Abstract
Myelination är en komplex process som involverar både nervceller och myelinet bildar gliaceller, oligodendrocyter i det centrala nervsystemet (CNS) och Schwann celler i det perifera nervsystemet (PNS). Vi använder ett in vitro myelination analys, en etablerad modell för att studera CNS myelination in vitro. För att göra detta, är oligodendrocyt prekursorceller (OPCs) läggs till de renade primära gnagare dorsalrotganglia (DRG) nervceller att bilda myeliniserande samkulturer. För att specifikt förhöra de roller som särskilda proteiner som uttrycks av oligodendrocyter utövar på myelinisering har vi utvecklat protokoll som selektivt omvandla OPCs använder lentivirus överuttrycker vildtyp, konstitutivt aktiva eller dominanta negativa proteiner innan de sås på DRG nervceller. Detta tillåter oss att specifikt förhöra roller dessa oligodendrogliala proteiner i regleringen myelination. Protokollen kan också tillämpas i studiet av othennes celltyper, som ger därmed en strategi som medger selektiv manipulering av proteiner som uttrycks av en önskad celltyp, såsom oligodendrocyter för riktade studier av signalering och kompensationsmekanismer. Sammanfattningsvis kombinerar myelination analysen in vitro med lentivirala smittade OPCs ger ett strategiskt verktyg för analys av molekylära mekanismer som är involverade i myelinisering.
Introduction
Myelination av axoner är avgörande för snabb och effektiv överföring av aktionspotentialer i både centrala och perifera nervsystemen. Specialiserade celler, Schwann celler i det perifera nervsystemet och oligodendrocyter i centrala nervsystemet, linda runt och ensheathe axoner i myelin, effektivt isolerande nerven och underlättar saltatorisk ledning 1. Processen för myeline kan studeras in vitro med användning retinala ganglieneuroner 2, engineered Nano 3, eller dorsala ganglieneuroner samodlade med antingen Schwann-celler 4 eller oligodendrocyter 5-7. In vitro myelination analysen är en etablerad modell för att studera nervsystemets myelination och det replikerar många av de grundläggande processer som sker under myelinisering in vivo 5-8. Analysen innebär samodling av renade populationer av dorsalrotganglia (DRG) nervceller, med OPCs (för CNS myelination) eller Schwann-celler (för PNS myeline). Under särskilda förhållanden dessa myeliniserande celler ensheathe DRG axoner i beställda, ultra strukturellt verifieras, multi-lamellära ark av isolerande plasmamembran som uttrycker samma komplement av myelin specifika proteiner som finns in vivo.
Det mest använda cellmodell för att studera CNS myeline in vitro är meds kulturer av DRG nervceller och OPCs, som har framgångsrikt använts för att studera effekten att yttre faktorer såsom neurotrofinerna utövar på CNS myelination in vitro 5,6. Exogena faktorer såsom tillväxtfaktorer eller små molekyler farmakologiska hämmare har ofta använts för att studera vilken roll signalvägar i myelinisering använder DRG-OPC coculture modellen 7,9. Men i de blandade samodling inställningar som innehåller både nervceller och oligodendrocyter, förblev det formellt möjligt att antingen tillväxtfaktorer eller den läkegiska hämmare kunde ha utövat effekter på både DRG nervceller och oligodendrocyter (OL). Detta inte erbjuder möjligheten att specifikt dissekera de roller som de proteiner som uttrycks endast av DRG eller oligodendroglia utövar på myelinisering använda denna dubbla cellsystem. Att entydigt bekräfta att signalväg i Oligodendroglial reglerar direkt myelination, lentiviral transduktion av OPCs, före sådd på DRG nervceller för myelination analysen in vitro, har visat sig vara ett elegant sätt att överuttrycker både vildtyp och muterade proteiner, samt som knockdown uttryck av konstitutivt uttryckta proteiner genom oligodendrocyter. Således detta tillvägagångssätt ger en aveny för att specifikt förhöra och manipulera signalvägar inom oligodendrocyter för att studera myelination 9,10.
