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Developmental Biology

उत्पादन और चुनिंदा transduce प्राथमिक Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं को lentivirus के उपयोग के लिए Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, 2The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Research, The University of Melbourne

Abstract

Myelination न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के गठन माइलिन दोनों शामिल है कि एक जटिल प्रक्रिया है, परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में oligodendrocytes और श्वान कोशिकाओं। हम इन विट्रो myelination परख, इन विट्रो में सीएनएस myelination के अध्ययन के लिए एक स्थापित मॉडल का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं (OPCs) myelinating सह संस्कृतियों के लिए फार्म का शुद्ध प्राथमिक कृंतक पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (DRG) न्यूरॉन्स के लिए जोड़ रहे हैं। Oligodendrocytes द्वारा व्यक्त की विशेष प्रोटीन myelination पर डालती है कि विशेष रूप से भूमिकाओं से पूछताछ के क्रम में हम चुनिंदा DRG न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त किए जाने से पहले जंगली प्रकार, अनिवार्यता से सक्रिय या प्रमुख नकारात्मक प्रोटीन overexpressing lentivirus का उपयोग कर OPCs transduce कि प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह हमें विशेष रूप से myelination विनियमित करने में इन oligodendroglial प्रोटीन की भूमिकाओं से पूछताछ करने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल भी ओ.टी. के अध्ययन में लागू किया जा सकता हैउसके सेल प्रकार, इस प्रकार इस तरह के संकेत और मुआवजा तंत्र के लक्षित अध्ययन के लिए oligodendrocytes के रूप में एक वांछित सेल प्रकार से व्यक्त प्रोटीन, के चुनिंदा हेरफेर की अनुमति देता है कि एक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। अंत में, lentiviral संक्रमित OPCs के साथ इन विट्रो myelination परख के संयोजन myelination में शामिल आणविक तंत्र के विश्लेषण के लिए एक सामरिक उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

Axons की myelination दोनों मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली में कार्रवाई क्षमता के तेज और कुशल संचरण के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष कोशिकाओं, श्वान कोशिकाओं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में परिधीय तंत्रिका तंत्र और oligodendrocytes में, चारों ओर लपेट और माइलिन में ensheathe एक्सोन, प्रभावी ढंग से तंत्रिका इन्सुलेट और नाटकीय चालन एक सुविधा। myelination की प्रक्रिया रेटिना नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स दो, इंजीनियर nanofibers 3, या श्वान कोशिकाओं 4 या oligodendrocytes 5-7 या तो साथ सह सुसंस्कृत पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स का उपयोग कर इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है। इन विट्रो myelination परख तंत्रिका तंत्र myelination के अध्ययन के लिए एक स्थापित मॉडल है और यह विवो 5-8 में myelination के दौरान हो कि मौलिक प्रक्रियाओं के कई replicates। परख सी के लिए OPCs साथ पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (DRG) न्यूरॉन्स की शुद्ध आबादी के coculture, (शामिलएन एस myelination) या श्वान कोशिकाओं (पीएन myelination के लिए)। विशेष परिस्थितियों में इन myelinating कोशिकाओं vivo में उपस्थित माइलिन विशिष्ट प्रोटीन का एक ही पूरक व्यक्त कि प्लाज्मा झिल्ली इन्सुलेट का आदेश दिया, अल्ट्रा संरचनात्मक रूप से सत्यापित, बहु तहदार पत्रक में DRG के एक्सोन ensheathe।

इन विट्रो में सीएनएस myelination अध्ययन करने की सबसे अधिक इस्तेमाल सेल मॉडल सफलतापूर्वक ऐसी Neurotrophins रूप बहिर्जात कारकों विट्रो 5,6 में सीएनएस myelination पर डालती है कि प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो DRG न्यूरॉन्स और OPCs के सह-संस्कृतियों है। ऐसे वृद्धि कारकों या छोटे अणु औषधीय inhibitors के रूप में exogenous कारकों को व्यापक रूप से DRG-ओपीसी coculture मॉडल 7,9 का उपयोग कर myelination में रास्ते संकेतन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes दोनों होते हैं कि मिश्रित सह संस्कृति सेटिंग्स में, यह औपचारिक रूप से संभव बना रहा है कि विकास के कारकों या Phar या तोmacological अवरोधकों DRG न्यूरॉन्स और oligodendrocytes (राजभाषा) दोनों पर प्रभाव exerted हो सकता था। यह विशेष रूप से प्रोटीन DRGs से ही व्यक्त या oligodendroglia इस दोहरे सेल प्रणाली का उपयोग कर myelination पर डाल रही है कि भूमिकाओं काटना करने की क्षमता प्रदान करता है। स्पष्ट oligodendroglial में संकेतन मार्ग सीधे इन विट्रो myelination परख के लिए DRG न्यूरॉन्स पर बोने से पहले, के रूप में अच्छी तरह से, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती प्रोटीन दोनों overexpress लिए एक शानदार तरीका साबित हो गया है myelination, OPCs की lentiviral पारगमन, को नियंत्रित करता है कि पुष्टि करने के लिए oligodendrocytes द्वारा अनिवार्यता से व्यक्त प्रोटीन की पछाड़ना अभिव्यक्ति के रूप में। इस प्रकार इस दृष्टिकोण विशेष रूप से पूछताछ और myelination 9,10 के अध्ययन के लिए oligodendrocytes भीतर रास्ते संकेतन हेरफेर करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है।

इस पत्र में, हम हम एक lentiviral के माध्यम से चुनिंदा oligodendrocytes में ब्याज की एक प्रोटीन overexpress करने के लिए विकसित किया है कि विधियों की रिपोर्टइन विट्रो में myelination अध्ययन के लिए दृष्टिकोण। तकनीक हित के जीन से युक्त अभिव्यक्ति वैक्टर की पीढ़ी के साथ शुरू होता है, तो बाद में pENTR वेक्टर (pENTR एल 1-एल 2 pENTR4IRES2GFP) में क्लोन कर रहे हैं जो एक जंगली प्रकार, अनिवार्यता से सक्रिय या प्रमुख नकारात्मक रूप में यह हो सकता है। (ब्याज की जीन से युक्त) इस वेक्टर, सीएमवी प्रमोटर दाता (pENTR L4-आर 1 pENTR-pDNOR-सीएमवी) और 2K7 lentivector सीएमवी प्रमोटर युक्त 2K7 वेक्टर, ब्याज की जीन, एक निर्माण करने के लिए एक एंजाइम की प्रतिक्रिया में संयुक्त रहे हैं आंतरिक राइबोसोमल प्रविष्टि साइट और GFP (चित्रा 1)। PMD2.G वायरस लिफाफा और pBR8.91 वायरस पैकेज के साथ संयुक्त गेटवे क्लोन 2K7 का निर्माण बाद में OPCs transduce करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि lentivirus उत्पन्न करने के लिए HEK293T कोशिकाओं में सह ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है। Lentivirus से संक्रमित एक बार OPCs ब्याज की प्रोटीन का एक उच्च स्तरीय व्यक्त करते हैं। ये OPCs तो DRG न्यूरॉन संस्कृतियों पर वरीयता प्राप्त और प्रभाव अभिव्यक्ति है कि किया जा सकता हैवांछित प्रोटीन की के उच्च स्तर पर पूछताछ की जा सकती है myelination पर डाल रही है। सह संस्कृतियों पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा माइलिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन और immunocytochemistry के द्वारा मेलिनकृत axonal खंडों के गठन के लिए कल्पना कर रहे हैं।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन के लिए उपयोग किए गए सभी जानवरों के मिश्रित लिंग के थे और एनाटॉमी और पैथोलॉजी विभाग के पशु सुविधाएं और मेलबर्न विश्वविद्यालय में तंत्रिका विज्ञान और मानसिक स्वास्थ्य अनुसंधान फ्लोरे संस्थान में पैदा की। सभी पशु प्रक्रियाओं मेलबोर्न विश्वविद्यालय में पशु प्रयोग आचार समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया।

