Abstract
Myelinisering er en kompleks prosess som involverer både neuroner og gliaceller som danner myelin, oligodendrocytter i sentralnervesystemet (CNS) og Schwann-celler i det perifere nervesystemet (PNS). Vi bruker en in vitro myelinisering assay, en etablert modell for å studere CNS myelinisering in vitro. For å gjøre dette, er oligodendrocyte forløperceller (OPCs) lagt til de rensede primære gnager dorsal root ganglion (DRG) nevroner å danne myelinerende co-kulturer. For å spesifikt utspørre de roller som spesielle proteiner uttrykt av oligodendrocytter utøve på myelinisering har vi utviklet protokoller som selektivt transduce OPCS hjelp av lentivirus overekspresjon villtype, konstitutivt aktive eller dominante negative proteinene før de blir sådd ut på DRG neuroner. Dette gir oss muligheten til å spesifikt avhøre rollene til disse oligodendroglial proteiner i regulering myelination. Protokollene kan også anvendes i studiet av othennes celletyper, og dermed gi en tilnærming som gjør selektiv manipulering av proteiner uttrykt av en ønsket celletype, for eksempel oligodendrocytter for målrettet studie av signal- og kompensasjonsmekanismer. Som konklusjon, som kombinerer in vitro-assay myelinisering med lentivirale infisert OPCS gir et strategisk verktøy for analyse av molekylære mekanismer som er involvert i myelinisering.
Introduction
Myelination av aksoner er avgjørende for rask og effektiv overføring av aksjonspotensialer i både sentrale og perifere nervesystemet. Spesialiserte celler, Schwann celler i det perifere nervesystemet og oligodendrocytter i sentralnervesystemet, vikle rundt og ensheathe axoner i myelin, effektivt isolerende nerve og tilrettelegging saltatory ledning 1. Prosessen med myelination kan studeres in vitro ved bruk av retinal ganglion nevroner 2, konstruerte nanofibre 3 eller dorsal root ganglion nevroner co-dyrkede med enten Schwann celler fire eller oligodendrocytter 5-7. Den in vitro myelinisering analysen er en etablert modell for å studere nervesystemet myelinisering og det replikerer mange av de grunnleggende prosesser som oppstår under myelinisering in vivo 5-8. Analysen innebærer coculture av renset bestander av Dorsal Root Ganglion (DRG) nevroner, med OPCs (for CNS myelination) eller Schwann celler (for PNS myelination). Under spesielle forhold disse myelinerende celler ensheathe DRG axoner i den bestilt, ultra strukturelt bekreftet, multi-lamellær ark av isolerende plasma membran som uttrykker den samme komplement av myelin spesifikke proteiner tilstede in vivo.
Den mest brukte cellemodell for å studere CNS myelinisering in vitro er de ko-kulturer av DRG-neuroner og OPCS, som har blitt benyttet for å studere effekten at eksogene faktorer som neurotrofinene utøve på CNS myelinisering in vitro 5,6. Eksogene faktorer som vekstfaktorer eller lavmolekylære farmakologiske inhibitorer har blitt mye brukt for å studere rollen til signalveier i myelinisering ved hjelp av DRG-OPC coculture modell 7,9. Men i de blandede innstillinger ko-kultur som inneholder både neuroner og oligodendrocytter, det forble formelt er mulig at enten vekstfaktorer eller Pharfarmakologiske hemmere kunne ha utøvet effekter på både DRG nevroner og oligodendrocytter (OL). Dette gjør tilbyr muligheten til å spesifikt dissekere de rollene som proteinene uttrykt bare av DRG eller oligodendroglia utøver på myelination bruke denne dual cellesystem. For å utvetydig bekreftet at signalveien i oligodendroglial direkte regulerer myelinisering, lentiviral transduksjon av OPCS, før såing på DRG-neuroner for in vitro assay myelinisering, har vist seg å være en elegant måte å overuttrykke både villtype og mutante proteiner, så vel som knockdown uttrykk for konstitutivt uttrykte proteiner ved oligodendrocytter. Derfor er denne tilnærmingen gir en vei å spesifikt forhøre og manipulere signalveier innenfor oligodendrocytter for å studere myelination 9,10.
I denne artikkelen rapporterer vi metoder som vi har utviklet for å overuttrykke et protein av interesse selektivt i oligodendrocytter via en lentiviraltilnærming for å studere myelinisering in vitro. Teknikken begynner med dannelsen av ekspresjonsvektorer inneholdende genet av interesse, det være seg i en vill-type, konstitutivt aktiv eller dominant negativ form som deretter blir deretter klonet inn i vektoren pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Denne vektor (som inneholder genet av interesse) er CMV promoter donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) og 2K7 lentivector kombinert i en enzymreaksjon for å produsere en 2K7 vektor inneholdende CMV-promoteren, genet av interesse, en intern ribosomalt oppføring nettstedet og GFP (figur 1). Dette Gateway klonet 2K7 konstruere kombinert med PMD2.G virus konvolutt og pBR8.91 virus pakken kan være co-transfektert inn HEK293T celler til å generere lentivirus som senere kan brukes til å transduce OPCs. Når infisert med lentivirus de OPCS uttrykke et høyt nivå av proteinet av interesse. Disse OPCs kan da bli seedet på DRG nevroner kulturer og effekten at uttrykketav høye nivåer av det ønskede protein utøver på myelinisering kan bli avlest. Co-kulturer vurderes for myelin protein uttrykk ved western blot analyse og visualisert for dannelsen myelinerte aksonale segmenter av immunocytokjemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr som brukes i denne studien var av blandet sex og avlet på Animal utstyr av Institutt for anatomi og patologi og The Florey Institute of Neuroscience og Mental Health Research ved University of Melbourne. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av dyreforsøk etiske komiteer ved University of Melbourne.