I detta papper, vi rapporterar metoder som vi har utvecklat för att överuttrycker ett protein av intresse selektivt i oligodendrocyter via en lentiviraltillvägagångssätt för att studera myelination in vitro. Tekniken börjar med genereringen av expressionsvektorer innehållande genen av intresse, vare sig det är i en vild typ, konstitutivt aktiv eller dominant negativ form som sedan klonades därefter in i pENTR vektorn (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Denna vektor (som innehåller genen av intresse), är CMV-promotorn donator (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) och 2K7 lentivector kombineras i en enzymreaktion för att producera en 2K7 vektor innehållande CMV-promotorn, genen av intresse, en intern sajt ribosomal inresa och GFP (Figur 1). Denna Gateway klonade 2K7 konstruktion i kombination med PMD2.G virushöljet och pBR8.91 viruspaketet kan samtransfekteras in HEK293T celler för att generera lentivirus som sedan kan användas för att omvandla OPCs. När smittade med lentivirus de OPCs uttrycker en hög nivå av proteinet av intresse. Dessa OPCs kan sedan sås på DRG neuron kulturer och den effekt som uttrycketav höga nivåer av det önskade proteinet utövar på myelinisering kan förfrågas. De sam-odlingar bedöms med avseende myelinproteinuttryck genom Western blot-analys och visualiseras för bildandet av myeliniserade axonal segment genom immuncytokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djur som används för denna studie var av blandad kön och uppvuxna på Animal Faciliteter för institutionen för anatomi & patologi och The Florey Institutionen för neurovetenskap och mental hälsa forskning vid University of Melbourne. Alla djurförsök har godkänts av djurförsöks etiska kommittéer vid University of Melbourne.
1. Kloning av 2K7 Lentivector
- Innan kloning av genen av intresse in i 2K7 lentivirusvektorn, subklona genen i pENTR vektorn (3637 bp, kanamycinresistenta) med användning av standardmolekylärmetoder 11. Använd EcoRI- och SacII restriktionsställen för subkloning.
- Amplifiering av 2K7 Lentivector
- Omvandla 2K7 lentivector DNA genom att försiktigt blanda 100 ng plasmid-DNA med kompetenta celler och inkubera på is under 30 min.
- Värmechock DNA / kompetenta celler blandas vid 42 ° C under 90 sek och plattan dem på LB-agarplattor innehållande både ampiciLLIN (100 | ig / ml) och kloramfenikol (15 | ig / ml) vid 37 ° C under 16-18 h.
OBS: Kloramfenikol används för att förhindra rekombination mellan de långa terminala upprepningarna. - Nästa dag, växer valda bakteriekloner i LB-medium innehållande både ampicillin (100 | ig / ml) och kloramfenikol (15 | ig / ml) vid 37 ° C under 16-18 h. Extrahera DNA med en kommersiell plasmid DNA Maxiprep kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Sub-kloning från pENTR vektorn till 2K7 Lentivector (Figur 1)
Figur 1:. Schematisk representation av rekombinationsförfarande Gateway Genen av intresse, här representerad som Flag-ERK1, klonas in i pENTR L1-L2-vektorn. Detta läggs till i pENTR L4-R1 vektor innehållande CMV-promotorn och ryggraden 2K7 vektorn. Dessa tre vektorer rekombineras av LR Clonase II Plus enzym tillinfoga genen av intresse och promotorn in viruset färdiga 2K7 vektor.- Lägg till följande i ett 1,5 ml rör och blanda försiktigt:
L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 BNG) 1-2,5 l
L1-L2 pENTR4IRES2GFP (med gen av intresse) (80 BNG) 1-2,5 l
K7 lentivector (80 ng / l) 1 pl
TE-buffert, pH 82-5 il
Totalt 8 pl - Avlägsna CLONASE enzymblandning från -80 ° C och tinas på is under 2 min. Se till att detta enzym är en färsk alikvot från -80 ° C såsom enzymet har väsentligt reducerad kloningseffektiviteten med upprepade frysnings-upptiningscykler
- Tillsätt 2 pl enzym per reaktion och blanda väl via virvel och inkubera CLONASE reaktionsblandningen vid 23-25 ° C under 6-24 timmar.
- Lägg ett pl av proteinas K-lösning (tillhandahållet med enzym kit) till CLONASE reaktionsblandningen och inkubera under 10 minuter vid 37 ° C.