2K7 Lentivector 1. क्लोनिंग

  1. 2K7 lentiviral वेक्टर में ब्याज की जीन क्लोनिंग से पहले, मानक आणविक तकनीक 11 का उपयोग कर pENTR वेक्टर (3637 बीपी, प्रतिरोधी kanamycin) में जीन subclone। Subcloning के लिए EcoRI और SacII प्रतिबंध साइटों का उपयोग करें।
  2. 2K7 Lentivector का प्रवर्धन
    1. धीरे सक्षम कोशिकाओं के साथ प्लास्मिड डीएनए के 100 एनजी के मिश्रण से 2K7 lentivector डीएनए रूपांतरण और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. गर्मी झटका डीएनए / सक्षम कोशिकाओं 90 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और ampici दोनों युक्त लेग-अगर प्लेटों पर उन्हें थालीLLIN (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर chloramphenicol (15 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल)।
      नोट: chloramphenicol लंबे टर्मिनल दोहराता के बीच पुनर्संयोजन को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    3. अगले दिन, 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और chloramphenicol (15 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के दोनों युक्त लेग मीडिया में बैक्टीरियल क्लोन चयनित हो जाना। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक प्लास्मिड डीएनए Maxiprep किट का उपयोग डीएनए निकालने।
  3. 2K7 Lentivector को pENTR वेक्टर से उप-क्लोनिंग (चित्रा 1)
    चित्रा 1
    चित्रा 1:। गेटवे पुनर्संयोजन प्रक्रिया के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ब्याज की जीन, यहां फ्लैग-Erk1 के रूप में प्रतिनिधित्व, pENTR एल 1-एल 2 वेक्टर में क्लोन है। इस सीएमवी प्रमोटर और रीढ़ की हड्डी 2K7 वेक्टर युक्त pENTR L4-आर 1 वेक्टर में जोड़ा जाता है। ये तीन वैक्टर को एलआर Clonase द्वितीय प्लस एंजाइम द्वारा recombined हैंवायरस के लिए तैयार 2K7 वेक्टर में के हित जीन और प्रमोटर डालें।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए निम्न जोड़ें और धीरे मिश्रण:
      L4-आर 1 pENTR-pDNOR-सीएमवी (प्रमोटर) (60 BNG) 1-2.5 μl
      (80 BNG) 1-2.5 μl (ब्याज की जीन के साथ) एल 1-एल 2 pENTR4IRES2GFP
      K7 lentivector (80 एनजी / μl) 1 μl
      ते बफर, पीएच 82-5 μl
      कुल 8 μl
    2. -80 डिग्री सेल्सियस से clonase एंजाइम मिश्रण निकालें और दो मिनट के लिए बर्फ पर पिघलना। एंजाइम काफी दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र के साथ दक्षता क्लोनिंग कम हो गया है के रूप में इस एंजाइम -80 डिग्री सेल्सियस से एक ताजा विभाज्य है कि यह सुनिश्चित करें
    3. प्रतिक्रिया प्रति एंजाइम के 2 μl जोड़ें और भंवर के माध्यम से अच्छी तरह से मिश्रण है, और 6-24 घंटे के लिए 23-25 ​​डिग्री सेल्सियस पर clonase प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
    4. Clonase प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए (एंजाइम किट के साथ आपूर्ति) proteinase कश्मीर समाधान के 1 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. सक्षम कोशिकाओं में clonase प्रतिक्रिया मिश्रण रूपांतरण और चयन हो जाना16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) युक्त लेग मीडिया में कालोनियों।
    6. निकालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक प्लास्मिड डीएनए Miniprep किट का उपयोग डीएनए शुद्ध।
    7. विशेष मैं और सैक द्वितीय और ब्याज के प्रमोटर और जीन से युक्त टुकड़ा दूर करने के लिए निर्माता के अनुदेश के अनुसार एक उपयुक्त बफर एंजाइमों प्रतिबंध का उपयोग कर पाचन के माध्यम से डीएनए की पुष्टि करें।
      नोट: यह कदम subcloned डीएनए सही वेक्टर रीढ़ की हड्डी के साथ ब्याज की सही डालने जीन है तो जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है। डाला टुकड़ा बिना वेक्टर खुद का आकार 6.7 KB है। रिहा कर डाला टुकड़ा के आकार के प्रमोटर और ब्याज की डालने जीन दोनों शामिल हैं। एक प्लाज्मिड संपादक - उदाहरण के लिए एक डीएनए अनुक्रम संपादन प्रोग्राम, बंदर के माध्यम से विशिष्ट जीन के लिए डाइजेस्ट से उम्मीद टुकड़ा आकार की गणना।
    8. डीएनए वेक्टर रीढ़ की हड्डी और एक 1% agarose जेल से चल रहा द्वारा जारी टुकड़ा दोनों के आकार की जाँच करें1x TAE बफर में 100 वी पर (शेयर समाधान की तालिका देखें)
    9. 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) युक्त लेग मीडिया की 500 मिलीलीटर में बैक्टीरिया से बढ़ द्वारा की पुष्टि डीएनए बढ़ाना।
    10. निकालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक प्लास्मिड डीएनए Maxiprep किट का उपयोग डीएनए शुद्ध।
      नोट: Maxiprep आमतौर पर वायरल उत्पादन के लिए आवश्यक डीएनए के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करता है।
  4. दोहराएँ lentiviral की तैयारी के लिए निम्नलिखित DNAs बढ़ाना 1.3.9-1.3.10 कदम: एक नियंत्रण के रूप में लिफाफा वेक्टर (PMD2.G, 6.1 केबी), पैकेज वेक्टर (pBR8.91, 12.5 केबी), और एक खाली lentiviral वेक्टर (GFP -CMV-2K7, 8.7 KB)।

2. 2K7 वायरस उत्पादन

नोट: दिन 1:

  1. अभिकर्मक के दिन, 25 एमएल HEK293 टी सेल मीडिया वाले T175 कुप्पी में थाली 32 लाख HEK293 टी कोशिकाओं (शेयर समाधान की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से, दिन 16 लाख कोशिकाओं थालीअभिकर्मक से पहले समय अभिकर्मक के दिन पर तंग चलाता है।
    नोट: अभिकर्मक अभिकर्मक के दिन या पहले दिन पर चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा समान रूप से सफल हो सकता है। दो विकल्पों में से किसी का उपयोग करना, यहां महत्वपूर्ण बिंदु को यकीन है कि कोशिकाओं से पहले अभिकर्मक के लिए संस्कृति डिश सतह पर नीचे अटक जा बनाना है।
    ध्यान दें: दिन 2:
  2. अभिकर्मक
    1. अभिकर्मक से पहले, 10 मिमी Tris पीएच 8, विआयनीकृत पानी में 1 मिमी EDTA पीएच 8 होते हैं कि ते बफर में एक माइक्रोग्राम प्रति / μl डीएनए पतला।
    2. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, T175 कुप्पी में अभिकर्मक के लिए एक मास्टर मिश्रण (1 टेबल) तैयार करते हैं। डीएनए जोड़ें Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) गर्म पूर्व और भंवर से अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए, तो समय से पहले वर्षा से बचने के लिए बाँझ polyethylenimine (पी) (शेयर समाधान की तालिका देखें) जोड़ें। ">
      वेक्टर टुनिशिया> कंसंट्रेशन आयतन
      pMDG.2 / Μl एक माइक्रोग्राम प्रति 5 μl
      pBR8.91 / Μl एक माइक्रोग्राम प्रति 15 μl
      + GFP ब्याज की जीन के साथ 2K7 वेक्टर / Μl एक माइक्रोग्राम प्रति 22 μl
      बाँझ Polyethylenimine (पी) 1 ग्राम / एल 500 μl
      DMEM 2100 μl
      तालिका 1: 2K7 वायरस के लिए तैयारी अभिकर्मक मिश्रण।
    3. ट्यूब 3-4x inverting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और कमरे के तापमान पर 15 मिनट (आरटी) के लिए सेते हैं।
    4. HEK293T कोशिकाओं पर एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं। महाप्राण पूरी तरह से कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया से दूर है और पूर्व गर्म HEK293T सेल संस्कृति मीडिया (T175 फ्लास्क प्रति 25 एमएल) के साथ खाते हैं।
    5. अभिकर्मक मिश्रण (डीएनए / पी के मिश्रण) monolayer की कोशिकाओं के लिए बुद्धिमान बूंद जोड़ें। रातोंरात, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं मिश्रण अच्छी तरह से और सेते धीरे ले जाएँ।
      नोट: 3 दिन:
    6. अभिकर्मक सफल होता है यह सुनिश्चित करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से GFP अभिव्यक्ति 24 घंटा बाद अभिकर्मक की जाँच करें।
      नोट: GFP व्यक्त कोशिकाओं के 50% से अधिक आम तौर पर एक अच्छा अभिकर्मक इंगित करता है।
      नोट: 4 दिन:
    7. 48 घंटा बाद अभिकर्मक पर, वायरल सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और नए सिरे से HEK293 टी मीडिया (T175 फ्लास्क प्रति 25 मिलीग्राम) के साथ बदलें।
      1. सतह पर तैरनेवाला से सेल मलबे को साफ करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1140 XG पर वायरल सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। स्थानांतरण 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर ट्यूब और स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला को मंजूरी दे दी।
        नोट: दिन 5:
    8. 72 घंटा बाद अभिकर्मक पर, वायरल सतह पर तैरनेवाला के दूसरे बैच इकट्ठा। दोहराएँ चरण 2.3.1 और पूल 48 और 72 घंटा supernatants को मंजूरी दे दी।
    9. 30 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 170.000 XG पर वायरस, अपकेंद्रित्र वायरल सतह पर तैरनेवाला ध्यान केंद्रित करने के लिए।
    10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सभी को मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला वायरस के एक (अदृश्य) गोली छोड़ने centrifuged प्लस ट्यूब के आधार में पी उपजी कर दिया गया है जब तक कदम 2.6 दोहराएँ।
    11. , वायरस resuspend ultracentrifuge ट्यूबों के लिए 500 μl SATO मीडिया (शेयर समाधान की तालिका देखें) जोड़ने के लिए। 30 सेकंड के लिए एक भंवरएन डी यंत्रवत् वायरस ढीला करने के लिए एक विंदुक टिप के साथ ट्यूब के आधार परिमार्जन। वायरल गोली ढीला करने के क्रम में इस कदम 6x दोहराएँ।
    12. Microcentrifuge ट्यूब में resuspended वायरस पूल और अघुलनशील पी दूर करने के लिए बहुत संक्षेप में स्पिन। प्रोटीन को हटाने के लिए एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर।
    13. -80 डिग्री सेल्सियस पर 20 μl, 50 μl, और 100 μl aliquots और दुकान में वायरस विभाज्य।

    HEK293T कोशिकाओं में 3. वायरल अनुमापांक निर्धारण

    1. जोड़, वायरल शेयर के धारावाहिक dilutions की एक श्रृंखला के हित के प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए और प्रयोगों के लिए इष्टतम वायरल एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए (जैसे, 0, 5, 10, 20, 40, 80 μl) में चढ़ाया HEK293 टी कोशिकाओं transduce को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 6 अच्छी तरह प्लेटें, और संस्कृति, 5% सीओ 2। के जीन की मजबूत अभिव्यक्ति को प्राप्त है कि 200: इस प्रोटोकॉल आम तौर पर 01:50 से 1 के बीच की सांद्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है कि वायरस उत्पन्न करता हैइंटरेस्ट।
    2. 48 घंटे बाद वायरल पारगमन, protease inhibitors के साथ TNE बफर में lyse HEK293T कोशिकाओं (शेयर समाधान की तालिका देखें)।
      1. ठंडा DPBS के साथ दो बार कुओं कुल्ला और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 150 μl TNE बफर जोड़ें।
      2. ऊपर pipetting द्वारा और 5-10x नीचे Lyse कोशिकाओं। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पूरे सेल lysates स्थानांतरण और 15-30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
      3. अपकेंद्रित्र अधिकतम गति (20,000 XG) और हस्तांतरण पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर lysates ब्रैडफोर्ड द्वारा प्रोटीन दृढ़ संकल्प और बाद में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक ताजा ट्यूब सतह पर तैरनेवाला को मंजूरी दे दी।
    3. प्रोटीन से ही और जुड़े टैग (यानी, झंडा) के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए जांच कर रही है, जबकि मानक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण। > 95% + GFP कोशिकाओं और प्रयोगों के लिए ब्याज की प्रोटीन के मजबूत अभिव्यक्ति है कि पैदावार वायरल कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।

    4. अलगाव और संस्कृति DRGs की (एफigure 2 1 & 2) कदम

    चित्रा 2
    चित्रा 2:। इन विट्रो myelination परख DRG न्यूरॉन्स के योजनाबद्ध आरेख दो सप्ताह (1-2) से अधिक है तो शुद्ध और सुसंस्कृत P2-3 चूहा पिल्ले, से विच्छेदित कर रहे हैं। OPCs immunopanning का उपयोग कर P7-9 चूहे के दिमाग से शुद्ध कर रहे हैं (3)। OPCs तो lentivirus और 48 घंटा (4) के लिए सभ्य से संक्रमित हैं। OPCs तो DRGs पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और इस तरह के BDNF के रूप में ब्याज की किसी भी वृद्धि कारक (5) जोड़ा जाता है। सह-संस्कृतियों 2 सप्ताह OPCs axons के अंतर और myelinate करने की अनुमति देने के लिए तो संवर्धित कर रहे हैं (6)। अंत में, सह संस्कृतियों या तो पश्चिमी सोख्ता के लिए lysed या immunocytochemistry के लिए तय कर रहे हैं (7)।

    नोट: इस दिवस 1- 2 दिन पहले विच्छेदन के लिए:

    <राजभाषा>
  3. कोट के साथ 22 मिमी x 22 मिमी coverslips autoclaved पाली एल ओर्निथिन (0.5 मिलीग्राम / एमएल) 6 अच्छी तरह से थाली में, और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. अगले दिन, laminin के साथ फिर से कोट coverslips के रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस (सदस्य में 20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), बंद अतिरिक्त महाप्राण और टिशू कल्चर हुड में 20 मिनट के लिए सूखी।
    नोट: DRGs के विच्छेदन और अलगाव: दिन 2:
  5. बलिदान के p2-पी 3 चूहा पिल्ले ग्रीवा transection द्वारा 12x।
  6. पशु के पीछे से मांसपेशी overlying त्वचा निकालें। कशेरुका रंध्र खोलने के लिए और धीरे से रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना संदंश का उपयोग करने के लिए Vannas कैंची का प्रयोग करें।
  7. वर्टिब्रल कॉलम के बीच में झूठ बोलते हैं कि DRGs बाहर बांधना और 3 मिलीग्राम एल 15 मीडिया वाले एक 33 मिमी पेट्री डिश में संलग्न तो रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका तंतुओं, जगह DRGs काट दिया। यह रीढ़ की हड्डी के प्रत्येक पक्ष से DRG 8 और 12 के बीच इकट्ठा करने के लिए आमतौर पर संभव है
  8. 5 मिनट के लिए 180 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, अपकेंद्रित्र में एल -15 मीडिया के साथ स्थानांतरण एकत्र DRGs।
  9. महाप्राणसतह पर तैरनेवाला, छर्रों DRG और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 2 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें।
  10. आरटी पर 3 मिनट के लिए 180 XG पर ट्रिप्सिन, और सेंट्रीफ्यूज को रोकने के लिए DRG के छर्रों के लिए एम 1 मध्यम (शेयर समाधान की तालिका देखें) के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  11. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, (नहीं वृद्धि कारकों के साथ) 2 मिलीलीटर में पूर्व गर्म एम 1 मध्यम गोली फिर से निलंबित। 50x pipetting द्वारा या गैन्ग्लिया बिखरे हैं जब तक गैन्ग्लिया गोली Triturate। 3 मिनट के लिए 180 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
  12. Resuspend एम 1 मीडिया में न्यूरॉन्स अलग और अच्छी तरह से प्रति 100 μl प्रति 5 गैन्ग्लिया में 6 अच्छी तरह से थाली में नीचे प्लेट।
  13. , कुर्की की सुविधा एम 1 मीडिया को दूर और M2 मीडिया के साथ न्यूरॉन्स को खिलाने के लिए चार घंटा ऊष्मायन की एक न्यूनतम के बाद, गैर neuronal कोशिकाओं proliferating को दूर करने के लिए (शेयर समाधान की तालिका देखें)। NGF (100 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में संस्कृति DRG न्यूरॉन्स NGF निर्भर TrkA व्यक्त DRGs की संस्कृति को शुद्ध करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, BDNF पर निर्भर TrkB-एक्सप्रेशंस को शुद्ध करने के BDNF (100 एनजी / एमएल) का उपयोगDRGs गाते हैं।
  14. नीचे के रूप में दो सप्ताह के लिए antimitotic M2 के मीडिया के साथ बारी (100 एनजी / एमएल + NGF या BDNF) एम 1 मीडिया में न्यूरॉन्स बनाए रखें।
  15. दिन पर मध्यम एम 1 (100 एनजी / एमएल NGF या BDNF) बनाए रखें: 4-6, 8-10, दिन 1 पर 12-14 और M2 FDU के साथ मीडिया (100 एनजी / एमएल NGF या BDNF +) और uridine को 4, 6-8, और 10-12। M2 के मीडिया शुद्धि के तीन चक्र का एक न्यूनतम आवश्यकता है।
  16. दो सप्ताह antimitotic चक्र पूरा करने के बाद एक और सप्ताह के लिए एम 1 में DRGs अकेले बनाए रखें। हर 2-3 दिनों एम 1 मीडिया बदलें।

