hinzuzufügen schnell 9 uM Glutathion-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 & mgr; M in dem Bohrloch zu erreichen. Je nach dem Zweck des Experiments und der Reaktion von Hydra gezeigt, testen eine Reihe von verschiedenen Konzentrationen von Glutathion und ChooSE Die geeignete Konzentration erforderlich.
- Starten Sie den Timer unmittelbar nach dem Hinzufügen Glutathion-Lösung und die Aufnahmen nach jedem 15 bis 30 sec für 4-5 min. Die Vergrößerungseinstellungen während der Zeitraffer-Bildgebung nicht verändern.
- Hinzufügen des Glutathion-Lösung schonend und gleichförmige Strömung, so dass die Position des Tieres in der gut wäre minimal in das Sichtfeld des Mikroskops gestört werden. Allerdings, wenn der Polyp bewegt ausgiebig nach Zugabe Glutathion-Lösung, bewegen Sie die Platte sehr vorsichtig, um die Polypen in das Blickfeld für die Bilderfassung zu bringen.
- Im Kontrollexperiment verwenden Medium ohne Glutathion und gleichzeitig alle anderen Parameter gleich.
- Achten Sie darauf, alle der oben genannten experimentellen Schritte in der ersten Hälfte des Tages durchzuführen - vor 13.00 Uhr, um die möglichen Auswirkungen der zirkadianen Rhythmus auf das Ausmaß der Fütterung Reaktion zu vermeiden.
- Öffnen Sie jedes der aufgenommenen Bilder unter Verwendung der GNU Image Manipulation Program (GIMP). Verwenden Sie die "Messen" Werkzeug von Menü> Extras> Messen Sie den Abstand zwischen apikalen Ende von jedem der Tentakeln und Hypostom bestimmen. Wenn die Mündungsöffnung in einem der Bilder beobachtet, den Abstand zwischen der Mitte des geöffneten Mund und dem apikalen Ende der Tentakel. Beziehen sich auf diese Distanz als die Tentakel Verbreitung.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Tentakel Spread für jeden Polypen vor und nach Glutathion Exposition. Berechnen des Verhältnisses der durchschnittlichen Tentakel Ausbreitung bei Null-Zeitpunkt an, dass an jedem der folgenden Zeitpunkte. Dieses Verhältnis wird relativ Tentakel Spread bezeichnet werden.
- Wiederholungsmessungen für mindestens 20 Polypen.
2. Methodenvalidierung mit Hilfe derStarvation Modell
- Für Hunger, übertragen einige Hydra Polypen zu einer separaten Glasschale und sie nicht für 5 Tage zu ernähren. Führen Sie das Kontrollgruppe von wenigen Polypen täglich mit Artemia in einem ähnlich großen Schüssel. Ändern Sie das Medium aus experimentellen Schalen täglich Pilzwachstum im Medium zu vermeiden.
- Am Tag des Experiments, füttern die Kontrollgruppe von Hydra mit Artemia für 1 Stunde und verwenden Sie diese Hydra für die nachfolgenden Experimente nach dem Entfernen aller uneaten und toten Artemia aus dem Medium.
- Messung der Vorschub Reaktion des Hydra ausgehungert im Vergleich mit der Kontrollgruppe Hydra aus der zuvor in Schritt 1 beschrieben, um jegliche Verzerrungen zu vermeiden Verfahren aufgrund Beobachtungszeit, abwechselnd die Messungen jedes der ausgehungert und steuern Hydra Polypen.
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Representative Results
Glutathion bewirkt Hydra, um ein Kräuseln der Tentakeln zur Mündung zum Zwecke der engulfing die Beute zeigen. Solche Curling von Tentakeln bringt apikalen Enden der Tentakeln näher am Hypostom. Dies resultiert in der Reduktion der Tentakel zu verbreiten, oder der lineare Abstand zwischen apikalen Ende des Tentakel und Hypostom (Abbildung 1). Die relative Tentakel Ausbreitung, oder das Verhältnis der durchschnittlichen Tentakel vor verbreitet und nach Zugabe von Glutathion, gemittelt über mehrere Polypen reduziert über die Zeit. Die relative Tentakel Ausbreitung nach Zugabe des Medium ohne Glutathion, reduziert jedoch nur vorübergehend und erreicht Einheitswert in etwa einer Minute (Abbildung 2). Starvation ist bekannt, Steigerung der Fressverhalten durch Glutathion 1,13 induzierte verursachen. Das Verfahren zum Messen der hier beschriebenen Fütterungsverhalten wurde durch Hunger-Modells validiert. Die Tentakel ausgebreitet eine Minute nach Zugabe von Glutathion war significantly niedriger für die ausgehungerten Gruppe im Vergleich zum satt-Gruppe (p = 1 x 10 -16 durch Anlegen zweier seitigen t-Tests mit gleicher Varianz) (Abbildung 3).
Abbildung 1: Verfahren zur Messung der durchschnittlichen Tentakel Verbreitung. Ein Bild von einer entspannten Hydra Polypen wurde vor der Zugabe GSH und der lineare Abstand zwischen Mund und apikalen Ende jedes der Tentakel des Polypen wurde im Hinblick auf die Anzahl der Pixel mit der GIMP Tool gemessen aufgezeichnet. Ein anderes Bild wurde nach der Zugabe von GSH erfasst und die Tentakel Ausbreitung wurde in ähnlicher Weise gemessen.