- Omvandla CLONASE reaktionsblandningen i kompetenta celler och växa selectkolonier i LB-medium innehållande ampicillin (100 | ig / ml) vid 37 ° C under 16-18 h.
- Utdrag och rena DNA med en kommersiell plasmid DNA Miniprep kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Bekräfta DNA via nedbrytning med restriktionsenzymerna Spe I och Sac II och en lämplig buffert enligt tillverkarens anvisningar för avlägsnande av fragmentet innehållande promotorn och genen av intresse.
Anmärkning: Detta steg är kritiskt för att kontrollera om det subklonade DNA har den korrekta infogningen genen av intresse med den högra vektorryggraden. Storleken på själva vektorn utan insatta fragmentet är 6,7 kb. Storleken av den frisatta insatta fragmentet innefattar både promotorn och insatsen genen av intresse. Beräkna de förväntade fragmentstorlekarna från digereringen för den specifika genen via en DNA-sekvens redigeringsprogram, t.ex., APE - En plasmid Editor. - Kontrollera storlekar av både DNA-vektorryggraden och det frisatta fragmentet genom att köra en 1% agarosgeli 1x TAE buffert (se tabell av stamlösningar) på 100 V.
- Förstärk den bekräftade DNA genom växande bakterier i 500 ml LB-medium innehållande ampicillin (100 | ig / ml) vid 37 ° C under 16-18 h.
- Utdrag och rena DNA med en kommersiell plasmid DNA Maxiprep kit enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Maxiprep genererar vanligtvis tillräcklig mängd DNA som krävs för viral produktion.
- Lägg till följande i ett 1,5 ml rör och blanda försiktigt:
- Upprepa steg 1.3.9-1.3.10 att amplifiera följande DNA: n för lentivirala preparat: Kuvert vektor (PMD2.G, 6,1 kb), Paket vektor (pBR8.91, 12,5 kb), och en tom lentivirusvektor som en kontroll (GFP -CMV-2K7, 8,7 kb).
2. 2K7 Virus Produktion
OBS: Dag 1:
- På dagen för transfektion, tallrik 32 miljoner HEK293 T-celler i T175 kolv innehållande 25 ml HEK293 T-cellsmedie (se tabellen för lagerlösningar). Alternativt, plattan 16 miljoner celler dagenföre transfektion om tiden går tätt på dagen för transfektion.
OBS: Transfektion kan vara lika framgångsrika genom plätering celler på dagen för transfektion eller före dagen. Använda något av de två alternativen, är den kritiska punkten här för att se till att celler fastnat på odlingsskål ytan före transfektion.
NOTERA: Dag 2: - Transfektion
- Före transfektion, späd DNA till 1 pg / pl i TE-buffert som innehåller 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 i avjoniserat vatten.
- I en 50 ml tub, förbereda en huvudblandning (tabell 1) för transfektion i T175 kolv. Lägg DNA till förvärmda Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) och blanda väl genom virvel, lägg sedan till sterila polyetylenimin (PEI) (se tabellen för lagerlösningar) för att undvika för tidig utfällning.
Tabell 1: Förbereda transfektion mix för 2K7 Virus.Vektor trong> Koncentration Volym pMDG.2 1 ug / ul 5 pl pBR8.91 1 ug / ul 15 | il 2K7 vektor med GFP + genen av intresse 1 ug / ul 22 | il Steril Polyetylenimin (PEI) 1 g / L 500 | il DMEM 2100 pl - Blanda väl genom att vända röret 3-4x och inkubera under 15 min vid rumstemperatur (RT).
- Utför en fullständig medieförändring på HEK293T celler. Sug bort odlingsmedia från celler helt och foder med förvärmda HEK293T cellodlingsmedia (25 ml per T175 kolv).
- Lägg transfektionsblandningen (DNA / PEI blandning) droppe klokt att de monolagercellerna. Flytta försiktigt för att blanda väl och inkubera transfekterade celler vid 37 ° C, 5% CO2, över natt.
OBS: Dag 3: - För att säkerställa att transfektion är framgångsrik, kontrollera GFP uttryck 24 h efter transfektion genom en fluorescerande mikroskopi.
OBS: Över 50% av celler som uttrycker GFP indikerar vanligtvis en bra transfektion.