5. अलगाव और OPCs की संस्कृति (चित्रा 2 चरण 3)

नोट: इस दिवस 1- 2 दिन पहले विच्छेदन के लिए:

  1. पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल, निष्फल विआयनीकृत पानी में 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर साथ कोट 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेटें।
    नोट: दिन 2: विच्छेदन के लिए पहले एक दिन:
  2. 3x के लिए निष्फल विआयनीकृत पानी के साथ पीडीएल प्लेटें धो लें। टिशू कल्चर हुड में ~ 6 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें। सीधे दूर नहीं किया जा रहा है, तो लपेटो और दुकान4 डिग्री सेल्सियस पर चार सप्ताह के लिए।
  3. Immunopanning के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी प्लेटें तैयार करें। एक मस्तिष्क विच्छेदन के लिए, 2x आईजीजी प्लेटें तैयार (के लिए Ran2 oligodendrocytes premyelinating दूर करने के लिए astrocytes और O1 एंटीबॉडी को दूर करने के लिए एंटीबॉडी) 10 सेमी पेट्री डिश प्रति DPBS में 45 μl बकरी α माउस आईजीजी (15 मिलीग्राम) के साथ; (Oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं के चयन के लिए O4 एंटीबॉडी) के लिए 1x आईजीएम थाली, DPBS में 45 μl बकरी α माउस आईजीएम 10 सेमी पेट्री डिश प्रति (15 मिलीलीटर)।
    नोट: 3 दिन: विच्छेदन के दिन:
  4. Papain बफर (तालिका 2) के 10 एमएल में papain की 200 इकाइयों को जोड़ने, और बफर स्पष्ट बदल जाता है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म।
    कंसंट्रेशन 250 मिलीलीटर के लिए अंतिम एकाग्रता
    EBSS शेयर 10x 25 मिलीलीटर 1x
    MgSO 4 100 मिमी 2.5 मिलीलीटर 1 मिमी
    ग्लूकोज़ 30% 3 मिलीग्राम 0.46%
    EGTA 0.5 एम 1 मिलीलीटर 2 मिमी
    3 NaHCO 1 एम 6.5 मिलीलीटर 26 मिमी
    विआयनीकृत पानी और फिल्टर बाँझ के साथ 250 मिलीलीटर मात्रा को लाओ
    तालिका 2: papain बफर तैयार करना।
  5. डीपी के साथ सभी माध्यमिक एंटीबॉडी प्लेटें धो3x के लिए बी एस।
  6. आईजीजी प्लेटें और आईजीएम थाली करने के लिए O4 हाइब्रिडोमा पर Ran2 और O1 एंटीबॉडी डालो। आरटी पर दो से अधिक घंटे के लिए इन सभी प्राथमिक एंटीबॉडी प्लेटें सेते हैं।
  7. एक P7 चूहे से एक मस्तिष्क काटना। बढ़ाई कैंची के साथ एक पिल्ला सिर काटना और कैंची के साथ खोपड़ी overlying त्वचा को हटा दें।
    1. पश्चकपाल पालि, टेम्पोरल लोब से और ललाट पालि के लिए खोपड़ी के आसपास कट। 1 मिलीलीटर DPBS के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश को हस्तांतरण धीरे एक संदंश का उपयोग खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और।
    2. मोटे तौर पर कैंची या बाँझ ब्लेड के साथ छोटे टुकड़ों में मस्तिष्क पासा।
  8. एल सिस्टीन के कुछ अनाज युक्त एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में फिल्टर पूर्व गरम papain बफर (10 एमएल), तो फ़िल्टर्ड papain बफर करने के लिए 200 μl DNAase (12,500 यू / एमएल) जोड़ें।
  9. Diced मस्तिष्क के ऊतकों पर papain बफर डालो; 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. Gentlly स्थानांतरण एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग 50 मिलीलीटर ट्यूब में मस्तिष्क के ऊतकों अलग औरव्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  11. , Papain बफर निकालें मस्तिष्क के ऊतकों की मात्रा को तोड़ने के लिए pipetting द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों और titurate 5-10x को 2 मिलीलीटर लो ओवो (Ovomucoid) जोड़ने, व्यवस्थित करने और एक नया ट्यूब सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष 2 मिलीलीटर दूर करने के लिए अनुमति देते हैं।
  12. ऊतक का कोई हिस्सा बने हुए हैं जब तक मस्तिष्क के ऊतकों और दोहराने कदम 5.11 करने के लिए एक और 2 मिलीलीटर लो ओवो जोड़ें। Tituration तेजी से आक्रामक हो सकता है।
  13. अपकेंद्रित्र 200 x जी पर 15 मिनट के लिए सेल निलंबन अलग। महाप्राण बंद सतह पर तैरनेवाला और 10 मिलीलीटर हाय ओवो में resuspend सेल गोली और 200 x जी पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  14. 3x के लिए DPBS के साथ पहली immunopanning प्लेट (दौड़ा दो प्लेट) को धो लें। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, 10 एमएल में resuspend कोशिकाओं बफर (तालिका 2) panning और पहली immunopanning प्लेट (दौड़ा दो प्लेट) पर डाल देना। आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  15. 3x के लिए DPBS के साथ दूसरा immunopanning प्लेट (O1 प्लेट) को धो लें।
  16. पहले immunopanning प्लेट पर ऊष्मायन के बाद, दूसरे पर सेल निलंबन टिपimmunopanning प्लेट (O1 प्लेट), O1 थाली करने के लिए पिपेट द्वारा बफर और हस्तांतरण panning के 1-3 मिलीलीटर के साथ थाली की सतह से किसी भी ढीली कोशिकाओं कुल्ला। आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  17. तीसरे immunopanning प्लेट (O4 प्लेट) को धो लें। यह प्लेट OPCs इसकी सतह बाँध जहां सकारात्मक चयन थाली है। 3x के लिए DPBS के साथ O4 थाली धो लें।
  18. दूसरा immunopanning प्लेट पर ऊष्मायन के बाद, आरटी पर 45 मिनट के लिए कोशिकाओं, अंतिम immunopanning प्लेट (O4 प्लेट) कोशिकाओं हस्तांतरण सेते हैं। यह कदम O4 + OPCs का चयन करेंगे।
  19. पिछले immunopanning प्लेट (O4 प्लेट) से सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 6x के लिए EBSS के साथ थाली कुल्ला।
  20. थाली से दूर OPCs निकालने के लिए, गर्म 0.05% trypsin-EDTA के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर EBSS के साथ 01:10 पतला।
  21. Trypsin बेअसर करने के लिए (EBSS में किए गए) 30% FBS की 5 मिलीलीटर जोड़ें। के बारे में 50x के लिए pipetting द्वारा थाली की सतह से कोशिकाओं को निकाल दें।
  22. सभी सेल स्थानांतरण200 x जी पर 15 मिनट के लिए एक नया ट्यूब और अपकेंद्रित्र निलंबन।
  23. सेल गिनती द्वारा पीछा पूर्व गर्म SATO मीडिया 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली त्यागें। एक मस्तिष्क के विच्छेदन 1.5-2,000,000 OPCs प्राप्ति कर सकते हैं।
  24. सिलिअरी neurotrophic कारक होते हैं कि SATO मीडिया में साथ 1 एक्स 10 5 और 5 एक्स 10 5 से 10 प्रति सेमी प्लेट के बीच एक घनत्व पर शुष्क पीडीएल लेपित प्लेटों पर प्लेट कोशिकाओं (10 एमएल) (CNTF, 10 एनजी / एमएल), प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक 3 (NT3, एक एनजी / एमएल) neurotrophin (PDGF, 10, / मिलीलीटर एनजी), और forskolin (4.2 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 2,12। 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति OPCs, 8% सीओ 2।

