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Biology

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Published: November 16, 2014 doi: 10.3791/52178

Protocol

먹이 응답 1. 히드라 문화 및 측정

  1. 에 포함 (1 mM 트리스 - 염산 완충액, pH를 7.6, 1 ㎜의 NaCl, 1 mM의 염화칼슘 2, 0.1 mM의 KCl을, 0.1 mM의 황산을) 아테 매일 그들을 먹이 매체를 유지하여 문화의 히드라 폴립을 유지 12 시간 빛-12 시간 어두운 사이클에서 18 ° C에서 유리 그릇은 이전 12 설명 된대로.
  2. 급전 반응을 측정하기위한, 하나의 24- 웰 플레이트의 한 웰에 5-6 촉수를 갖는 히드라 폴립 성숙 옮긴다. 를 기울여 우물에서 잔류 매체를 제거하고 즉시 신선한 매체의 500 μl를 추가합니다.
  3. 히드라 매체에 9 μm의 글루타티온 솔루션을 준비합니다. 글루타티온 솔루션이 산화하는 경향이 있기 때문에, 항상 각 실험에 대한 새로 제조 된 글루타티온 솔루션을 사용합니다.
  4. 화상 기록을위한 규정을 가지는 현미경의 이미징 플랫폼에 전송 플레이트. 행동 O 그 같은 어두운 배경을 사용하여F 히드라 폴립 명확하게 대비되는 배경 이미지를 만들 수 있습니다.
  5. 방은 관찰하고 변동 강도, 공기 흐름 및 소음의 조명에서 히드라 무료의 동작을 이미징에 사용됩니다. 심지어 글루타티온의 부재 - 이러한 장애는 히드라 폴립은 촉수의 수축을 보여 발생할 수 있습니다.
  6. 용종이 5 분 동안 휴식을 취할 수 있습니다.
  7. 용종이 문제가 명확하게 영상화 할 수 있음을 잘 같은의 중심 지역을 따라 위치하고 있는지 확인합니다. 용종이 우물의 가장자리에있는 경우, 피펫을 사용하여 매체를 세척하여 센터로 가져가 다시 휴식 할 수 있습니다.
  8. 편안한 상태에서 히드라의 이미지를 캡처합니다. 이것은 제로 시점 관찰 될 것입니다.
  9. 신속 웰에서 3 μM의 최종 농도에 도달하는 9 μM 글루타치온 용액을 첨가. 히드라로 나타낸 실험과 응답의 목적에 따라, 글루타티온 및 츄 상이한 농도의 범위를 테스트필요한 적절한 농도를 SE는.
  10. 바로 4 ~ 5 분 동안 모든 15 ~ 30 초 후 글루타티온 솔루션과 캡처 이미지를 추가 한 후 타이머를 시작합니다. 시간 경과 이미징 동안 배율 설정을 변경하지 마십시오.
  11. 부드럽게 웰에 동물의 위치가 최소 현미경의 시야에 방해 될 것 같은 균일 한 흐름 글루타티온 용액을 추가한다. 용종 글루타티온 용액을 첨가 한 후에 광범위하게 이동하는 경우, 이미지 캡쳐를위한 시야에 폴립을 가지고 매우 부드럽게 플레이트를 이동.
  12. 대조 실험에서, 동일한 모든 다른 파라미터를 유지하면서 매체 글루타티온 결여 사용.
  13. 오후 1시 전에 먹이 반응의 정도에 일주기 리듬의 가능한 효과를 방지하기 - 오늘의 상반기 위의 실험 단계를 모두 수행해야합니다.
  14. GNU 이미지 조작 프로그램 (GIMP)를 사용하여 촬영 된 이미지의 각을 엽니 다. 촉수와 hypostome 각각의 정점 끝 사이의 거리를 결정하기 위해 측정> 메뉴> 도구에서 사용할 수있는 "측정"도구를 사용합니다. 입 개구가 이미지 중 관찰되는 경우, 개방 입의 중심과 정점 촉수의 단부 사이의 거리를 결정한다. 촉수 확산 등이 거리를 참조하십시오.
  15. 이전과 글루타티온 노출 후 각 용종의 평균 촉수 확산을 계산합니다. 이후의 시간 포인트에 각각 것과 제로 시점에서 평균 촉수 확산의 비율을 계산한다. 이 비율은 상대적 촉수 확산 호출됩니다.
  16. 적어도 20 폴립에 대한 측정을 반복합니다.