1. Kloning av 2K7 Lentivector
- Før kloning av genet av interesse inn i 2K7 lentiviral vektor, subklone genet inn i pENTR vektoren (3637 bp, kanamycin resistent) ved anvendelse av standard molekylære teknikker 11. Bruk EcoRI- og SacII restriksjonssetene for subkloningen.
- Forsterkning av den 2K7 Lentivector
- Transform 2K7 lentivector DNA ved forsiktig å blande 100 ng av plasmid-DNA med kompetente celler og inkubert på is i 30 min.
- Varmesjokk DNA / kompetente celler blandes ved 42 ° C i 90 sek og plate dem på LB-agarplater inneholdende både ampicillin (100 ug / ml) og kloramfenikol (15 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer.
MERK: Kloramfenikol brukes for å hindre rekombinasjon mellom de lange terminale gjentagelser. - Den neste dag, vokser valgte bakterielle kloner i LB-medium inneholdende både ampicillin (100 ug / ml) og kloramfenikol (15 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer. Pakk DNA ved hjelp av en kommersiell plasmid DNA Maxiprep kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sub-kloning fra pENTR vektor til 2K7 Lentivector (figur 1)
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av Gateway rekombinasjon fremgangsmåte for genet av interesse, her representert som Flag-ERK1, blir klonet inn i pENTR L1-L2-vektoren. Dette tilsettes til pENTR L4-R1 vektor inneholdende CMV-promoteren og ryggraden 2K7 vektor. Disse tre vektorer blir rekombinert ved LR Clonase II Plus enzymetsette inn genet-of-interesse og arrangøren inn i virus-klar 2K7 vektor.- Legg følgende til et 1,5 ml rør og bland forsiktig:
L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promoter) (60 bng) 1-2,5 ul
L1-L2 pENTR4IRES2GFP (med genet av interesse) (80 bng) 1-2,5 ul
K7 lentivector (80 ng / mL) 1 mL
TE-buffer, pH 82-5 ul
Totalt 8 pl - Fjern clonase enzymblandingen fra -80 ° C og tines på is i 2 min. Sørge for at dette enzymet er en frisk porsjon fra -80 ° C som enzymet er vesentlig redusert kloningseffektiviteten med gjentatte fryse-tine-sykluser
- Tilsett 2 pl av enzym per reaksjon og bland godt via virvelen, og inkuber clonase reaksjonsblandingen ved 23-25 ° C i 6-24 timer.
- Tilsett 1 ul proteinase K-løsning (levert med settet enzym) til clonase reaksjonsblandingen og inkuberes i 10 min ved 37 ° C.
- Forvandle clonase reaksjonsblandingen i kompetente celler og vokse selectkolonier på LB-medium inneholdende ampicillin (100 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer.
- Trekke ut og rense DNA ved hjelp av en kommersiell plasmid DNA Miniprep kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bekrefte DNA via spaltning ved hjelp av restriksjonsenzymene Spe I og Sac II og en passende buffer i henhold til produsentens instruksjoner for å fjerne fragmentet som inneholdt promoteren og genet av interesse.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å sjekke om subklonet DNA har riktig innsats genet av interesse med riktig vektor ryggrad. Størrelsen av vektoren i seg selv uten innsatte fragmentet er 6,7 kb. Størrelsen av den frigjorte innsatte fragmentet inneholder både promotoren og innsatsen genet av interesse. Beregne de forventede fragment størrelser fra sammendraget for det spesifikke genet via en DNA sekvens redigering program, for eksempel, APE - En Plasmid Editor. - Kontrollere størrelsene av begge DNA-vektor ryggrad og den frigitte fragment ved å kjøre en 1% agarosegeli 1x TAE buffer (se tabell av stamløsninger) på 100 V.
- Amplifisere DNA bekreftet ved å dyrke bakteriene i 500 ml LB-medium inneholdende ampicillin (100 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer.
- Trekke ut og rense DNA ved hjelp av en kommersiell plasmid DNA Maxiprep kit i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Maxiprep genererer vanligvis tilstrekkelig mengde DNA nødvendig for virusproduksjon.
- Legg følgende til et 1,5 ml rør og bland forsiktig:
- Gjenta trinn 1.3.9-1.3.10 å forsterke følgende DNA for lentivirale preparater: Konvolutt vektor (PMD2.G, 6,1 kb), Package vektor (pBR8.91, 12,5 kb), og en tom lentiviral vektor som en kontroll (GFP -CMV-2K7, 8.7 kb).
2. 2K7 Virus Produksjon
MERK: Dag 1:
- På dagen for transfeksjon, plate 32 millioner HEK293 T-celler i T175 kolbe som inneholder 25 ml HEK293 T celle media (se tabell av stamløsninger). Alternativt plate 16 millioner celler dagenfør transfeksjon dersom tiden løper stramt på dagen for transfeksjon.
MERK: Transfeksjon kan være like vellykket ved plating celler på dagen for transfeksjon eller dagen før. Enten ved hjelp av de to alternativene, er det kritiske punktet her for å sørge for at cellene bli sittende fast ned på kultur tallerken overflaten før transfeksjon.
MERK: Dag 2: - Transfeksjon
- Før transfeksjon, fortynn DNA til 1 pg / pl i TE-buffer som inneholder 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 i avionisert vann.
- I et 50 ml rør, fremstille en masterblanding (tabell 1) for transfeksjon i T175-kolbe. Legg DNA til forhånds varmet Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og bland godt med vortex, deretter legge steril polyetylenimin (PEI) (se tabell for lagerløsninger) for å unngå for tidlig nedbør.
Tabell 1: Klar transfeksjon mix for 2K7 virus.Vektor trong> Konsentrasjon Volum pMDG.2 1 ug / ul 5 mL pBR8.91 1 ug / ul 15 ul 2K7 vektor med GFP + genet av interesse 1 ug / ul 22 mL Steril polyetylenimin (PEI) 1 g / l 500 mL DMEM 2100 mL - Bland godt ved å snu røret 3-4x og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
- Utfør en full media endring på HEK293T celler. Aspirer av kultur media fra cellene helt og amme med forvarmet HEK293T cellekultur media (25 ml per T175 kolbe).