6. transducing OPCs

  1. CNTF साथ SATO मीडिया (10ml / 10cm थाली) में संस्कृति प्राथमिक OPCs (10 एनजी / एमएल), PDGF (10 एनजी / एमएल), NT3 (1 एनजी / एमएल), और forskolin (4.2 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 37 डिग्री सेल्सियस, विच्छेदन के बाद 24 घंटे के लिए 8% सीओ 2।
  2. पूरी तरह से (10 मिलीलीटर ओपीसी संस्कृति मीडिया, ताजा बना SATO मीडिया के साथ फ़ीड कोशिकाओं बंद महाप्राण) वृद्धि कारकों के साथ () कदम 6.1 में ऊपर देखें।
  3. एक और 48 घंटे के लिए चरण 3 (चित्रा 2, चरण 4), संस्कृति OPCs द्वारा निर्धारित इष्टतम एकाग्रता के लिए OPCs करने के लिए वायरस जोड़ें।

सह-संस्कृतियों Myelinating के लिए 7. ओपीसी सीडिंग (चित्रा 2, 5 कदम और 6)

  1. दो बार 8 मिलीलीटर EBSS के साथ सतह से OPCs, पहले कुल्ला ओपीसी प्लेटें निकालने के लिए, फिर गर्म 0.05% trypsin-EDTA के 5 मिलीलीटर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर EBSS के साथ 01:10 पतला के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. EBSS में 30% FBS के साथ trypsin (5 एमएल) बेअसर और pipetting द्वारा थाली से कोशिकाओं को हटा दें। आरटी पर 15 मिनट के लिए 180 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, अपकेंद्रित्र सेल निलंबन स्थानांतरण।
  3. महाप्राण सेल गिनती द्वारा पीछा पूर्व गर्म SATO मीडिया एक मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली बंद।
  4. ओपीसी बोने से पहले, DRG संस्कृति की थाली से पूरी तरह से महाप्राण मीडिया। धीरे 200,000 OPCs DRG न्यूरॉन्स करने पर वार ड्रॉप बीज के रूप में पहले से 4-6 का वर्णन किया।
    ध्यान दें:कुल ओपीसी बोने मात्रा 22 मिमी coverslip प्रति कम से कम 200 μl होना चाहिए।
  5. फिर धीरे से 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म SATO मीडिया के साथ शीर्ष प्रति खैर, टिशू कल्चर हुड में 10 मिनट के लिए थाली चलते बिना व्यवस्थित करने के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें।
  6. वृद्धि कारकों के साथ SATO मीडिया के साथ शेष बहन OPCs replate (कदम 6.1 देखें)। ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए इन बहन OPCs का प्रयोग करें।
  7. 24 घंटे के बाद, 1% B27 के साथ सह संस्कृति मीडिया (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) युक्त SATO मीडिया (कोई कारकों) और Neurobasal (वी / वी) के साथ SATO मीडिया की जगह। मीडिया परिवर्तन के साथ 14 दिनों हर 2-3 दिनों के लिए सह संस्कृतियों को बनाए रखें।
  8. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा माइलिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सह संस्कृतियों का आकलन करें और माइलिन बुनियादी प्रोटीन मार्करों और neuronal मार्करों 4-6 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ डबल immunostaining द्वारा मेलिनकृत axonal खंडों के गठन के लिए कल्पना।

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Representative Results

झंडा टैग कोशिकी संकेत से संबंधित काइनेज 1 (फ्लैग-Erk1) एंजाइम 2K7 निर्माणों और वायरस उत्पादन के लिए आवश्यक पैकेजिंग और सहायक निर्माणों सहित दोनों का इस्तेमाल किया निर्माणों के पचाने प्रतिबंध द्वारा सत्यापित है lentivirus के उत्पादन के लिए इस्तेमाल निर्माण (चित्रा 3) ।

चित्रा 3
चित्रा 3: डीएनए का निर्माण सत्यापन। Lentivirus के उत्पादन के लिए आवश्यक सभी डीएनए निर्माणों Stbl3 बैक्टीरिया से शुद्ध और प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट द्वारा सत्यापित किया गया। गौण और पैकेजिंग वैक्टर संकेत है, और काटा हुआ प्लाज्मिड (ए) की तुलना में, NcoI और EcoRI के साथ पचा रहे थे। 2K7-GFP के SpeI और SacII (ए) के साथ पचा किया गया था। 2K7-ध्वज-Erk1 डीएनए अकेले SpeI या SacII के साथ या तो पाचन द्वारा सत्यापित, या डबल डाइजेस्ट (बी) के द्वारा किया गया था। बैंडिंग पैटर्न थेबंदर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्माण दृश्यों की आभासी पाचन से उत्पन्न होने की उम्मीद पैटर्न की तुलना में।

OPCs पर उपयोग करने के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए, Erk एक lentivirus HEK293T कोशिकाओं (चित्रा 4) में titrated किया गया था। इस वायरल HEK293T कोशिकाओं को dilutions की एक सीमा जोड़कर किया (आंकड़े -4 ए, 4C, और 4D) या OPCs (4B चित्रा) के लिए किया गया था। समय (चित्रा 4D) के साथ जीन के हित में वृद्धि की अभिव्यक्ति के स्तर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: HEK293T कोशिकाओं और OPCs में फ्लैग-Erk1 वायरस का अनुमापन। ध्वज-Erk1 वायरस HEK293T कोशिकाओं में titrated किया गया था (ए, सी, डी) या OPCs (बी)। HEK293T कोशिकाओं (ए) या OPCs (बी) के ध्वज-Erk1 वायरस से संक्रमण के बाद GFP अभिव्यक्ति के 48 घंटे के लिए imaged थे। HEK293T सेल lysates Erk1 या संक्रमण की कुल Erk1 / 2 48 के बाद मानव संसाधन (सी) की उपस्थिति के लिए जांच कर रहे थे। HEK293T सेल lysates एक लोडिंग नियंत्रण 48 घंटा या ध्वज-Erk1 वायरस (डी) के साथ संक्रमण के बाद 96 घंटा या तो के रूप में चिह्नित की उपस्थिति, Erk1 / 2 और actin के लिए जांच कर रहे थे। ये दाग सब मिट और दो ​​समय अंक (डी) में अभिव्यक्ति के स्तर के प्रत्यक्ष तुलना की सुविधा के लिए एक साथ imaged थे। (ए) के लिए स्केल बार 100 माइक्रोन =। (बी) के लिए स्केल बार 50 माइक्रोन =। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इष्टतम वायरस कमजोर पड़ने निर्धारित किया गया है, शुद्ध OPCs transgene अभिव्यक्ति suff तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए 48 घंटे की एक न्यूनतम के लिए संक्रमित और सुसंस्कृत थेicient स्तर, फिर उनके myelination संभावित (चित्रा 5) का आकलन करने के लिए DRG न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त। DRG न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त एक बार, OPCs oligodendrocytes में अंतर है, और पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 5C) द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो माइलिन प्रोटीन, व्यक्त करने के लिए शुरू हो जाएगा। कुछ परिपक्व oligodendrocytes myelinate जाएगा, और इस MBP, धुंधला (चित्रा 5D) के माध्यम से देखे जा सकते हैं। Axons भी myelination के स्तर का विश्लेषण करते समय अक्षतंतु घनत्व को ध्यान में रखा जाता है सुनिश्चित करने के लिए इस तरह के neurofilament या βIII ट्यूबिलिन (चित्रा 5D) के रूप में एक मार्कर के साथ दाग होने की जरूरत है।

