Protocol
Besleme Tepki 1. Hydra Kültür ve Ölçüm
- Bir yer alan (1 mM Tris-HCI tamponu, pH 7.6, 1 mM NaCI, 1 mM CaCI2, 0.1 mM KCI ve 0.1 mM MgSO 4) Artemia ile bunların günlük olarak beslemek ve bir ortam içinde tutarak kültürde hidra polipler korumak 12 saat ışık-12 saat karanlık döngüsü altında 18 ° C'de cam kase daha önce 12 açıklandığı gibi.
- Beslenme yanıtının ölçülmesi için bir 24 oyuklu plaka tek bir kuyusuna 5-6 dokunaçlarını sahip hidra polip olgun aktarın. Eğerek kuyudan kalan ortamı çıkarın, sonra hemen taze orta 500 ul ekleyin.
- Hidra ortamda 9 iM glutatyon çözeltisi hazırlayın. Glutatyon çözüm oksidasyona eğilimli olduğundan, her zaman, her deney için taze hazırlanmış glutatyon çözümü kullanın.
- Görüntü kaydı için hükme sahip bir mikroskop görüntüleme platformu için plaka aktarın. Davranış o böyle karanlık bir arka plan kullanınf hydra polip açıkça zıt arka plan karşı görüntülü olabilir.
- Oda gözlem ve dalgalanan şiddetleri, hava akımları ve gürültü ışıklar hydra serbest davranışını görüntülenmesinde kullanılan. Hatta glutatyon yokluğunda - Bu tür bozukluklar arasında ayrıca hidra polip dokunaçlarıyla daralma gösterir neden olabilir.
- Polip 5 dakika dinlenmek için izin verin.
- Polip davranışı açıkça görüntülü olabilir ki iyi böyle bir merkez bölgesi boyunca yer olduğundan emin olun. Polip kuyunun kenarında ise, bir pipet kullanarak orta kızarma tarafından merkeze getirmek ve tekrar dinlenmek için izin verir.
- Rahat bir durumda hidra'nin bir görüntü yakalayın. Bu sıfır zaman noktasında gözlem olacaktır.
- Hızlı bir şekilde de 3 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 9 uM glutation çözeltisi ekleyin. Hidra'yla gösterilen deney ve yanıtın amacına bağlı olarak, glütatyon ve Choo farklı konsantrasyonları bir dizi testiGerekli uygun konsantrasyona se.
- Hemen 4-5 dakika boyunca her 15-30 saniye sonra glutatyon çözüm ve yakalama görüntüleri ekledikten sonra Sayacı başlatmak. Time-lapse görüntüleme sırasında büyütme ayarlarını değiştirmeyin.
- Yumuşak ve kuyudaki hayvanın konumu minimal mikroskop görüş alanında rahatsız ki, bu tür homojen akımı ile glutation solüsyonu ekleyin. Polip glutatyon çözüm ekledikten sonra yoğun hareket Ancak, görüntü yakalama için görüş alanındaki polip getirmek için çok yavaşça plakasını taşıyın.
- Kontrol deneyinde, benzer diğer tüm parametreleri tutarken orta glutatyon eksik kullanımı.
- 13:00 önce beslenme yanıtının ölçüde sirkadiyen ritmin olası etkisini önlemek için - günün ilk yarısında yukarıdaki deney tüm adımları gerçekleştirmek için emin olun.
- GNU Image Manipulation Program (GIMP) kullanılarak çekilen görüntülerin her açın. Tentacles ve hypostome her apikal ucu arasındaki mesafeyi belirlemek için ölçün> Menü> Araçlar edinilebilir "Tedbir" aracını kullanın. Ağız açıklığı herhangi bir görüntü gözlenmesi durumunda, açılan ağız merkezi ve tentacle apikal ucu arasındaki mesafeyi belirler. Tentacle yayılması gibi bu mesafeye bakın.
- Öncesi ve glutatyon maruz kaldıktan sonra her polip için ortalama tentacle yayılmasını hesaplayın. Sonraki zaman noktalarında her birinde edilene sıfır zaman noktasında ortalama dokunaçlı yayılma oranı hesaplanır. Bu oran göreceli dokunaçlı yayılması çağrılır.
- En az 20 polip ölçümleri tekrarlayın.
