Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Protocol

1. Hydra kultur och värdering av Feeding Response

1. Upprätthålla hydra polyper i odling genom att mata dem dagligen med artemia och hålla dem i ett medium (1 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM _CaCl2, 0,1 mM KCl, och 0,1 mM MgSO ₄₎ som ingår i en glasskål vid 18 ° C under 12 h ljus-12 hr mörka cykler såsom beskrivits tidigare ^12.
2. För mätning av matningssvar, överföra en mogen hydra polyp med 5-6 tentakler till en enstaka brunn i en 24-brunnsplatta. Avlägsna återstående mediet från brunnen genom att luta den, och sedan omedelbart lägga 500 pl av färskt medium.
3. Förbered 9 iM glutation lösning i hydra medium. Eftersom glutation lösningen är benägen för oxidation, använd alltid nygjord glutation lösning för varje experiment.
4. Överför plattan till avbildning plattform för ett mikroskop med avsättningar för bildinspelning. Använd en mörk bakgrund så att beteendet of hydra polyp kan tydligt avbildas mot kontrasterande bakgrund.
5. Rummet används för observation och avbildning beteendet hos hydra fri från ljus av fluktuerande intensiteter, luftströmmar och buller. Sådana störningar kan också orsaka den hydra polyp visa sammandragning av tentakler - även i frånvaro av glutation.
6. Låt polyp att slappna av i 5 minuter.
7. Kontrollera att polyp ligger längs det centrala området av brunnen, så att beteendet kan avbildas klart. Om polyp är vid kanten av brunnen, ta med det till mitten genom att spola mediet med hjälp av en pipett och åter låta den slappna av.
8. Ta en bild av hydra i avslappnat tillstånd. Detta kommer att vara noll-tidpunkten observation.
9. Snabbt lägga 9 iM glutation lösning för att nå en slutlig koncentration av 3 iM i brunnen. Beroende på syftet med försöket och svaret visas av hydra, testa en rad olika koncentrationer av glutation och choosyns lämplig koncentration krävs.
10. Starta timern omedelbart efter tillsats av glutation-lösning och ta bilder efter varje 15-30 sekund i 4-5 min. Ändra inte förstoringsinställningarna under time-lapse avbildning.
11. Lägg glutation lösningen försiktigt och med jämnt flöde så att läget för djuret i brunnen skulle vara minimalt störd i synfältet för mikroskopet. Men om polyp rör sig i stor utsträckning efter tillsats glutation lösning, flytta plattan mycket försiktigt för att få polyp i synfältet för bildfångst.
12. I kontrollexperiment, använd medium utan glutation samtidigt alla andra parametrar är identiska.
13. Se till att utföra alla ovanstående experimentella steg under första halvan av dagen - före 13:00 för att undvika den möjliga effekten av dygnsrytmen på omfattningen av matningssvar.
14. Öppna varje tagna bilder med hjälp av GNU Image Manipulation Program (GIMP). Använd "Measure" verktyg tillgängliga från Meny> Verktyg> Åtgärd för att bestämma avståndet mellan apikala änden av var och en av tentakler och hypostomen. Om mynningen observeras i någon av bilderna, bestämma avståndet mellan centrum av den öppnade munnen och den apikala änden av tentakel. Se detta avstånd som tentacle spridning.
15. Beräkna den genomsnittliga tentakel sprids för varje polyp före och efter glutation exponering. Beräkna förhållandet mellan genomsnittliga tentakel spridning på noll-tid pekar på att vid var och en av de efterföljande tidspunkter. Detta förhållande kommer att kallas relativ tentakel spridning.
16. Upprepa mätningar under minst 20 polyper.

2. Metod Validering med hjälp avSvält Modell

1. För svält, överföra några hydra polyper till en separat glasskål och inte mata dem i 5 dagar. Mata kontrollgruppen av några få polyper dagligen med Artemia i en liknande storlek skål. Ändra mediet från både experimentella skålar dagligen för att undvika svamptillväxt i mediet.
2. På dagen för experimentet, mata kontrollgruppen av hydra med Artemia för 1 h och använda dessa hydra för efterföljande experiment efter avlägsnande av allt överblivet och döda Artemia från mediet.
3. Mät matningssvar svältes hydra i jämförelse med hydra från kontrollgruppen med hjälp av förfarandet som beskrivits tidigare i steg 1. För att undvika systematiska fel på grund av att tiden på observationen, alternera de mätningar av var och en av den svalt och kontrollera hydra polyper.

Representative Results

Glutation orsakar hydra uppvisa curling av tentaklerna mot mynningen för att uppsluka den byten. Sådan curling av tentakler ger apikala ändar tentakler närmare hypostomen. Detta resulterar i en minskning av tentakel spridning, eller det linjära avståndet mellan apikala änden av tentakel och hypostomen (Figur 1). Den relativa tentakel spridas, eller förhållandet mellan genomsnittliga tentacle spred före och efter tillsats av glutation, i genomsnitt över flera polyper minskar med tiden. Den relativa tentakel sprids efter tillsats av medium som saknar glutation minskar emellertid endast tillfälligt och uppnår enhetsvärde i ungefär en minut (Figur 2). Svält är känt för att orsaka förstärkning av matningsbeteende induceras av glutation ^1,13. Metoden att mäta ätbeteende beskrivs här validerades av svält modellen. Den tentakel spred en minut efter att ha lagt glutation var significantly lägre för starved grupp jämfört med den mätta gruppen (p = 1 x 10 ^-16 genom att applicera två tailed t-test med lika varians) (Figur 3).