OBS: Dag 4: - Vid 48 h efter transfektion, samla den virala supernatanten och ersätta med färska HEK293 T media (25 ml per T175 kolv).
- Centrifugera den virala supernatanten vid 1140 xg under 10 min vid 4 ° C för att klara upp celldebris från supernatanten. Överföring rensas supernatanten till 50 ml rör och förvara vid 4 ° C.
OBS: Dag 5:
- Centrifugera den virala supernatanten vid 1140 xg under 10 min vid 4 ° C för att klara upp celldebris från supernatanten. Överföring rensas supernatanten till 50 ml rör och förvara vid 4 ° C.
- Vid 72 h efter transfektion, samla den andra satsen av viral supernatant. Upprepa steg 2.3.1 och pool 48 och 72 timmar rensas supernatanter.
- För att koncentrera viruset, centrifugera virala supernatanten vid 170.000 xg under 90 minuter vid 4 ° C med användning av 30 ml ultracentrifugrör.
- Kassera supernatanten och upprepa steg 2,6 tills allt rensas supernatanten har centrifug lämnar en (osynlig) pellet av virus plus utfälld PEI i botten av röret.
- För att resuspendera virus, tillsätt 500 | il SATO medier (se tabell av stamlösningar) till ultracentrifugrör. Vortex för 30 sek and skrapa basen av röret med en pipettspets för att mekaniskt lossa viruset. Upprepa detta steg 6x för att förlora viral pellets.
- Pool det omblandade viruset i mikrocentrifugrör och snurra mycket kortfattat att avlägsna olösligt PEI. Filtrera supernatanten genom ett 0,45 pm filter för att avlägsna proteiner.
- Alikvotera virus i 20 pl, 50 pl, och 100 | il alikvoter och förvara vid -80 ° C.
3. Viral titer Beslutsamhet i HEK293T Cells
- För att kontrollera uttrycket av proteinet av intresse och att bestämma den optimala virala koncentrationen för experiment, tillsätt en serie av seriespädningar av virusstam (t.ex. 0, 5, 10, 20, 40, 80 | il) för att transducera HEK293 T-celler utstrukna i 6-brunnars plattor och kultur under 24 h vid 37 ° C, 5% CO2. Detta protokoll genererar typiskt virus som kan användas vid koncentrationer som sträcker sig från 1:50 till 1: 200 som uppnår robust uttryck av genen avintresse.
- 48 timmar efter viral transduktion, lyserar HEK293T celler i TNE buffert (se tabell av stamlösning) med proteashämmare.
- Skölj brunnar två gånger med kylda DPBS och sedan lägga 150 l TNE buffert till varje brunn.
- Lysera celler genom pipettering upp och ner 5-10x. Överför hela cellysat till 1,5 ml mikrocentrifugrör och inkubera på is under 15-30 minuter.
- Centrifugera lysaten vid 4 ° C under 30 min vid maximal hastighet (20.000 x g) och överföring rensas supernatanten till ett nytt rör för proteinbestämning genom Bradford och efterföljande Western blöt-analys.
- Bestämma nivån av uttryck av proteinet av intresse genom standard western blot-analys, medan sondering för antikroppar mot proteinet självt och den fuserade taggen (dvs sjunker). Använd den virala utspädning som ger> 95% GFP + celler och robust uttryck av proteinet av intresse för experiment.
4. Isolering och odling av DRG (Figure 2 steg 1 & 2)
Figur 2:. Schematisk beskrivning av in vitro myelination analys DRG nervceller dissekeras från P2-3 råttungar, sedan renade och odlade under två veckor (1-2). OPCs renas från P7-9 råtthjämor använder immunopanning (3). OPCs infekteras sedan med lentivirus och odlades under 48 h (4). OPCs sedan ympades på DRG, och eventuella tillväxtfaktorer av intresse såsom BDNF sätts (5). Samkulturer odlas sedan för två veckor för att tillåta OPCs att differentiera och myelinate axonerna (6). Slutligen samkulturer antingen lyseras för western blotting eller fastställts för immuncytokemi (7).OBS: Dag 1- 2 dagar före dissektion:
<ol> - Coat autoklaveras 22 mm x 22 mm täckglas med poly-L-ornitin (0,5 mg / ml) i en 6-brunnars platta, och inkubera vid 37 ° C över natten.