2. Yöntem Doğrulama kullanarakAçlık Modeli
- Açlık için ayrı bir cam kase için birkaç hydra polip aktarmak ve 5 gün boyunca onları beslemek yok. Benzer bir büyüklükte bir kapta artemia ile günde birkaç polip kontrol doyur. Hem deneysel ortamda mantar üremesini önlemek için günlük kase gelen orta değiştirin.
- Deney gününde, 1 saat süre ile Artemia ile Hydra kontrol grubu besleme ve ortam tüm meyvelerin ve ölü Artemia çıkarılmasından sonra, daha sonraki deneyler için, bu Hidra kullanır.
- Nedeniyle gözlem süresi için bir eğilim önlemek için önceki adım 1 'de tarif edilen yöntemle kontrol grubundan hidra ile karşılaştırıldığında aç Hydra besleme yanıtını ölçen aç her ölçümleri alternatif ve Hydra polipler kontrol eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glutatyon Hidra av içine çeken amacıyla ağzına doğru dokunaçlarıyla buruşmasına sergilemeye neden olur. Dokunaçlarıyla böyle kıvırma yakın hypostome için dokunaçlarıyla apikal uçlarını getiriyor. Bu Hücrelerin yayılması azalma veya Hücrelerin ve hypostome (Şekil 1), apikal ucu arasındaki doğrusal mesafe ile sonuçlanmaktadır. Göreceli tentacle yayılması, ya da ortalama ahtapotun kollarından oranı önce yayılmış ve glutatyon ekledikten sonra, zamanla azaltan çoklu polipler arasında ortalama. Nispi Hücrelerin yayılması, glutatyon yoksun ortam ilave edildikten sonra, ancak, sadece geçici olarak azaltır ve yaklaşık bir dakika (Şekil 2) birim değeri ulaşır. Açlık glutatyon 1,13 ile indüklenen beslenme davranışı geliştirme neden olduğu bilinmektedir. Burada açıklanan besleme davranışı ölçüm göre bir yöntem açlık modeli ile doğrulandı. Ekleyerek glutatyon significantl oldu sonra dokunaçlı bir dakika yayıldıy tok (p = 1 x eşit varyans iki kuyruklu t-testi uygulanarak 10 -16) (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, aç grup için daha düşüktür.
Şekil 1: ortalama dokunaçlı yayılmasını ölçme yöntemi. Rahat bir hydra polip bir görüntü GSH ve ağız ve polip ahtapotun kollarından her apikal ucu arasındaki doğrusal mesafe GIMP aracını kullanarak piksel sayısı bakımından ölçüldü eklemeden önce kaydedildi. Diğer bir görüntü GSH ilave edildikten sonra yakalandı ve tentacle yayılması benzer bir şekilde ölçülmüştür.
Şekil 2: hidra GSH kaynaklı beslenme yanıtının kantitasyonu. Tentacle, Şekil 1 'de tarif edilen ve göreli Hücrelerin yayılması açıyordu tentacle bir oranı olarak (n = 14) GSH ilave edildikten sonra ifade edildiği gibi, GSH ölçülmüştür ilave edildikten sonra farklı zaman noktalarında yayıldı. Kontrol grubu için değerler GSH (n = 14) olmadan hidra ortam ilave edildikten sonra göreli Hücrelerin yayılması temsil eder. Hatalar barlar ± SEM temsil eder.