- Tilsett transfeksjon blanding (DNA / PEI-blanding) dråpevis til monolagsceller. Beveg forsiktig for å blande godt og inkuber transfekterte celler ved 37 ° C, 5% CO2 over natten.
MERK: Dag 3: - For å sikre at transfeksjon er vellykket, kontrollerer GFP ekspresjon 24 timer etter transfeksjon via et fluorescerende mikroskop.
MERK: Over 50% av celler som uttrykker GFP vanligvis indikerer en god transfeksjon.
MERK: Dag 4: - På 48 timer etter transfeksjon, samle viral supernatanten og erstatte med ferske HEK293 T medier (25 ml per T175 kolbe).
- Sentrifuger viral supernatant ved 1140 xg i 10 min ved 4 ° C for å fjerne celleavfall opp fra supernatanten. Transfer ryddet supernatanten til 50 ml tube og oppbevares ved 4 ° C.
MERK: Dag 5:
- Sentrifuger viral supernatant ved 1140 xg i 10 min ved 4 ° C for å fjerne celleavfall opp fra supernatanten. Transfer ryddet supernatanten til 50 ml tube og oppbevares ved 4 ° C.
- Ved 72 timer etter transfeksjon, samler den andre parti av viral supernatant. Gjenta trinn 2.3.1 og basseng 48 og 72 timer ryddet Supernatantene.
- Å konsentrere viruset, sentrifuger virale supernatanten ved 170.000 xg i 90 min ved 4 ° C ved anvendelse av 30 ml ultrasentrifuge-rør.
- Kast supernatanten og gjenta trinn 2.6 inntil alt erte supernatant ble sentrifugert og etterlot en (usynlig) pellet av virus pluss utfelt PEI i bunnen av røret.
- Å suspendere virus, tilsett 500 mL SATO media (se tabell for lagerløsninger) til ultrasentrifugerør rør. Vortex for 30 sek etnd skrape bunnen av røret med en pipettespiss for mekanisk å løsne viruset. Gjenta dette trinnet 6x for å miste viral pellet.
- Bassenget på resuspendert viruset inn mikrosentrifugerør og spinne svært kort for å fjerne uløselig PEI. Filtrere supernatanten gjennom et 0,45 um filter for å fjerne proteiner.
- Alikvoter viruset i 20 ul, 50 ul og 100 pl aliquoter og oppbevar ved -80 ° C.
3. Viral Titer Bestemmelse i HEK293T Cells
- For å kontrollere ekspresjon av proteinet av interesse, og for å bestemme den optimale konsentrasjonen for viral eksperimenter, tilsett en serie av seriefortynninger av viral lager (for eksempel, 0, 5, 10, 20, 40, 80 mL) for å transdusere HEK293 T-celler sådd ut i 6-brønners plater, og kulturen i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Denne protokollen typisk genererer virus som kan anvendes i konsentrasjoner som varierer fra 1:50 til 1: 200 som oppnår robust ekspresjon av genet avinteresse.
- 48 timer etter viral transduksjon, lyse HEK293T celler i TNE buffer (se tabell på lager løsning) med proteasehemmere.
- Rens brønnene to ganger med DPBS og deretter kjølt legg 150 pl TNE-buffer i hver brønn.
- Lyses celler ved å pipettere opp og ned 5-10x. Overfør hele cellelysater til 1,5 ml mikrosentrifugerør og inkuber på is i 15-30 min.
- Sentrifuger lysatene ved 4 ° C i 30 minutter ved maksimal hastighet (20.000 x g), og overføring fjernet supernatanten til et nytt rør for proteinbestemmelse ved Bradford og påfølgende Western blot-analyse.
- Bestemme nivået av ekspresjon av proteinet av interesse ved standard Western blot-analyse under sentret for antistoffer mot proteinet i seg selv, og det sammensmeltede tag (dvs. flagg). Bruk viral fortynning som gir> 95% GFP + celler og robust ekspresjon av proteinet av interesse for eksperimenter.
4. Isolasjon og kultur av DRG (Figur 2 trinn 1 & 2)
Fig. 2: Skjematisk fremstilling av in vitro-assay myelinisering DRG-neuroner blir dissekert fra P2-3 rotteunger, deretter renset og dyrket over to uker (1-2). OPCS blir renset fra P7-9 rottehjerner ved hjelp immunopanning (3). OPCS blir deretter infisert med lentivirus og dyrket i 48 timer (4). OPCs blir deretter sådd ut på DRG, og eventuelle vekstfaktorer av interesse som BDNF er lagt til (5). Ko-kulturer blir deretter dyrket i 2 uker for å tillate OPCS å differensiere og myelinate aksonene (6). Endelig er co-kulturer enten lysert for western blotting eller fast for immunocytokjemi (7).MERK: Dag 1- 2 dager før disseksjon:
<ol> - Coat autoklavert 22 mm x 22 mm dekkglass med poly-L-ornitin (0,5 mg / ml) i en 6-brønns plate og inkuberes ved 37 ° C over natten.
- På neste dag, frakk Dekk igjen med Laminin (20 mikrogram / ml i MEM) ved 37 ° C over natten, aspirer av overflødig og tørke i 20 minutter i vevskultur hette.
MERK: Dag 2: Dissection og isolering av DRG: - Offer P2-P3 rotteunger 12x av livmorhalstran.
- Fjerne huden overliggende muskel fra ryggen av dyret. Bruk Vännäs saks for å åpne ryggvirvel foramen og bruke pinsett for å forsiktig øse ut ryggmargen.