- På nästa dag, coat täck igen med laminin (20 | ig / ml i MEM) vid 37 ° C över natten, aspirera bort överskott och torka under 20 minuter i vävnadskultur huva.
OBS: Dag 2: Dissekering och isolering av DRG: - Sacrifice P2-P3 råttungar 12x av livmoderhalscancer transektion.
- Ta bort huden överliggande muskeln på baksidan av djuret. Använd Vannas sax för att öppna vertebrala foramen och använda pincett för att försiktigt ösa ut ryggmärgen.
- Plocka ut DRG som ligger mellan ryggraden och avskurna bifogade spinal nervfibrer, sedan placera DRG i en 33 mm petriskål med 3 ml L-15 media. Det är oftast möjligt att samla mellan 8 och 12 DRG från varje sida av ryggmärgen
- Överför insamlade DRG tillsammans med L-15 material i en 15 ml tub, centrifugera vid 180 xg under 5 min.
- Aspirerasupernatanten, tillsätt 2 ml 0,25% trypsin till DRG pelletar och inkubera vid 37 ° C under 30 minuter.
- Tillsätt 5 ml av M1-medium (se tabell av stamlösning) till DRG pelletar att stoppa trypsin, och centrifugera vid 180 xg under 3 min vid RT.
- Sug ut supernatant, åter upphäva pelleten i 2 ml förvärmda M1 medium (ej med tillväxtfaktorer). Mal sönder ganglierna pellets genom att pipettera 50x eller tills ganglierna är spridda. Centrifugera cellsuspensionen vid 180 xg under 3 min.
- Resuspendera dissocierade nervceller i M1 medier och plattan i en 6-brunnar vid 5 ganglier per 100 l per brunn.
- För att ta bort prolifererande icke-neuronala celler, efter minst 4 h inkubation för att underlätta fastsättning, ta bort M1 media och foder nervceller med M2 media (se tabell i stamlösning). Kultur DRG-neuroner i närvaro av NGF (100 ng / ml) för att rena en kultur av NGF-beroende TrkA-uttryckande DRG. Alternativt kan du använda BDNF (100 ng / ml) för att rena BDNF beroende trkB-expressjunga DRG.
- Behåll nervceller i M1 media (+ NGF eller BDNF vid 100 ng / ml) omväxlande med antimitotisk M2 media för 2 veckor enligt nedan.
- Behåll medel M1 (+ NGF eller BDNF vid 100 ng / ml) på dagarna: 4-6, 8-10, 12-14 och M2 media (+ NGF eller BDNF vid 100 ng / ml) med FDU och uridin dag 1 till 4, 6-8, och 10-12. Ett minimum av 3 cykler av M2 media rening krävs.
- Behåll DRG i M1 ensam under ytterligare en vecka efter avslutad 2 veckors antimitotisk cykel. Ändra M1 media var 2-3 dagar.
5. Isolering och kultur av OPCs (Figur 2 steg 3)
OBS: Dag 1- 2 dagar före dissektion:
- Coat 10 cm vävnadsodlingsplattor med poly-D-lysin (PDL, 10 g / ml i steriliserat avjoniserat vatten) vid 4 ° C över natten.
OBS: Dag 2: 1 dag före dissektion: - Tvätta PDL plattor med steriliserat avjoniserat vatten för 3x. Låt torka i ~ 6 timmar i vävnadskultur huva. Om den inte används omedelbart, wrap och förvaraupp till 4 veckor vid 4 ° C.
- Förbered sekundära plattor antikropps för immunopanning. För en hjärna dissektion, förbereda 2x IgG-plattor (för RAN2 antikropp för avlägsnande astrocyter och O1 antikropp för att avlägsna premyelinating oligodendrocyter), med 45 | il get α mus IgG i DPBS (15 ml) per 10 cm petriskål; 1x IgM Platta för (O4 antikropp för val oligodendrocyt prekursorceller), 45 | il get α mus-IgM i DPBS (15 ml) per 10 cm petriskål.
OBS: Dag 3: dag dissektion: - Lägg 200 enheter av papain i 10 ml papain buffert (tabell 2), och värma upp vid 37 ° C tills bufferten blir klar.