식 (1)
수학 식 2

2. 방법 유효성 검사를 사용하여기아 모델

  1. 기아의 경우, 별도의 유리 그릇에 몇 히드라 폴립을 전송하고 5 일간을 공급하지 않습니다. 비슷한 크기의 그릇에 아테 매일 몇 폴립의 제어 그룹을 피드. 두 실험이 매체에 곰팡이 성장을 방지하기 위해 매일 그릇에서 매체를 변경합니다.
  2. 실험 날에, 1 시간 동안 아테로 히드라의 대조군을 먹이고 매체로부터 모두 먹지 죽은 아테을 제거한 후 다음의 실험에 대해 이러한 히드라를 사용한다.
  3. 인해 관찰 시간에 치우침을 방지하기 위해 이전의 단계 1에 기재된 방법에 의해 대조군 히드라 비해 공복 히드라의 공급 응답을 측정 결핍의 각각의 측정을 교번 및 히드라 폴립을 제어한다.

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Representative Results

글루타티온은 히드라가 먹이를 집어 삼키고의 목적을 위해 입으로 촉수의 컬링을 전시됩니다. 촉수의 이러한 컬링 가까이 hypostome에 촉수의 혀끝의 끝을 제공합니다. 이것은 촉수 확산의 감소, 또는 촉수와 hypostome (도 1)의 말단 치근단 간의 직선 거리 초래한다. 상대 촉수 확산 또는 평균 촉수의 비율은 이전에 확산 및 글루타티온을 추가 한 후, 시간이 지남에 따라 감소 여러 폴립 걸쳐 평균화. 상대 촉수 확산 글루타티온 결핍 배지 첨가 후, 단, 일시적으로 감소시키고 약 분 (도 2)의 단위 값을 달성한다. 기아 글루타티온 1,13 의해 유도 급전 동작의 향상을 일으키는 것으로 알려져있다. 여기에 설명 된 급전 동작의 측정 방법은 기아 모델에 의해 확인되었다. 추가 글루타티온이 significantl 후 촉수는 1 분 확산y를 만족 시키게 그룹 (P = 1 X 등분 두 꼬리 t 테스트를 적용하여 10 -16) (그림 3)에 비해 굶어 그룹 내립니다.

그림 1
그림 1 : 평균 촉수 확산을 측정하는 방법. 편안한 히드라 폴립의 이미지 GSH과 입과 폴립의 촉수 각각의 꼭대기 끝 사이의 직선 거리가 김프 도구를 사용하여 픽셀의 개수로 측정되었다을 추가하기 전에 기록되었다. 또 다른 이미지 GSH를 첨가 한 후 캡쳐하고 촉수 스프레드는 유사한 방식으로 측정 하였다.

그림 2
그림 2 : 히드라의 GSH-유도 먹이 반응의 정량. Tentac제작은도 1에서 설명한 상대 촉수 스프레드 전에 확산 촉수의 비율로하고 (N = 14) GSH를 첨가 한 후 표시되었을 GSH 측정 하였다 첨가 후 상이한 시간 점 확산. 대조군에 대한 값은 GSH (N = 14)없이 히드라 배지 첨가 후 상대적인 촉수 확산을 나타낸다. 오류 바 ± SEM을 나타낸다.

그림 3
도 3 : 기아 모델을 이용하여 급전 반응의 정량 방법의 유효성. X 축은 굶주린 (N = 61)과 만족을 했소 (N = 66) 그룹 3 μM GSH의 첨가 한 후 시간을 나타냅니다.

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Discussion

히드라의 동작을 먹이하면 후생 동물에서 가장 조상의 화학 감각 시스템 중 하나를 나타냅니다. 자포를 이용한 먹이 캡처 이후에 출시 된 갑각류 유체에서 GSH의 존재는 오래 전 일을 발견했지만, GSHR 단백질이나 추정 인코딩 유전자 / S도는 히드라에서 최신 특징으로하고있다. 몇몇 시도 GSH가 히드라 8, 14, 15에 결합 단백질을 특성화하기 위해 이루어지고있다. 그러나, 이러한 추정되는 수용체 단백질의 ID는 급전 반응에 기여할 가능성이 불분명하고 거의 다른 분자 성분은,보고 된 남아 날짜 (16), (17). 동물의 왕국에서 유일하게 특성화 GSHR 금붕어 (18)에서이다. 이러한 포로를 제공 할 수있는 GPCR 신호 캐스케이드의 다양한 단백질의 억제제뿐만 아니라 첨단 분자 생물학적 기술 (RNAi를 매개 유전자 침묵 (gene silencing) 및 CRISPR-Cas9 매개 게놈 편집)를 사용하여 클래식 기법,히드라에 캐스케이드 신호 GSH의 분자 구성 요소의 식별을위한 erful 도구. 변화된 발현 및 기능 수용체와 GSH 시그널링의 기타 성분 등의 득점 가능 판독 공급 동작을 변경할 수있다. 그것은 GSH에 의해 유도 히드라에서 급전 반응을 측정하는 방법을 고안하는 것이 필수적이었다.