- Nappe ut DRG som ligger i mellom ryggvirvel kolonner og avskåret festet spinalnervefibre, og deretter plassere DRG i en 33 mm petriskål som inneholder 3 ml L-15 media. Det er vanligvis mulig å samle mellom 8 og 12 DRG fra hver side av ryggmargen
- Overfør oppsamlet DRG sammen med L-15 mediet i et 15 ml rør, sentrifuger ved 180 xg i 5 min.
- Aspirersupernatanten, tilsett 2 ml 0,25% trypsin i DRG pellets og inkuber ved 37 ° C i 30 min.
- Tilsett 5 ml av M1-medium (se tabell over stamløsning) til den DRG-pellets for å stoppe trypsin, og sentrifuger ved 180 x g i 3 min ved RT.
- Aspirer supernatant, re-suspendere pellet i 2 ml forvarmet M1 medium (ikke med vekstfaktorer). Triturer ganglia pellet ved pipettering 50x eller til gangliene er spredt. Sentrifuger cellesuspensjon ved 180 x g i 3 min.
- Resuspender neuroner dissosiert i M1 medier og plate ned i en 6-brønners plate ved 5 ganglia pr 100 ul per brønn.
- Å fjerne voksende ikke-nevronale celler, etter minimum 4 timers inkubasjon å lette vedlegg, fjerne M1 media og mate nevroner med M2 media (se tabell på lager løsning). Kultur DRG-neuroner i nærvær av NGF (100 ng / ml) for å rense en kultur av NGF-avhengige trkA-uttrykkende DRG. Alternativt kan du bruke BDNF (100 ng / ml) for å rense BDNF-avhengige TrkB-expressynge DRG.
- Vedlikeholde nevroner i M1 media (+ NGF eller BDNF på 100 ng / ml) alternerer med antimitotisk M2 media for to uker som nedenfor.
- Opprettholde mellom M1 (+ NGF eller BDNF ved 100 ng / ml) på dag: 4-6, 8-10, 12-14 og M2 medium (+ NGF eller BDNF ved 100 ng / ml) med FDU og uridin på dagene 1 til 4, 6-8, og 10-12. Et minimum av tre sykluser av M2 medier rensing er nødvendig.
- Vedlikeholde DRG i M1 alene for en ytterligere uke etter endt 2 ukers antimitotisk syklus. Endre M1 media hver 2-3 dager.
5. Isolasjon og kultur av OPCs (figur 2 trinn 3)
MERK: Dag 1- 2 dager før disseksjon:
- Coat 10 cm vevskulturplater med Poly-D-lysin (PDL, 10 ug / ml i sterilisert avionisert vann) ved 4 ° C over natten.
MERK: Dag 2: 1 dag før disseksjon: - Vask PDL plater med sterilisert avionisert vann for 3x. La det tørke for ~ 6 timer i vevskultur hette. Hvis ikke blir brukt en gang, pakk og butikkfor inntil 4 uker ved 4 ° C.
- Forberede sekundære antistoff plater for immunopanning. For en hjerne disseksjon, forberede 2x IgG-plater (for Ran2 antistoff for å fjerne astrocytter og O1-antistoff for å fjerne premyelinating oligodendrocytter), med 45 pl geit α mus IgG i DPBS (15 ml) per 10 cm petriskål; 1x IgM plate for (O4 antistoff for valg oligodendrocytt forløperceller), 45 pl geit α mus IgM i DPBS (15 ml) per 10 cm petriskål.
MERK: Dag 3: dag av disseksjon: - Tilsett 200 enheter av papain i 10 ml papain buffer (tabell 2), og varme opp ved 37 ° C inntil bufferen blir klart.
Tabell 2: Fremstilling av papain-buffer.Konsentrasjon for 250 ml Sluttkonsentrasjon EBSS lager 10x 25 ml 1x MgSO4 100 mM 2,5 ml 1 mm Glukose 30% 3 ml 0.46% EGTA 0,5 M 1 ml 2 mm NaHCO3 1 M 6,5 ml 26 mm Bringe volumet opp til 250 ml med avionisert vann og filtersteriliser - Vaske alle sekundære antistoff plater med DPBS for 3x.
- Hell Ran2 og O1 antistoff mot IgG-plater, og O4 hybridom IgM plate. Inkuber alle disse primære antistoff platene i over 2 timer ved RT.
- Dissekere en hjerne fra en P7 rotte. Halshogge en valp med skjerpet saks og fjerne huden overliggende skallen med saks.
- Skjær rundt skallen fra bakhodelappen, tinninglappen og til frontallappen. Fjerne hjernen fra skallen ved hjelp av en pinsett og forsiktig overføre det til en 35-mm petriskål med 1 ml DPBS.
- Terninger hjernen i små biter omtrent med saks eller sterilt blad.
- Filter forvarmes papain-buffer (10 ml) inn i en ny 15 ml rør inneholdende noen få korn av L-cystein, og deretter tilsettes 200 pl DNAase (12 500 U / ml) til den filtrerte papain buffer.
- Hell papain buffer på terninger hjernevev; Inkuber ved 37 ° C i 90 min.
- Gentlly overføring dissosiert hjernevev i 50 ml tube ved hjelp av en 25 ml pipette ogtillate å bosette seg.
- Fjern papain buffer, tilsett 2 ml Lo Ovo (Ovomucoid) til hjernen vev og titurate 5-10x ved pipettering å bryte opp biter av hjernevev, tillate å bosette og fjerne toppen 2 ml av supernatanten til et nytt rør.
- Legg til en annen 2 ml Lo Ovo til hjernen vev og gjenta trinn 5.11 til ingen biter av vev forbli. Tituration kan få stadig mer aggressiv.
- Sentrifuger dissosierte cellesuspensjonen i 15 min ved 200 x g. Aspirer av supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml Hi Ovo og sentrifuger i 15 minutter ved 200 x g.