Tabell 2: Framställning av papain buffert.Koncentration för 250 ml Slutlig koncentration EBSS lager 10x 25 ml 1x MgSO 4 100 mM 2,5 ml 1 mm Glukos 30% 3 ml 0,46% EGTA 0,5 M 1 ml 2 mM NaHCOs 3 1 M 6,5 ml 26 mM Bringa volymen upp till 250 ml med avjoniserat vatten och filtrera sterilisera - Tvätta alla sekundära plattor antikropps med DPBS för 3x.
- Häll RAN2 och O1 antikropp mot IgG-plattor och O4 hybridomet till IgM plattan. Inkubera alla dessa primära plåtar antikropps för över 2 timmar vid RT.
- Dissekera en hjärna från en P7 råtta. Halshugga en valp med vässade saxar och ta bort huden ligger över skallen med en sax.
- Skär runt skallen från nackloben, temporalloben och pannloben. Ta bort hjärnan från skallen med hjälp av en pincett och försiktigt överföra den till en 35-mm petriskål med 1 ml DPBS.
- Tärna hjärnan i små bitar ungefär med sax eller sterilt blad.
- Filtrera förvärmas papain buffert (10 ml) i en ny 15 ml tub innehållande några korn av L-cystein, tillsätt sedan 200 | il DNAas (12500 U / ml) till den filtrerade papain bufferten.
- Häll papain bufferten på de tärnade hjärnvävnader; inkubera vid 37 ° C under 90 minuter.
- Gentlly överföring sönderhjärnvävnad i 50 ml rör med hjälp av en 25 ml pipett ochlåt klarna.
- Ta bort papain buffert, tillsätt 2 ml Lo Ovo (Ovomucoid) till hjärnvävnader och titurate 5-10x genom pipettering att bryta upp bitar av hjärnvävnad, låt sedimentera och avlägsna de bästa 2 ml av supernatanten till ett nytt rör.
- Lägg till ytterligare 2 ml Lo Ovo till hjärnvävnader och upprepa steg 5.11 tills inga bitar av vävnad kvar. Tituration kan få allt aggressivare.
- Centrifugera dissocierade cellsuspensionen under 15 min vid 200 x g. Sug bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml Hi Ovo och centrifugera i 15 minuter vid 200 x g.
- Tvätta första immunopanning platta (Ran 2 platta) med DPBS för 3x. Aspirera supematant, återsuspendera cellerna i 10 ml panorering buffert (tabell 2) och häll på den första immunopanning plattan (Ran två platta). Inkubera cellerna under 15 min vid RT.
- Tvätta den andra immunopanning plattan (O1 platta) med DPBS för 3x.
- Efter inkubation på första immunopanning plattan, tippa cellsuspension på andraimmunopanning platta (O1 platta), Skölj alla lösa celler från ytan av plattan med 1-3 ml panorering buffert och överför med pipett till O1 plattan. Inkubera cellerna under 15 min vid RT.
- Tvätta den tredje immunopanning plattan (O4 platta). Denna platta är den positiva selektionsplattan där OPCs binda dess yta. Tvätta O4 plattan med DPBS för 3x.
- Efter inkubationen på den andra immunopanning plattan, överföra celler till den slutliga immunopanning plattan (O4 platta), inkubera cellerna under 45 min vid RT. Detta steg kommer att välja O4 + OPC.
- Aspirera supernatanten från den sista immunopanning plattan (O4 plattan) och skölj plattan med EBSS för 6x.
- För att ta bort OPCs utanför plattan, inkubera celler med 5 ml varm 0,05% trypsin-EDTA utspädd 1:10 med EBSS vid 37 ° C under 8 min.
- Tillsätt 5 ml 30% FBS (gjord i EBSS) för att neutralisera trypsin. Ta bort celler utanför ytan av plattan genom pipettering för cirka 50x.
- Överför alla mobiltelefonersuspensionen till ett nytt rör och centrifugera i 15 minuter vid 200 x g.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml förvärmda SATO media, följt av cellräkning. Dissekering av en hjärna kan ge 1,5-2.000.000 OPCs.