Figur 1: Metod för mätning av genomsnittlig tentakel spridning. En bild av en avslappnad hydra polyp spelades in innan du lägger GSH och det linjära avståndet mellan munnen och apikala änden av var och en av tentakel av polyp mättes i termer av antalet pixlar som använder GIMP verktyget. En annan bild fångades efter tillsats GSH och tentakel spridningen mättes på liknande sätt.

Figur 2: Kvantifiering av GSH-inducerad matningssvar i hydra. Tentacle sprids vid olika tidpunkter efter tillsats av GSH mättes såsom beskrivs i Figur 1 och den relativa tentakel spridningen var betecknas som ett förhållande av tentakel sprids före och efter tillsats av GSH (n = 14). Värdena för kontrollgruppen representerar den relativa tentakel spridningen efter tillsats av hydra medium utan GSH (n = 14). Fel staplarna representerar ± SEM.

Figur 3: Validering av metoden för kvantifiering av matningssvaret med hjälp av svält modell. X-axeln representerar tiden efter tillsats av 3 | iM GSH för Starved (n = 61) och mätta (n = 66) grupper.

Discussion

Ätbeteende i hydra representerar en av de mest ancestral chemosensory system i metazoans. Även om närvaron av GSH i kräftdjur vätskan frigörs efter nematocyst assisterad byte capture upptäcktes för länge sedan ^1, har varken GSHR proteinet eller de förmodade kodnings genen / s karaktäriserats från hydra hittills. Få försök har gjorts för att karakterisera GSH-bindande proteiner i hydra ^{8, 14, 15.} Dock fortfarande om vilka dessa förmodade receptorproteiner obskyra och väldigt få andra molekylära komponenter som kan bidra till utfodring reaktion, har rapporterats datum ^{16, 17.} Den enda karakteriserade GSHR i djurriket är från guldfisk ^18. Klassiska tekniker, såsom användning av inhibitorer av olika proteiner av GPCR signaleringskaskad samt avancerade molekylärbiologiska tekniker (RNAi-medierad geners uttryck och CRISPR-Cas9 medierad genomet redigering), kan ge powfulla verktyg för identifiering av de molekylära komponenterna i GSH signaleringskaskad i hydra. Den scorable avläsning av en sådan förändrad uttryck och funktion av receptom och de andra komponenterna i GSH-signalering skulle förändras ätbeteende. Det var därför viktigt att ta fram en metod för att mäta matningssvaret i hydra inducerad av GSH.

Fenotypiskt involverar matning gensvar curling av tentaklerna mot munnen och efterföljande öppning av munnen. Använda den tidigare observationen vi utvecklat en enkel och robust metod för kvantifiering av ätbeteende som innebär att mäta avståndet mellan de apikala ändar tentacle och mun. Det är viktigt att (1) använda nyberedd GSH-lösning, (2) använda lämpliga koncentrationen av GSH, och (3) utföra experiment i laboratoriet med likformiga ljusintensiteter och inga starka luftströmmar för att få reproducerbar mätning av GSH-associeradagarna ätbeteende. Utfodring svar-liknande beteende kan också vara fysiskt induceras genom att helt enkelt lägga medium utan GSH. Men är ett sådant beteende övergående och inte märkbar efter 15-30 sek. Därför var det nödvändigt att ta med denna kontroll i försöket och för att mäta matnings svar först efter det att svaret som orsakas av den mekaniska störningen upphört helt. För att minimera variationen i mekanisk störning inducerad tentakel kontraktion orsakad av variabel flödestakt med vilken glutation lösning tillsättes, skulle det också vara lämpligt att ersätta manuell dispensering av provlösningen med en mekanisk anordning, såsom beskrivits tidigare ^19. Mekaniserad dosering av glutation lösning skulle göra det möjligt för hårdare kontroll av storleken och orienteringen av mekanisk stimulans så att det kunde vara enhetliga i alla dispense händelser och därmed normalise internt.

I denna metod är tentakel spridningen mätt över två dimåtten; medan det i själva verket några av tentaklerna också spridas längs den tredje axeln pekar mot betraktaren. På samma sätt kan orienteringen av tentakler förändras efter tillsats av glutation. Men i genomsnitt av tentakel spridda över flera tentakler en enda polyp samt över flera polyper normaliserar bias introducerades av tvådimensionella mätningar samt den förändrade inriktningen av tentaklerna. Vi föreslår att de polyper som rör sig till det yttersta periferi väl, om klara observation av tentaklerna är inte alltid möjligt, undantas från analysen. Dessutom kan ta den relativa tentakel spridning, som är förhållandet av tentakel sprids före och efter tillsats av GSH, och inte det absoluta värdet av den tentakel spridningen efter GSH behandling, som ett mått på matningssvar resulterar i minimering av variationen inducerad av variabilitet i tentakel längden på de enskilda polyper. Detta protokoll för mätning av glutation-inducerad feeding svar kan vara lika bra för alla hydra arter. För mätning tentakel spridning i bilder som kommer från stora populationer av hydra, skulle det också vara möjligt att skriva en datoralgoritm som liknar de som finns tillgängliga för analys av djurs beteende ^20.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cooled Incubator	Panasonic	MIR-254-PE
Microscope	Leica	S8AP0
Camera for the microscope	Leica	EC3
Reduced glutathione	Sigma	G4251	Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program	GIMP	Version 2.8