चित्रा 5
चित्रा 5: OPCs DRG न्यूरॉन्स पर बोने से पहले 48 घंटे के लिए चिह्नित-Erk1 वायरस से संक्रमित थे। दीदी OPCs तय की और फ्लैग और GFP (ए) के लिए दाग या lysed और सत्यापित करने के लिए ध्वज और Erk1 के लिए जांच कर रहे थे या तोvirally-overexpressed प्रोटीन (सी) की अभिव्यक्ति। सह-संस्कृतियों संस्कृति में दो सप्ताह के बाद तय की और βIII ट्यूबिलिन और MBP DRG के एक्सोन कल्पना करने के लिए और myelinating के रूप में अच्छी तरह से गैर myelinating oligodendrocytes (बी) के लिए दाग रहे थे। एक myelinating oligodendrocyte तीर सिर (बी) ने संकेत दिया है तीर और एक गैर myelinating oligodendrocyte ने संकेत दिया है। समानांतर सह संस्कृतियों lysed और सह संस्कृति (डी) में transgene अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के माइलिन प्रोटीन है MBP और पत्रिका, साथ ही ध्वज और Erk1 / 2 के लिए जांच कर रहे थे। Erk1 के स्तर में वृद्धि के कारण lysates स्केल बार = 20 माइक्रोन में मौजूद DRG के व्युत्पन्न Erk1 की बड़ी मात्रा में करने के लिए सह संस्कृति में दिखाई नहीं था।

नाम सामग्री टिप्पणियाँ
ते बफर पीएच 8 10 मिमी Tris 8 पीएच
1 मिमी EDTA पीएच 8 		विआयनीकृत पानी में अप करें।
Polyethylenimine (पी) 1 ग्राम / एल -20 डिग्री सेल्सियस पर विआयनीकृत पानी, फिल्टर बाँझ और दुकान के शेयरों में अप करें।
लेग मध्यम 20 ग्राम Tryptone
10 ग्राम खमीर निकालने
10 ग्राम सोडियम क्लोराइड 		विआयनीकृत पानी के साथ 2 एल के लिए कर
50% ग्लिसरॉल शेयर ग्लिसरॉल विआयनीकृत पानी और आटोक्लेव के एक बराबर मात्रा के साथ बनाओ
HEK 293 टी सेल मध्यम DMEM
10% भ्रूण गोजातीय सीरम
1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन
1% एल glutamine
TNE lysis बफर 10 मिमी Tris 8 पीएच
150 मिमी NaCl
1 मिमी EDTA पीएच 8
1% NP40 		यह पानी के साथ संपर्क पर मणिभ जाएगा के रूप में पहली विआयनीकृत पानी की एक छोटी मात्रा में NP40 भंग। विआयनीकृत पानी में अंतिम मात्रा के लिए कर
एम 1 सदस्य
10% भ्रूण गोजातीय सीरम
0.4% ग्लूकोज़
2 एनएम एल ग्लूटामेट
1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 		चूहे DRG न्यूरॉन्स के साथ प्रयोग के लिए
MM1 Neurobasal मध्यम
2% B27 (SM1) के पूरक
0.4% ग्लूकोज़
2 एनएम एल ग्लूटामेट
1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 		माउस DRG न्यूरॉन्स के साथ प्रयोग के लिए
M2 DMEM
10 मिलीग्राम / एल transferrin
5 मिलीग्राम / एल इंसुलिन
20 एनएम प्रोजेस्टेरोन
100 माइक्रोन प्यूटर्साइन
10 माइक्रोन FDU
10 माइक्रोन uridine 		1-2 महीनों में उपयोग के लिए एक बड़ी मात्रा FDU बिना DMEM और uridine में M2 अप करें। दो सप्ताह के भीतर समाप्त हो सकता है कि छोटे संस्करणों के लिए FDU और uridine जोड़ें
mm2 MM1
10 माइक्रोन FDU
10 माइक्रोन uridine 		दो सप्ताह के भीतर समाप्त हो सकता है कि मध्यम से छोटे संस्करणों के लिए FDU और uridine जोड़ें।
10x मीट्रिक टन पीबीएस 7.4 पीएच 28.48 ग्राम / एल (160 मिमी) दो ना HPO 4 · 2H 2 हे
5.52 ग्राम / एल (40 मिमी) नाह 2 पीओ 4 · एच 2 ओ
87.66 ग्राम / एल (1.5 मी) NaCl 		विआयनीकृत पानी जोड़ें और 10 एन NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित
1x मीट्रिक टन पीबीएस 10x मीट्रिक टन पीबीएस
विआयनीकृत पानी 		1x मीट्रिक टन पीबीएस बनाने के लिए विआयनीकृत पानी में 10x मीट्रिक टन पीबीएस 01:10 पतला
10x borate बफर (1.5 मी) 18.55 छ बोरिक एसिड
1x मीट्रिक टन पीबीएस 		150 मिलीलीटर 1x एमटी-पीबीएस में बोरिक एसिड भंग। 10 एन NaOH के साथ पीएच 8.56 को समायोजित करने और 1x एमटी-पीबीएस के साथ 200 मिलीलीटर अंतिम मात्रा लाने के लिए। आटोक्लेव
1x borate बफर (0.15 मीटर) 10x borate बफर
1x मीट्रिक टन पीबीएस 		में PLN भंग करने के लिए इस बफर के 100 मिलीलीटर तैयार करें। 10 मिलीलीटर 10x borate बफर (पीएच 8.56) की 1x मीट्रिक टन पीबीएस के 90 मिलीलीटर जोड़ें
0.5 मिलीग्राम / एमएल पाली एल ओर्निथिन (PLN) 50मिलीग्राम पाली एल ओर्निथिन hydrobromide
0.15 मीटर borate बफर (पीएच 8.56) 		1x borate बफर के 100 मिलीलीटर में पाली एल ओर्निथिन hydrobromide के 50 मिलीग्राम भंग। अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन फिल्टर) और दुकान
100x पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) 5 मिलीग्राम पाली-डी lysine
बाँझ, विआयनीकृत पानी 		100x पीडीएल शेयरों एकल उपयोग aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है। उपयोग करने पर, बाँझ, विआयनीकृत पानी में 1x को पतला
Papain बफर तालिका 2 देखें
DNase 12,500 यू DNase मैं
1 मिलीलीटर EBSS 		बर्फ पर, ठंडा EBSS के 1 मिलीलीटर में DNase मैं भंग। विभाज्य (उदाहरण के लिए, 300 μl / ट्यूब) और -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात फ्रीज। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
4% बीएसए जी 8 बीएसए
200 मिलीलीटर DPBS 		37 डिग्री सेल्सियस से कम 150 मिलीलीटर DPBS में बीएसए भंग। ~ साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें1 एन NaOH के 1 मिलीलीटर। 200 मिलीलीटर मात्रा लाओ। बाँझ 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान बनाओ।
10x लो Ovomucoid 3 जी बीएसए
200 मिलीलीटर DPBS
3 जी Trypsin अवरोध करनेवाला 		150 मिलीलीटर DPBS के लिए बीएसए जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। Trypsin अवरोध करनेवाला जोड़ें और भंग करने के लिए मिश्रण। 7.4 पीएच को समायोजित करने के लिए एक एन NaOH के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ें। DPBS के साथ 200 मिलीलीटर मात्रा लाओ। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर बाँझ। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान बनाओ।
6x हाय Ovomucoid 6 ग्राम बीएसए
200 मिलीलीटर DPBS
6 ग्राम trypsin अवरोध करनेवाला 		150 मिलीलीटर DPBS के लिए बीएसए जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। Trypsin अवरोध करनेवाला जोड़ें और भंग करने के लिए मिश्रण। 7.4 पीएच को समायोजित करने के लिए 1N NaOH के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ें। DPBS के साथ 200 मिलीलीटर मात्रा लाओ। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर बाँझ। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मीटर aliquots और दुकान बनाओ।
SATO आधार 3 टेबल देखें
SATO मीडिया (चूहा) 1% SATO आधार
1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन
1% 0.5 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन
1% एल Glutamine
0.1% एनएसी
0.1% बायोटिन
DMEM और फिल्टर बाँझ के साथ अप करें।
SATO मीडिया (माउस) 1% SATO आधार
1% 0.5 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन
1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन
1% एल Glutamine
0.1% एनएसी
0.1% बायोटिन
0.1% ट्रेस तत्वों बी
2% B27
DMEM और फिल्टर बाँझ के साथ अप करें।
इंसुलिन 10 मिलीग्राम इंसुलिन
20 मिलीलीटर बाँझ deionzed पानी 		विआयनीकृत पानी के लिए इंसुलिन जोड़ें और इंसुलिन भंग करने की अनुमति देने के लिए 1 एन एचसीएल के 100 μl जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं। 4-6 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से फ़िल्टर
एनएसी (एन Acetyl- एल सिस्टीन) 5 मिलीग्राम / एमएल एनएसी
DMEM 		एक 5 मिलीग्राम बनाने के लिए DMEM में एनएसी भंग/ एमएल -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान, विभाज्य और दुकान।
डी बायोटिन / एमएल बायोटिन 50 माइक्रोग्राम प्रति
बाँझ, विआयनीकृत पानी 		-20 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / समाधान, विभाज्य और दुकान बनाने के लिए पानी में बायोटिन भंग।
CNTF (सिलिअरी neurotrophic कारक) 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / CNTF
DPBS में 0.2% बीएसए 		DPBS में बाँझ 0.2% BSA के साथ एक 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / समाधान बनाने के लिए CNTF पतला। विभाज्य, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज।
PDGF (प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक) 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PDGF
DPBS में 0.2% बीएसए 		DPBS में बाँझ 0.2% BSA के साथ 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार) PDGF गुरु शेयर पतला। विभाज्य, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज।
NT3 (Neurotrophin -3) एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एनटी -3
DPBS में 0.2% बीएसए 		NT3 मास्टर stoc पतलाकश्मीर DPBS में बाँझ 0.2% BSA के साथ एक माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार)। विभाज्य, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज।
Forskolin 50 मिलीग्राम forskolin
बाँझ DMSO के 		Forskolin के 50 मिलीग्राम की बोतल के लिए 1 मिलीलीटर बाँझ DMSO के जोड़ें और पूरी तरह से resuspend करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण और 4.2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 11 मिलीलीटर बाँझ DMSO के जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान।