표현형, 급전 응답은 입과 입의 후속 개구쪽으로 촉수 컬링을 포함한다. 이전의 관측을 활용 우리 촉수과 입의 꼭대기 단부 사이의 거리를 측정하는 것을 포함 급지 동작을 정량 간단하고 강력한 방법을 개발 하였다. 이것은 (1) 새로 제조 GSH 용액을 사용 (2) GSH의 적절한 농도를 사용하고, (3)의 재생 가능한 측정을 얻기 위해 균일 한 광 강도없이 강한 공기 흐름을 갖는 실험실에서 실험을 수행에 필수적인 GSH-동료동작을 공급하는 거라고. 먹이 반응과 같은 행동은 물리적으로 단순히 매체 GSH 결여를 추가하여 유도 할 수있다. 그러나 이러한 행동은 과도하고 15 ~ 30 초 후에 눈에 띄지 않습니다. 따라서, 실험에서 이러한 제어를 포함하고 기계적 외란에 의한 그러한 응답이 완전히 정지 된 후에 만​​ 공급 응답을 측정 할 필요가 있었다. 글루타티온 용액을 첨가되어있는 가변 유량에 의한 기계적 교란 유발 촉수 수축의 변화를 최소화하기 위해, 또한 앞서 19 바와 같이 기계적 디바이스와 시험 용액의 수동 분배를 대체 가능하다. 글루타티온 솔루션의 기계화 분배는 모든 분배 이벤트에 걸쳐 균일하기 때문에 내부적으로 정상화 될 수 있도록 기계적인 자극의 크기와 방향의 엄격한 제어를 가능하게한다.

이 방법에서는, 촉수 확산은 두 디에 걸쳐 측정mensions; 실제로 반면, 촉수의 몇 또한 관찰자쪽으로 향하고 세 번째 축을 따라 확산된다. 마찬가지로, 촉수의 방향은 글루타티온을 추가 한 후 변경할 수 있습니다. 그러나, 단일 용종 여러 촉수 걸쳐뿐만 아니라 여러 폴립 분산 촉수를 평균화 이차원 측정뿐만 아니라 촉수 변경된 배향에 의해 도입 된 바이어스를 정규화한다. 우리는 촉수의 명확한 관찰이 항상 가능하지 아니라,의 극단적 인 주변으로 이동 폴립이 분석에서 제외 할 것을 제안한다. 또한, 급전 응답의 척도로서 전과 GSH를 첨가 한 후 확산 촉수의 비율, 그리고 GSH 처리 후의 촉수 확산 절대치 상대 촉수 확산, 복용 변동에 의해 유도되는 변화의 최소화 될 수도 각각의 폴립의 촉수의 길이. 글루타티온 유도 feedi 측정이 프로토콜NG 응답은 히드라 종 동등하게 유용 할 수있다. 히드라의 큰 집단에서 얻은 화상에서 촉수 확산을 측정하기위한, 또한 동물의 행동 (20)의 분석을 위해 사용 가능한 것과 유사한 컴퓨터 알고리즘을 작성하는 것이 가능하다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cooled Incubator Panasonic  MIR-254-PE
Microscope Leica S8AP0 
Camera for the microscope Leica  EC3
Reduced glutathione Sigma G4251 Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program GIMP Version 2.8

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References

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기본 프로토콜 문제 93 히드라 chemosensation 응답을 공급 상태를 먹이 글루타티온 먹이 기아
히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정
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Kulkarni, R., Galande, S. MeasuringMore

Kulkarni, R., Galande, S. Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra. J. Vis. Exp. (93), e52178, doi:10.3791/52178 (2014).

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