- Plate celler på torra PDL belagda plattor vid en densitet mellan 1 x 10 5 och 5 x 10 5 per 10 cm platta med i SATO media (10 ml) som innehåller ciliär neurotrofisk faktor (CNTF, 10 ng / ml), från trombocyter härledd tillväxtfaktor (PDGF, 10 ng / ml,), neurotrofin 3 (NT3, 1 ng / ml), och forskolin (4,2 ng / ml) 2,12. Kultur OPCs vid 37 ° C, 8% CO2.
6. transducerande OPCs
- Kultur primära OPCs i SATO media (10 ml / 10 cm platta) med CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml), och forskolin (4,2 | ig / ml) vid 37 ° C, 8% CO2 under 24 h efter dissekering.
- Helt aspirera bort OPC odlingsmedier, foder celler med nybakade SATO media (10 ml) Med tillväxtfaktorer (se ovan i steg 6.1).
- Lägg viruset till OPCs till den optimala koncentrationen bestämmas genom steg 3 (figur 2, steg 4), odlings OPCs under ytterligare 48 h.
7. OPC Seedning för myeliniserande Samkulturer (Figur 2, steg 5 och 6)
- För att ta bort OPCs från ytan, första skölj OPC-plattor med 8 ml EBSS två gånger och sedan inkubera celler med 5 ml varm 0,05% trypsin-EDTA utspädd 1:10 med EBSS vid 37 ° C under 2 min.
- Neutralisera trypsin med 30% FBS i EBSS (5 ml) och ta bort celler från plattan genom att pipettera. Överför cellsuspension till en 15 ml rör, centrifugera vid 180 xg under 15 min vid RT.
- Sug bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml förvärmda SATO media följt av cellräkning.
- Före OPC seeding, helt aspirera media från DRG odlingsplattan. Utsäde försiktigt 200000 OPCs droppvis vidare till DRG-neuroner som tidigare beskrivits 4-6.
NOTERA:Den totala OPC seeding volymen måste vara mindre än 200 l per 22 mm täckglas. - Lämna cellerna att sedimentera utan att flytta plattan under 10 minuter i vävnadsodling huven, sedan försiktigt fylla på med 1 ml förvärmd SATO media per brunn.
- Förnyad utbredning de återstående syster OPCs med SATO media med tillväxtfaktorer (se steg 6.1). Använd dessa syster OPCs att kontrollera uttryck av proteinet av intresse.
- Efter 24 timmar, byt ut SATO media med co-odlingsmedia (2 ml / brunn) innehållande SATO media (inga faktorer) och Neuro (v / v) med 1% B27. Underhålla samkulturer för 14 dagar med medieförändringen var 2-3 dagar.
- Bedöm samkulturer för myelinproteinuttryck genom Western blot-analys och visualisera för bildandet av myeliniserade axonal segment genom att dubbel immunofärgning med antikroppar mot myelinbasprotein markörer och neuronala markörer 4-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flaggan-märkta cellulära signalrelaterade kinas 1 (Flag-ERK1) Konstruera används för lentivirus produktion verifieras genom restriktionsenzym smälta av konstruktioner som används, inklusive både 2K7 konstruktioner och förpacknings och tillbehörs konstruktioner som krävs för virusproduktion (Figur 3) .
Figur 3: DNA-konstruktion verifiering. Alla DNA-konstruktioner som krävs för lentivirus produktion renades från Stbl3 bakterier och kontrolleras av restriktionsenzym digest. Tillbehörs och förpacknings vektorer digererades med Ncol och EcoRI, såsom indikeras, och jämfört med oklippt plasmid (A). 2K7-GFP digererades med Spel och SacII (A). 2K7-Flag-ERK1-DNA verifierades genom spjälkning med antingen Spel eller SacII ensamt, eller genom att dubbeldigere (B). Bandmönster varjämfört med förväntade mönster genereras från virtuella rötning av konstruktionen sekvenser med hjälp ApE programvara.