तालिका 3. शेयर समाधान।

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Discussion

Axons की myelination रीढ़ के मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली दोनों के इष्टतम समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। मेलिनकृत axons की पीढ़ी और रखरखाव और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन (श्वान कोशिकाओं या oligodendrocytes से) आणविक न्यूरोनल के बीच बातचीत, glial से जुड़े एक जटिल और समन्वित प्रक्रिया है। इस प्रोटोकॉल के महत्व और प्रयोज्यता यह मिश्रित सह संस्कृति सेटिंग्स के भीतर एक विशेष सेल प्रकार में प्रोटीन के हेरफेर की अनुमति देता है। अनेक प्रकार की कोशिकाओं विशेष प्रोटीन की गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए कुंद औषधीय उपकरण का उपयोग कर, विवो में और इन विट्रो myelination परख में दोनों myelination में शामिल कर रहे हैं या संकेत दे रास्ते प्रोटीन या तो एक neuronal से myelination पर डालती है कि प्रभाव के बारे में विशेष जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं या glial परिप्रेक्ष्य, प्रोटीन विशिष्ट एक सेल प्रकार से व्यक्त किया जाता है जब तक। इस प्रकार, इन विट्रो myelination के रूप मेंoligodendroglial प्रोटीन myelination पर डालती है कि प्रभाव से पूछताछ करने के लिए हमें की अनुमति देता है, विशेष रूप से OPCs transduce को lentivirus के उपयोग के साथ संयोजन के रूप में कहते हैं। हम सफलतापूर्वक oligodendroglial संकेतों सीएनएस myelination 9 पर डालती है कि प्रभाव काटना के क्रम में विशेष रूप से इन विट्रो myelination परख के लिए oligodendrocytes में विशेष प्रोटीन overexpress को 2K7 Lentivirus का इस्तेमाल किया है।

इन विट्रो myelination परख में transduced ओपीसी में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, अनुकूलन dissections और OPC बोने के माध्यम से क्लोनिंग से प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक है। यह डीएनए के स्तर पर, ब्याज निर्माण के निशान लगाया हुआ जीन से युक्त pENTR वेक्टर अनुक्रम है, जरूरी है कि और ब्याज की में चिह्नित जीन के साथ 2K7 डीएनए टैग की अभिव्यक्ति और ब्याज की जीन के लिए पश्चिमी धब्बा द्वारा जाँच की है कि, वायरस उत्पन्न करने के लिए डीएनए का उपयोग करने से पहले। यह या तो HEK293Tcells या HEK293 चयन करने के लिए आवश्यक हैएफटी कोशिकाओं वायरस पैदा करते हैं और माइकोप्लाज्मा मुक्त वातावरण के तहत विकसित करने के लिए। Lentivirus के उत्पादन के बाद यह OPCs पर उपयोग करने के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने निर्धारित करने के लिए वायरस के प्रत्येक बैच टाइट्रेट करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस HEK293T कोशिकाओं को या OPCs वायरल dilutions की एक सीमा जोड़कर किया जा सकता है। 2K7 निर्माण दोनों जीन के हित और GFP होता है, पारगमन की प्रभावकारिता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP की अभिव्यक्ति से और टैग की अभिव्यक्ति और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा ब्याज की जीन परख करने की क्रिया द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। यह संभव है के रूप में कई वायरल कणों एक एकल कोशिका को संक्रमित करने के लिए उज्जवल GFP + कोशिकाओं, उच्च वायरस सांद्रता के साथ दिखाई हो जाएगा। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से GFP की अभिव्यक्ति का सत्यापन GFP के वायरस और अभिव्यक्ति की अनुमापांक का एक उपयोगी सूचक है, लेकिन ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जाँच के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। यह दोनों HEK293T कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को सत्यापित करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण हैऔर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा OPCs। ब्याज की प्रोटीन सह संस्कृतियों में न्यूरॉन्स द्वारा endogenously व्यक्त किया जाता है तो पश्चिमी धब्बा द्वारा सह संस्कृति lysate का विश्लेषण, OPCs / OLS द्वारा overexpression नकाबपोश जा सकता है; इस प्रकार यह सह संस्कृति में यदि नहीं, तो ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति बहन OPCs में सत्यापित किया जा सकता है ताकि बोने निम्न ब्याज या संस्कृति बहन OPCs के प्रोटीन टैग करने के लिए या तो महत्वपूर्ण है।