Abbildung 2: Die Quantifizierung des GSH-induzierte Fütterung Antwort in Hydra. Tentacle verteilt zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von GSH wurde wie in Figur 1 beschrieben und relative Tentakel Aufstrich wurde als Verhältnis der Tentakel bevor verteilt und nach Zugabe von GSH (n = 14) bezeichnet, gemessen. Die Werte für die Kontrollgruppe stellen die relative Tentakel Ausbreitung nach Zugabe von Hydra-Medium ohne GSH (n = 14). Fehler Balken stellen ± SEM.
Abbildung 3: Die Validierung des Verfahrens zur Quantifizierung der Fütterung Antwort Aushungern Modell. X-Achse stellt die Zeit nach der Zugabe von 3 & mgr; M GSH für ausgehungert (n = 61) und gesättigt (n = 66) Gruppen.
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Discussion
Fressverhalten in Hydra stellt eines der Vorfahren chemosensory Systeme der Metazoen. Obwohl die Anwesenheit von GSH in der nach nematocyst gestützte Beutefang freigegeben Krustentier Flüssigkeit wurde schon vor langer Zeit erkannt 1, haben weder die GSHR Proteine noch die mutmaßlichen kodierenden Gens / s von Hydra bisher geprägt. Einige Versuche wurden unternommen, um zu charakterisieren GSH-bindende Proteine in Hydra 8, 14, 15. Jedoch bleibt die Identität dieser putativen Rezeptorproteine dunkel und sehr wenige andere molekulare Komponenten, die wahrscheinlich zu der Vorschub Reaktion beitragen, haben berichtet Datum 16, 17. Die einzige dadurch GSHR im Tierreich ist aus dem Goldfisch 18. Klassische Techniken, wie die Verwendung der Inhibitoren von verschiedenen Proteinen der GPCR-Signalkaskade als auch die erweiterten molekularbiologischen Techniken (RNAi-vermittelten Gen-Silencing und CRISPR-Cas9 vermittelte Genom Bearbeitung) kann pow liefernfähigen Werkzeugen für die Identifizierung der molekularen Komponenten der GSH-Signalkaskade in Hydra. Das bewertbare Auslesen von solchen veränderten Expression und Funktion des Rezeptors und der anderen Komponenten des GSH Signalisierungs würde Fressverhalten verändert werden. Es war daher wichtig, ein Verfahren zum Messen der Vorschub Reaktion in Hydra durch GSH induzierte entwickeln.
Phänotypisch das Zuführen Reaktion beinhaltet Kräuseln der Fangarme in Richtung der Öffnung und dem anschließenden Öffnen des Mundes. Unter Verwendung der früheren Beobachtung, die wir eine einfache und robuste Methode zur Quantifizierung der Fressverhalten, die Messung des Abstands zwischen den apikalen Enden der Tentakel und Mund beinhaltet entwickelt. Es ist wichtig, (1) die frisch zubereiteten GSH-Lösung, (2) Verwenden Sie die entsprechende Konzentration von GSH, und (3) durchzuführen, das Experiment im Labor mit einer gleichmäßigen Lichtintensitäten und keine starke Luftströmungen, die reproduzierbare Messung der erhalten DSH-Gesellschafterd Fressverhalten. Füttern Antwort-ähnliches Verhalten konnte auch physikalisch durch einfaches Hinzufügen von Medium ohne GSH induziert werden. Allerdings ist ein solches Verhalten vorübergehend und nach 15-30 sec nicht spürbar. Daher war es notwendig, diese Steuerung in dem Experiment sind und die Vorschub Reaktion erst nach einer solchen reagiert die mechanische Störung verursacht wird, vollständig eingestellt messen. Um die Variation in der mechanischen Störung induzierte tentacular Kontraktion durch variable Strömungsgeschwindigkeit, mit der Glutathion-Lösung zugegeben zu minimieren, wäre es auch denkbar, den Hand Abgabe der Testlösung mit einer mechanischen Vorrichtung zu ersetzen, wie zuvor beschrieben 19. Mechanisierten Abgabe von Glutathion Lösung wäre eine strengere Kontrolle der Größe und Ausrichtung des mechanischen Stimulus, so dass es könnte in allen Abgabeereignisse einheitliche und daher intern normiert werden können.
In diesem Verfahren wird die Tentakel verteilt auf zwei di gemessensungen; während in Wirklichkeit einige der Tentakeln werden auch entlang der dritten Achse in Richtung des Betrachters verteilt. In ähnlicher Weise kann die Ausrichtung der Tentakeln nach Zugabe Glutathion ändern. Allerdings Mittelung der Tentakel über mehrere Tentakeln eines einzelnen Polypen sowie über mehrere Polypen verbreiten normalisiert die durch zweidimensionale Messungen sowie die veränderte Ausrichtung der Tentakeln eingeführt Bias. Wir schlagen vor, dass die Polypen, die der extremen Peripherie der Wanne, wo klare Beobachtung der Tentakeln ist nicht immer machbar bewegen, von der Analyse ausgeschlossen werden. Darüber hinaus nehmen die relative Tentakel Spread, der das Verhältnis der Tentakel vor und nach Zugabe von GSH zu verbreiten, und nicht der Absolutwert des Tentakel Ausbreitung nach GSH-Behandlung ist, als Maß für die Fütterung Antwort könnte in Minimierung der Variation von Variabilität induzierte führen in der Armlänge der einzelnen Polypen. Dieses Protokoll zur Messung der Glutathion-induzierte feeding Reaktion könnte ebenso nützlich für alle Hydra Spezies sein. Zur Messung Tentakel Ausbreitung in den aus großen Populationen von Hydra erhaltenen Bilder, wäre es auch möglich sein, einen Computer-Algorithmus ähnlich denen für die Analyse des Verhaltens von Tieren 20 verfügbar zu schreiben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
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