- Vask først immunopanning plate (Ran 2 plate) med DPBS for 3x. Aspirer supernatant, resuspender celler i 10 ml panorering buffer (tabell 2) og hell på den første immunopanning plate (Ran 2 plate). Inkuber cellene i 15 min ved RT.
- Vask andre immunopanning plate (O1 plate) med DPBS for 3x.
- Etter inkubering i første immunopanning plate, vippes cellesuspensjon på annenimmunopanning plate (O1-plate), Skyll alle løse celler fra overflaten av platen med 1-3 ml panorering buffer og overføring ved hjelp av pipette til O1 plate. Inkuber cellene i 15 min ved RT.
- Vask tredje immunopanning plate (O4 plate). Denne plate er den positive seleksjonsplate hvor OPCS binde overflaten. Vask O4 plate med DPBS for 3x.
- Etter inkubering i andre immunopanning plate, overføre celler til den endelige immunopanning platen (O4 plate), inkuberes cellene i 45 minutter ved RT. Dette trinnet vil velge O4 + OPCs.
- Aspirere supernatanten fra den siste immunopanning platen (O4 plate) og skylles platen med EBSS for 6x.
- For å fjerne OPCS av platen, inkuberes cellene med 5 ml varm 0,05% Trypsin-EDTA fortynnet 1:10 med EBSS ved 37 ° C i 8 min.
- Tilsett 5 ml av 30% FBS (laget i EBSS) for å nøytralisere trypsin. Fjerne celler utenfor overflaten av platen ved pipettering for omtrent 50x.
- Overføre all cellesuspensjonen til et nytt rør og sentrifuger i 15 minutter ved 200 x g.
- Kast supernatant og resuspender cellepelleten i 1 ml forvarmet SATO media, etterfulgt av celletelling. Disseksjon av en hjerne kan gi 1,5 til 2.000.000 OPCs.
- Plate-celler på tørre PDL belagte plater ved en tetthet på mellom 1 x 10 5 x 10 og 5 5 per 10 cm plate med i SATO medier (10 ml) som inneholder ciliær neurotrofisk faktor (CNTF, 10 ng / ml), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF, 10 ng / ml), neurotrofin 3 (NT3, 1 ng / ml), og forskolin (4,2 ug / ml) 2,12. Kultur OPCs ved 37 ° C, 8% CO 2.
6. transducing OPCs
- Kultur primære OPCS i SATO media (10 ml / 10 cm plate) med CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml), og forskolin (4,2 ug / ml) ved 37 ° C, 8% CO2 i 24 timer etter disseksjon.
- Aspirer av OPC kultur media, fôr celler med nystekte SATO media (10 ml) Med vekstfaktorer (se ovenfor i trinn 6.1).
- Legg virus til OPCS til den optimale konsentrasjonen bestemt ved trinn 3 (figur 2, trinn 4), kultur OPCS i ytterligere 48 timer.
7. OPC Seeding for myelinerende Co-kulturer (Figur 2, trinn 5 og 6)
- For å fjerne OPCS av overflaten, og første skylle OPC-plater med 8 ml EBSS to ganger, deretter inkuberes cellene med 5 ml varm 0,05% Trypsin-EDTA fortynnet 1:10 med EBSS ved 37 ° C i 2 min.
- Nøytralisere trypsin med 30% FBS i EBSS (5 ml) og fjerne cellene fra platen ved pipettering. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør, sentrifuger ved 180 xg i 15 min ved RT.
- Aspirer av supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml forvarmet SATO mediefulgt av celletall.
- Før OPC seeding, helt aspirer media fra DRG kultur plate. Forsiktig frø 200.000 OPCs slippe klok videre til DRG nevroner som tidligere beskrevet 4-6.
MERK:Den totale OPC seeding volumet må være mindre enn 200 mikroliter per 22 mm dekkglass. - La cellene til å bosette uten å flytte platen i 10 min i panseret vev kultur, deretter forsiktig fylle opp med en ml forvarmet SATO media per brønn.
- Replate de restersøster OPCs med SATO media med vekstfaktorer (se trinn 6.1). Bruk disse søster OPCs å verifisere uttrykk av proteinet av interesse.
- Etter 24 timer erstatte SATO media med co-kultur media (2 ml / brønn) inneholder SATO media (ingen faktorer) og Neurobasal (v / v) med 1% B27. Opprettholde co-kulturer for 14 dager med media endring hver 2-3 dager.
- Vurdere co-kulturer for myelin protein uttrykk ved western blot analyse og visualisere for dannelsen myelinerte aksonale segmenter ved å dobbelt farging med antistoffer mot myelingrunnprotein markører og nevronale markører 4-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den merket flagg-ekstracellulære signalrelaterte kinase 1 (Flag-ERK1) konstruere brukes for lentivirus produksjon er bekreftet ved restriksjonsenzym fordøye av konstruksjonene brukes, inkludert både 2K7 konstruerer og emballasje og tilbehør konstruerer kreves for virusproduksjon (figur 3) .
Figur 3: DNA-konstruksjon verifisering. Alle DNA-konstruksjoner som kreves for lentivirus produksjon ble renset fra Stbl3 bakterier og verifisert ved restriksjonsenzym fordøye. Tilbehørs og emballasje vektorer ble spaltet med Ncol og EcoRI, som angitt, og sammenlignet med ukuttet plasmid (A). 2K7-GFP ble fordøyd med Spel og SacII (A). 2K7-Flag-ERK1 DNA ble verifisert ved kutting med enten Spel eller SacII alene, eller ved dobbelt fordøyd stykke (B). Båndmønstrene varsammenlignet med forventede mønstre generert fra virtuell fordøyelse av konstruere sekvenser bruker ApE programvare.