प्रयोगों के सफल होता अगर DRG और OPC संस्कृति दोनों की गुणवत्ता को सीधे निर्धारित करता है। Coculture सेटिंग्स में, चूहे DRG न्यूरॉन्स चूहे या माउस या तो से निकाली गई OPCs साथ cocultured जा सकता है। OPCs कोमल और तेजी से निपटने की आवश्यकता है। यह बहुत कम प्रभावी ढंग से न्यूरॉन्स पर बीज के लिए भी कुछ कोशिकाओं रहे हैं ताकि OPCs के लिए विषाक्त है ब्याज और बहुत ज्यादा वायरस के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के निम्न स्तर के लिए अग्रणी OPCs transduce करने में विफल रहता है के रूप में OPCs के लिए वायरस अनुमापांक अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन उप इष्टतम transductions दोनों resul सकता हैmyelination या माइलिन प्रोटीन अभिव्यक्ति में unanalyzable या नगण्य परिवर्तन में टी। वे मिला हुआ खत्म हो जाते हैं और वे स्थानीय परिस्थितियों के लिए अनुकूलित किया जाना है, सुसंस्कृत OPCs और transduced की जरूरत है की इस प्रकार संख्या भेदभाव किए जाने के बाद वरीयता प्राप्त नहीं किया जा सकता है अगर OPCs अलग। यह कई प्रयोगों से अधिक स्थितियों के बीच तुलना करने के लिए मेलिनकृत axonal खंडों की संख्या का प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति के प्रत्येक myelination परख के लिए OPCs की एक ही नंबर बीज के लिए वांछनीय है।

इस तकनीक का एक संभावित सीमा myelination assays के बीच बेसल myelination स्तर में परिवर्तनशीलता है। वायरल पारगमन के बाद, myelination के बेसल स्तर virally संक्रमित OPCs भोली (गैर वायरल संक्रमित) OPCs के रूप में के रूप में अच्छी तरह से myelinate नहीं है, सुझाव है कि कम है। यह प्रत्येक परख में बेसल myelination को myelination रिश्तेदार की हद तक बढ़ाता द्वारा दूर किया जा सकता है। इस प्रकार, केवल GFP व्यक्त कि खाली वेक्टर एक आंतरिक contr के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिएराजभाषा। Myelination के अलावा, ब्याज की एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति भी myelination पर एक अप्रत्यक्ष प्रभाव के लिए अग्रणी, इस तरह के अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव के रूप में OPCs के अन्य पहलुओं को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, इस तरह के सेल व्यवहार्यता के रूप में OPC के व्यवहार का विश्लेषण myelination assays के लिए समानांतर में किया जाना चाहिए।

यहाँ वर्णित वायरल पारगमन के तरीकों oligodendrocyte myelination के अध्ययन तक सीमित नहीं हैं; वास्तव में यह सामान्यीकृत और अनुकूलन के अलग-अलग सेल प्रकार के लिए आवश्यक हो सकता है, जबकि इस तरह के श्वान कोशिकाओं, astrocytes, और न्यूरॉन्स के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल एक मिश्रित सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते समय विशेष फायदे हैं जो वांछित सेल प्रकार, में ब्याज (जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती) के एक प्रोटीन के चुनिंदा overexpression द्वारा प्रसार और भेदभाव के रूप में इस तरह के सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए महान लचीलापन प्रदान करता है। पारगमन के लिए उपयोग किया जाता है कि कोशिकाओं को चूहे या तो से अलग किया जा सकतामाउस (जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक), इस प्रकार एक vivo में ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग करने से लेने को प्राप्त करने के लिए आम तौर पर मुश्किल होता है जो ट्रांसजेनिक जानवरों में संकेत और मुआवजा तंत्र के लक्षित अध्ययन, और अधिक समय के लिए अनुमति देता है। हाल ही में सबूत lentiviral आधारित रणनीति को सफलतापूर्वक विवो में lentiviral दृष्टिकोण का उपयोग कर oligodendroglial कोशिकाओं transducing के एक मजबूत क्षमता का सुझाव दे, पशु मॉडल 13 में सेल पारगमन के लिए इस्तेमाल किया गया है कि सलाह देते हैं।

अंत में, OPCs की Lentiviral संक्रमण के साथ इन विट्रो myelination परख के संयोजन myelination में शामिल आणविक तंत्र के विश्लेषण के लिए एक सामरिक उपकरण प्रदान करता है। myelination में विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका से पूछताछ की जा सकती है और OPCs चूहे DRG के सह संस्कृतियों पर उपयोग के लिए चूहों और चूहों से अलग किया जा सकता है, के रूप lentiviral दृष्टिकोण भी मैक् पूछताछ के लिए विभिन्न माउस लाइनों की पीटकर तकनीक के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता हैmyelination की प्रक्रिया में मुआवजे की anisms।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2K7 lentivector  Kind gift from Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) Life Technologies A11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11012
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement Stem Cell Technologies  5711
BDNF (Human) Peprotech PT450021000
Biotin (d-Biotin) Sigma Aldrich B4639
Bradford Reagent Sigma Aldrich B6916-500ML  
BSA Sigma Aldrich A4161
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-100G
CNTF Peprotech 450-13020
DAKO fluoresence mounting media DAKO S302380-2
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Life Technologies 10313039
DNase Sigma-Aldrich D5025-375KU
DPBS Life Technologies 14190250
DPBS, calcium, magnesium Life Technologies 14040182
EBSS Life Technologies 14155063
EcoRI-HF NEB R3101
Entry vectors for promoter and gene of interest Generate as per protocols 1-2
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C
Forskolin  Sigma Aldrich F6886-50MG
Glucose (D-glucose) Sigma-Aldrich G7528
Glycerol Chem Supply GL010-500M See stock solutions
Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115005003
Goat Anti-Mouse IgM  Jackson ImmunoResearch 115005020
Goat Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Igepal Sigma Aldrich I3021-100ML 
Insulin  Sigma Aldrich I6634 
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615
Laminin  Life Technologies 23017015
LB Medium See stock solutions
LB-Agar See stock solutions
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-7477
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415064
L-Glutamate Sigma-Aldrich G1626
L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid Life Technologies 25030081
LR Clonase II Plus enzyme Life Technologies 12538-120
MEM, NEAA, no Glutamine Life Technologies 10370088
Mouse α βIII Tubulin  Promega G7121
Mouse αMBP (monoclonal) Millipore MAB381
Na pyruvate  Life Technologies 11360-070
NAC Sigma Aldrich A8199
NcoI-HF NEB R3193S
NEBuffer 4 NEB B7004S
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
NGF (mouse) Alomone Labs N-100
NT-3 Peprotech  450-03
O1 antibody - Mouse anti-O1 Millipore MAB344 Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable
O1 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning
O4 antibody - Mouse anti-O4 Millipore MAB345 Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable
O4 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning
Competent cells Life Technologies A10460
One Shot Stbl competent cells Life Technologies C7373-03
Papain Suspension Worthington/Cooper LS003126
pBR8.91 Kind gift from Dr Denham10
PDGF-AA (Human) Peprotech PT10013A500  
Penicillin-streptomycin 100x solution Life Technologies 15140122
pENTRY4IRES2GFP Invitrogen 11818-010 
pMD2.G Addgene 12259
Poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Polyethylenimine (PEI)  Sigma-Aldrich 408727-100ML
Poly-L-ornithine  Sigma Aldrich  P3655
Progesterone  Sigma Aldrich P8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini) Roche 11836153001
Proteinase K Supplied with Clonase enzyme
Putrescine Sigma Aldrich P-5780
Rabbit α neurofilament Millipore AB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal) Millipore AB980
Ran2 hybridoma cells ATCC TIB-119 Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning
Rat anti CD140A/PDGFRa antibody BD Pharmingen 558774
SacII NEB R0157
SOC medium Supplied with competent bacteria
Sodium selenite  Sigma Aldrich S5261
Spe I NEB R0133S
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Buffer NEB B0202S
TE buffer pH8 See stock solutions
TNE lysis buffer
Trace Elements B Cellgro  99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin human) Sigma-Aldrich T1147
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White Roche 10109878001
Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) Life Technologies 25300-054
Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 Vector laboratories  L-1100
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 95 lentivirus cocultures oligodendrocyte myelination oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स
उत्पादन और चुनिंदा transduce प्राथमिक Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं को lentivirus के उपयोग के लिए<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Myelination Assays
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Peckham, H. M., Ferner, A. H.,… More

Peckham, H. M., Ferner, A. H., Giuffrida, L., Murray, S. S., Xiao, J. Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays. J. Vis. Exp. (95), e52179, doi:10.3791/52179 (2015).

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