Şekil 3: açlık modeli kullanılarak beslenme yanıtının nicelendirilmesi yönteminin doğrulanması. X ekseni Aç (n = 61) ve tok (n = 66) grubu için 3 uM GSH ilave edildikten sonra süreyi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra davranışı Beslenme Metazoan'da en atalarının duyusal sistemlerinden birini temsil eder. Nematosist destekli av yakalama sonra yayımlanan kabuklu sıvısında GSH varlığı uzun zaman önce 1 tespit edildi, ancak GSHR protein ne de olası kodlayan gen / ler ne hidra bugüne kadar karakterize edilmiştir. Birkaç deneme GSH hidra 8, 14, 15, bağlama proteinleri karakterize etmek için yapılmıştır. Ancak, bu farazi reseptör proteinlerin kimlik besleme reaksiyona katkıda bulunması olasıdır karanlık ve çok az molekül bileşenleri, bildirilmiştir kalır tarih 16, 17. hayvanlar aleminde sadece karakterize GSHR akvaryum balığı 18 değil. Bu tür POW sağlayabilir GPCR sinyalleme olay zincirinin çeşitli proteinlerin inhibitörleri yanı sıra gelişmiş moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak (RNAi aracılı gen susturma ve CRISPR yer-Cas9 aracılı genom düzenleme) kullanılması gibi klasik teknikler,hydra içinde çağlayan sinyal GSH moleküler bileşenlerinin belirlenmesi için erful araçları. Değiştirilmiş bir ifade ve işleminin, reseptörün ve GSH sinyallemesinin diğer bileşenler arasında bir skor alabilir okuma beslenme davranışı değiştirilecektir. Bu GSH ile uyarılan Hydra beslenme yanıtının ölçülmesi için bir yöntem kurulması bu gerekliydi.
Fenotipik olarak, besleme yanıtı ve ağzın sonraki açıklığına doğru dokunaçlarıyla buruşmasına içerir. Eski gözlem kullanan biz ahtapotun kollarından ve ağız apikal uçları arasındaki mesafe ölçme içerir besleme davranışı nicelleştirilmesini basit ve sağlam bir yöntem geliştirdi. Bu (1) taze hazırlanmış GSH çözüm kullanmak, (2) GSH uygun konsantrasyonunu kullanmak, ve (3) ve tekrarlanabilir ölçüm elde etmek üniforma ışık yoğunluğunu ve hiçbir güçlü hava akımları olan laboratuvarda deney gerçekleştirmek için esastır GSH-ortakbeslenme davranışı d. Besleme tepki benzeri bir davranış da fiziksel olarak, sadece orta GSH eksik eklenerek uyarılabilmektedir. Ancak, bu tür davranış geçici ve 15-30 saniye sonra fark edilmez. Bu nedenle, bu deney bu denetimi ve mekanik bozukluk nedeniyle bu tepki, son verilir sonra besleme tepkisini ölçmek için gerekliydi. Glütation çözeltisi ilave edilir ve bundan ile değişken akış oranı neden mekanik bozukluğu kaynaklı dokunaçlı daralmada değişikliğini en aza indirmek için, daha önce de tarif edildiği gibi 19 mekanik bir cihaz ile test çözeltisi kılavuzu dağıtımını yerine uygun olabilir. Glutatyon çözümün Mekanize dağıtım tüm dağıtma olayı tektip ve dolayısıyla ülke normalize olabilir gibi mekanik uyaranın büyüklüğü ve yönü sıkı kontrolünü sağlayacak.
Bu yöntemde, Hücrelerin yayılması iki di boyunca ölçülürKonakları; Gerçekte ise, dokunaçlarıyla kısmı da gözlemci bakacak üçüncü eksen boyunca yayılır. Benzer şekilde, dokunaçlarıyla oryantasyon glutatyon ekledikten sonra değiştirebilirsiniz. Ancak, tek bir polip birden dokunaçlarıyla genelinde yanı sıra birden fazla polip yayılmış uzantıya da ortalama iki-boyutlu ölçümler yanı sıra dokunaçlarıyla değişen oryantasyon tarafından tanıtıldı önyargı normalleştirir. Biz dokunaçlarıyla net bir gözlem her zaman mümkün değildir kuyu, aşırı çevresine taşımak polipler, analize dahil olmasını öneririz. Bundan başka, beslenme yanıtının bir ölçüsü olarak önce ve GSH eklendikten sonra yayılan tentacle oranı, ve GSH işlemden sonra Hücrelerin yayılması mutlak değeri olan göreli Hücrelerin yayılması, alınarak değişkenlik neden varyasyon minimize neden olabilir bireysel poliplerin tentacle uzunluğunda. Glütatiyon-kaynaklı feedi ölçüm Bu protokolng cevap tüm hydra türler için aynı derecede yararlı olabilir. Hydra geniş popülasyonlardan elde edilen görüntüler Hücrelerin yayılması ölçülmesi için, aynı zamanda hayvan davranışları 20 analiz için uygun benzer bir bilgisayar algoritması yazmak mümkün olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