Å bestemme optimal fortynning til bruk på OPCs ble Erk en lentivirus titreres i HEK293T celler (figur 4). Dette ble gjort ved å tilsette en rekke virale fortynninger til HEK293T celler (figurene 4A, 4C og 4D) eller til OPCS (figur 4b). Uttrykk nivåer av genet interesseøkning med tid (Figur 4D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Titrering av Flag-ERK1 virus i HEK293T celler og OPCs. Flagg-ERK1 viruset ble titrert i HEK293T celler (A, C, D) eller OPCs (B). HEK293T celler (A) eller (B) OPCS ble fotografert for GFP ekspresjon 48 timer etter infeksjon med Flag-ERK1 virus. HEK293T cellelysatene ble undersøkt for tilstedeværelse av ERK1 eller total ERK1 / 2 etter 48 timer for infeksjon (C). HEK293T cellelysatene ble undersøkt for tilstedeværelse av flagg, ERK1 / 2 og aktin som en lastekontroll, enten 48 timer eller 96 timer etter infeksjon med Flag-ERK1 virus (D). Disse blots ble alle blottet og avbildes sammen for å legge til rette for direkte sammenligning av ekspresjonsnivåene ved de to tidspunkter (D). Målestokk for (A) = 100 mikrometer. Målestokk for (B) = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Så snart den optimale fortynning viruset er blitt bestemt, ble det rensede OPCS infisert og dyrket i minst 48 timer for å tillate at transgene ekspresjon for å nå sufficient nivåer, deretter sådd ut på DRG nevroner for å vurdere deres myelination potensial (figur 5). Når sådd ut på DRG nevroner, vil OPCs differensieres til oligodendrocytter, og begynne å uttrykke myelinproteiner, som kan vurderes av western blotting (figur 5C). Noen modne oligodendrocytter vil myelinate, og dette kan synliggjøres ved MBP-farging (figur 5D). Aksoner må også være farget med en markør som neurofilament eller SIII-tubulin (figur 5D) for å sikre axon tetthet er tatt hensyn til når analysere myelination nivåer.
Figur 5: OPCs ble infisert med Flag-ERK1 virus i 48 timer før såing på DRG nevroner. Søster OPCs ble enten fast og farget for Flag og GFP (A) eller lysert og undersøkt for Flag og ERK1 å verifisereekspresjon av virusoveruttrykt protein (C). Co-kulturer ble løst etter to uker i kultur og farget for SIII-tubulin og MBP å visualisere DRG axoner og myelinerende så vel som ikke-myelinerende oligodendrocytter (B). En myelinerende oligodendrocyte indikeres med pil og en ikke-myelinerende oligodendrocyte er indikert med pil-head (B). Parallelle ko-kulturer ble lysert og undersøkt for myelinproteiner MBP og MAG, i tillegg til flagget og ERK1 / 2 for å bekrefte transgen ekspresjon i ko-kultur (D). En økning i ERK1 nivåer var ikke synlig i ko-kulturen på grunn av de store mengder av DRG-avledet ERK1 stede i lysater Skala bar = 20 mikrometer.
| Navn | Ingredienser | Notater |
| TE-buffer pH 8 | 10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA pH 8 | Utgjør i avionisert vann. |
| Polyetylenimin (PEI) | 1 g / l | Utgjør i avionisert vann, filtrer-sterilisere og store bestandene ved -20 ° C. |
| LB Medium | 20 g Tryptone 10 g Gjærekstrakt 10 g NaCl | Fyll opp til 2 liter med avionisert vann |
| 50% Glyserol lager | Glyserol | Fyll opp med et like stort volum av deionisert vann og autoklaven |
| HEK 293 T-celle medium | DMEM 10% føtalt bovint serum 1% Penicillin / streptomycin 1% L-glutamin | |
| TNE lysisbuffer | 10 mM Tris pH 8 150 mM NaCl 1 mM EDTA pH 8 1% NP40 | Oppløs NP40 i et mindre volum av deionisert vann først som det vil krystallisere ved kontakt med vann. Fyll opp til sluttvolum i avionisert vann |
| M1 | MEM 10% føtalt bovint serum 0,4% D-glukose 2 nM L-glutamat 1% Penicillin / streptomycin | For bruk med rotte DRG nevroner |
| MM1 | Neurobasal medium 2% B27 (SM1) supplement 0,4% D-glukose 2 nM L-glutamat 1% Penicillin / streptomycin | For bruk med mus DRG nevroner |
| M2 | DMEM 10 mg / l Transferrin 5 mg / l insulin 20 nM Progesteron 100 mikrometer putrescin 10 mm FDU 10 mm Uridine | Sminke M2 i et større volum DMEM uten FDU og uridin for bruk over 1-2 måneder. Legg FDU og uridin til mindre volumer som kan være ferdig i løpet av to uker |
| mm2 | MM1 10 mm FDU 10 mm Uridine | Legg FDU og uridin til mindre mengder medium som kan være ferdig i løpet av to uker. |
| 10x MT-PBS pH 7,4 | 28.48 g / L (160 mm) Na 2 HPO 4 · 2H 2 O 5,52 g / l (40 mM) NaH 2PO 4 · H 2 O 87,66 g / L (1,5 M) NaCl | Legg til avionisert vann og justere pH til 7,4 med 10 N NaOH |
| 1x MT-PBS | 10x MT-PBS Deionisert vann | Fortynn 10x MT-PBS 1:10 i avionisert vann for å lage 1x MT-PBS |
| 10x Borate buffer (1,5 M) | 18.55 g Borsyre 1x MT-PBS | Oppløse borsyre i 150 ml 1x MT-PBS. Juster til pH 8,56 med 10 N NaOH og bringe sluttvolumet til 200 ml med 1x MT-PBS. Autoklav |
| 1x boratbuffer (0,15 M) | 10x Borate buffer 1x MT-PBS | Forbered 100 ml av denne buffer for å oppløse PLN i. Tilsett 10 ml 10x boratbuffer (pH 8.56) til 90 ml av 1 x PBS MT- |
| 0,5 mg / ml Poly-L-ornitin (PLN) | 50mg Poly-L-ornitin Hydrobromide 0,15 M boratbuffer (pH 8.56) | Oppløs 50 mg av poly-L-ornitin-hydrobromid i 100 ml 1x boratbuffer. Filter sterilisere (0,22 mikrometer filter) og oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned |
| 100x Poly-D-lysin (PDL) | 5 mg poly-L-lysin Sterilt, avionisert vann | 100x PDL aksjer kan fryses ved -20 ° C i engangs tilsetningene. Ved bruk, fortynne til 1x i sterile, deionisert vann |
| Papain buffer | Se tabell 2 | |
| DNase | 12.500 U DNase 1 ml EBSS | På is, oppløse DNase I i 1 ml kjølt EBSS. Alikvoter (f.eks, 300 ul / rør) og fryse over natten ved -20 ° C. Lagre ved -20 ° C. |
| 4% BSA | 8 g BSA 200 ml DPBS | Oppløs BSA i 150 ml DPBS ved 37 ° C. Justere pH til 7.4 med ~1 ml av 1 N NaOH. Bringe volumet til 200 ml. Filtrer gjennom et 0,22 um filter for å sterilisere. Gjør en ml porsjoner og butikk ved -20 ° C. |
| 10x Lo Ovomucoid | 3 g BSA 200 ml DPBS 3 g trypsininhibitor | Legg BSA til 150 ml DPBS og bland godt. Legg trypsininhibitor og bland for å oppløse. Legg ~ 1 ml 1N NaOH for å justere pH til 7,4. Bringe volumet til 200 ml med DPBS. Filter-sterilisere gjennom et 0,22 mikrometer filter. Gjør en ml porsjoner og butikk ved -20 ° C. |
| 6x Hi Ovomucoid | 6 g BSA 200 ml DPBS 6 g trypsininhibitor | Legg BSA til 150 ml DPBS og bland godt. Legg trypsininhibitor og bland for å oppløse. Legg ~ 1 ml 1N NaOH for å justere pH til 7,4. Bringe volumet til 200 ml med DPBS. Filter-sterilisere gjennom et 0,22 mikrometer filter. Lage en m porsjoner og butikk ved -20 ° C. |
| SATO basen | Se Tabell 3 | |
| SATO media (rotte) | 1% SATO basen 1% Penicillin / streptomycin 1% 0,5 mg / ml Insulin 1% L-Glutamin 0,1% NAC 0,1% Biotin Gjøre opp med DMEM og filter sterilisere. | |
| SATO media (mus) | 1% SATO basen 1% 0,5 mg / ml insulin 1% Penicillin / streptomycin 1% L-Glutamin 0,1% NAC 0,1% Biotin 0,1% Trace Elements B 2% B27 Gjøre opp med DMEM og filter sterilisere. | |
| Insulin | 10 mg Insulin 20 ml Sterilt deionzed vann | Legg insulin til deionisert vann og tilsett 100 ul av 1 N HCI for å tillate den å oppløse insulinet. Bland godt. Filtrer gjennom et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C i 4-6 uker |
| NAC (N-Acetyl-L-cystein) | 5 mg / ml NAC DMEM | Oppløs NAC i DMEM for å lage en 5 mg/ Ml oppløsning, delmengde og oppbevar ved -20 ° C. |
| d-Biotin | 50 ug / ml biotin Sterilt, avionisert vann | Oppløs biotin i vann for å lage en 50 ug / ml, porsjon og oppbevar ved -20 ° C. |
| CNTF (ciliær neurotrofisk faktor) | 10 ug / ml CNTF 0,2% BSA i DPBS | Fortynn CNTF for å lage en 10 ug / ml oppløsning i sterilt 0,2% BSA i DPBS. Delmengde, flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. |
| PDGF (blodplate-avledet vekstfaktor) | 10 ug / ml PDGF 0,2% BSA i DPBS | Fortynne PDGF mester lager (utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner) til 10 mikrogram / ml med steril 0,2% BSA i DPBS. Delmengde, flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. |
| NT3 (Neurotrofin-3) | 1 ug / ml NT-3 0,2% BSA i DPBS | Fortynne NT3 mester stock (utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner) til en mikrogram / ml med steril 0,2% BSA i DPBS. Delmengde, flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. |
| Forskolin | 50 mg Forskolin Steril DMSO | Tilsett 1 ml sterilt DMSO til 50 mg flaske med forskolin og blandes godt for å resuspendere fullt. Overfør til 15 ml rør og tilsett 11 ml sterilt DMSO for å oppnå en konsentrasjon på 4,2 mg / ml. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C. |
Tabell 3. Aksje løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelinisering av aksoner er en viktig prosess for optimal funksjon av både det sentrale og perifere nervesystem hos virveldyr. Genereringen og vedlikeholdet av myelinerte aksoner er en kompleks og koordinert prosess som omfatter molekylære interaksjoner mellom neuronal, glial (fra Schwann celler eller oligodendrocytter) og ekstra cellulære matriksproteiner. Betydningen og anvendelsen av denne protokollen er at den tillater manipulering av proteiner i en bestemt celletype innenfor de blandede innstillinger co-kultur. Som flere celletyper som er involvert i myelinisering både in vivo og i in vitro myelinisering assay, med butte farmakologiske verktøy for å blokkere aktiviteten av spesielle proteiner eller signalveier kan gi spesifikk informasjon om den innflytelse som proteiner utøver ved myelinisering fra enten en neuronal eller glial perspektiv, med mindre protein er unikt uttrykt av en celletype. Således vil in vitro myelinisering såsi i forbindelse med bruk av Lentivirus å spesifikt transduce OPCs tillater oss å avhøre de effekter som oligodendroglial proteiner øve på myelination. Vi har med hell brukt 2K7 Lentivirus til overuttrykke spesielle proteiner spesielt i oligodendrocytter for in vitro myelination analysen for å dissekere den effekten at oligodendroglial signaler øve på CNS myelination 9.
For å oppnå reproduserbare resultater i transdusert OPC in vitro myelinisering assay blir optimalisering kreves for hvert trinn i protokollen fra kloning gjennom dissections og OPC såing. Det er viktig at, på nivået av DNA, er pENTR vektor inneholdende det merkede genet av interesse konstruere sekvensert og at 2K7 DNA med den kodede gen av interesse blir undersøkt ved western blot for ekspresjon av merkelappen og genet av interesse, før bruk av DNA for å generere virus. Det er viktig å velge enten HEK293Tcells eller HEK293FT-celler for å generere virus og vokse under mycoplasma fritt miljø. Etter fremstilling av lentivirus er det viktig å titrere hvert parti av virus til å bestemme den optimale fortynning for bruk på OPCS. Dette kan gjøres ved å tilsette en rekke virale fortynninger til HEK293T celler eller OPCS. Som 2K7 konstrukt inneholder både genet interesse og GFP, kan effekten av transduksjon vurderes ved ekspresjon av GFP ved fluorescens mikroskopi og ved å analysere ekspresjon av merkelappen og genet av interesse ved western blot-analyse. Lysere GFP + celler vil bli synlig med høyere viruskonsentrasjon, ettersom det er mulig for flere viruspartikler for å infisere en enkelt celle. Verifisering av ekspresjonen av GFP via fluorescens mikroskopi er en nyttig indikator for titer av viruset og ekspresjon av GFP, men kan ikke brukes som et surrogat for å kontrollere ekspresjon av proteinet av interesse. Det er derfor avgjørende å kontrollere ekspresjonsnivået av proteinet av interesse i begge HEK293T celleneog OPCs av western blot analyse. Hvis proteinet av interesse er uttrykt endogent av nevroner i co-kulturer, kan overekspresjon av OPCs / OLS maskeres når analysere co-dyrkingslysatet av western blot; derfor er det viktig å enten tagge proteinet av interesse eller kultur søster OPCs følgende seeding så uttrykk av proteinet av interesse kan verifiseres i søster OPCs om ikke i co-kultur.
Kvaliteten på både DRG og OPC kultur bestemmer direkte hvis forsøkene lykkes. I coculture innstillinger, kan rotte DRG nevroner bli cocultured med OPCs avledet fra enten rotte eller mus. OPCs krever skånsom og rask håndtering. Det er viktig å optimalisere virustiter for OPCS som for lite unnlater å effektivt transduce de OPCS fører til lave nivåer av ekspresjon av proteinet av interesse, og for mye virus er giftig for OPCS slik at det er for få celler til frøet på neuronene. Begge disse sub optimale transductions kan Result i unanalyzable eller ubetydelige endringer i myelination eller myelin protein uttrykk. OPCs skille hvis de blir over konfluent og kan ikke bli seedet etter at de har differensiert, og dermed antall OPCs dyrkede og transduserte behov for å være optimalisert til lokale forhold. Det er ønskelig å frø samme antall OPCS for hver myelinisering analysen tillater direkte sammenligning av antallet myelinerte aksonal segmenter som skal sammenlignes mellom forhold over flere eksperimenter.
En potensiell begrensning ved denne teknikk er variasjonen i basal myelinisering nivåer mellom myelinisering analyser. Etter viral transduksjon, er det basale nivået av myelinisering redusert, noe som tyder på at virusinfiserte OPCS ikke myelinate samt naive (ikke-viral infeksjon) OPCS. Dette kan overvinnes ved å kvantifisere graden av myelinisering i forhold til basal myelinisering i hver analyse. Således må den tomme vektoren som uttrykker GFP bare brukes som en intern kontrol. I tillegg til myelinisering, kan ekspresjon av et protein av interesse også påvirke andre aspekter av OPCS som overlevelse, formering og differensiering, som fører til en indirekte virkning på myelinisering. Derfor bør analyse av OPC adferd som celleviabilitet foretas i parallell for å myelinisering assays.
De virale overføringsmetoder som er beskrevet her er ikke begrenset til studiet av oligodendrocytt myelinisering; faktisk kan det generaliseres og anvendt for å studere andre celletyper slik som Schwann-celler, astrocytter og neuroner, mens optimaliseringen kan være nødvendig for enkelte celletype. Denne protokollen gir stor fleksibilitet for å studere oppførselen celle som proliferasjon og differensiering ved selektiv overekspresjon av et protein av interesse (villtype eller mutant) i den ønskede celletype, som har spesielle fordeler ved bruk av en blandet cellekultursystem. Cellene som brukes for transduksjon kan isoleres fra enten rotte ellermus (villtype eller transgen), og dermed muliggjør en målrettet undersøkelse av signal og kompensasjonsmekanismer i transgene dyr, som vanligvis er vanskelig å oppnå, og mye mer tidkrevende enn ved bruk av en in vivo-transgen musemodell. Nyere bevis tyder på at lentiviral-basert strategi har blitt brukt for celle transduksjon i dyremodeller 13, noe som tyder på et stort potensial for transducing oligodendroglial celler ved hjelp av lentiviral tilnærminger i vivo.
Som konklusjon, som kombinerer in vitro-analysen med myelinisering Lentiviral infeksjon av OPCS gir et strategisk verktøy for analyse av molekylære mekanismer som er involvert i myelinisering. Rollen av spesifikke proteiner i myelinisering kan utspørres og som OPCS kan bli isolert fra rotter og mus for bruk på rotte DRG ko-kulturer kan lentiviral tilnærming også anvendes i kombinasjon med knockout-teknologi av forskjellige muselinjer for å avhøre mechanisms av kompensasjon i prosesser av myelination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody - Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody - Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin-streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