För att bestämma den optimala utspädningen att använda på OPCs var Erk 1 lentivirus titreras i HEK293T celler (Figur 4). Detta gjordes genom att tillsätta en rad virala utspädningar till HEK293T celler (figurerna 4A, 4C och 4D) eller till OPCs (Figur 4B). Uttrycksnivåer av genen av intresse ökning med tiden (Figur 4D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Titrering av Flag-ERK1 virus i HEK293T celler och OPC. Flag-ERK1 viruset titrerades i HEK293T-celler (A, C, D) eller OPCs (B). HEK293T-celler (A) eller OPCs (B) avbildades för GFP-uttryck 48 h efter infektion med Flag-ERK1 viruset. HEK293T cellysaten sonderades med avseende på närvaro av ERK1 eller total ERK1 / 2 efter 48 h av infektion (C). HEK293T cellysaten sonderades med avseende på närvaron av flagga, ERK1 / 2 och aktin som en laddningskontroll antingen 48 h eller 96 h efter infektion med Flag-ERK1 virus (D). Dessa blöts alla utplånade och avbildas tillsammans för att underlätta direkt jämförelse av uttrycksnivåer vid de två tidpunkter (D). Scale bar för (A) = 100 | im. Skala bar för (B) = 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När den optimala virusspäd har bestämts, var renade OPCs infekterades och odlades under minst 48 h för att tillåta transgenexpression nå sufficient nivåer, seedade sedan på DRG nervceller att bedöma deras myelination potential (Figur 5). När såddes på DRG nervceller, kommer OPCs differentiera till oligodendrocyter, och börja uttrycka myelinproteiner, som kan utvärderas genom western blotting (figur 5C). Vissa mogna oligodendrocyter kommer myelinate, och detta kan visualiseras genom MBP färgning (Figur 5D). Axoner måste också färgas med en markör som neurofilament eller βIII-tubulin (Figur 5D) för att säkerställa Axon tätheten beaktas när man analyserar myelination nivåer.
Figur 5: OPCs infekterades med Flag-ERK1 virus under 48 timmar innan sådd på DRG nervceller. Syster OPCs antingen fixeras och färgas för flagga och GFP (A) eller lyseras och sonde för flagga och ERK1 att verifieraexpression av viralt överuttryckt protein (C). Samkulturer fixerades efter 2 veckor i kultur och färgas för βIII-tubulin och MBP att visualisera DRG axoner och myeliniserande samt icke-myeliniserande oligodendrocyter (B). En myeliniserande oligodendrocyt indikeras av pilen och ett icke-myeliniserande oligodendrocyt indikeras av pilen-huvudet (B). Parallella samkulturer lyserades och sonde för myelinproteiner MBP och MAG, samt flagga och ERK1 / 2 för att bekräfta transgenexpression i co-kultur (D). En ökning av ERK1 nivåer var inte synligt i samodling på grund av de stora kvantiteter av DRG-härlett ERK1 närvarande i lysat Skalstreck = 20 | im.
| Namn | Ingredienser | Anmärkningar |
| TE-buffert pH 8 | 10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA pH 8 | Gör upp i avjoniserat vatten. |
| Polyetylenimin (PEI) | 1 g / L | Gör upp i avjoniserat vatten, filtrera-sterilisera och lagra lager vid -20 ° C. |
| LB-medium | 20 g Trypton 10 g Jästextrakt 10 g NaCl | Fyll upp till 2 L med avjoniserat vatten |
| 50% glycerol lager | Glycerol | Späd med en lika stor volym avjoniserat vatten och autoklavera |
| HEK 293 T-cell-medium | DMEM 10% fetalt bovint serum 1% penicillin / streptomycin 1% L-glutamin | |
| TNE lysbuffert | 10 mM Tris pH 8 150 mM NaCl 1 mM EDTA pH 8 1% NP40 | Lös NP40 i en mindre volym av avjoniserat vatten först eftersom det kommer att kristallisera vid kontakt med vatten. Fyll upp till slutlig volym i avjoniserat vatten |
| M1 | MINNE 10% fetalt bovint serum 0,4% D-glukos 2 nM L-glutamat 1% penicillin / streptomycin | För användning med rått DRG nervceller |
| MM1 | Neurobasal-medium 2% B27 (SM1) tillägg 0,4% D-glukos 2 nM L-glutamat 1% penicillin / streptomycin | För användning med musen DRG nervceller |
| M2 | DMEM 10 mg / L transferrin 5 mg / L insulin 20 nM Progesteron 100 pM Putrescine 10 iM FdU 10 iM Uridin | Späd M2 i en större volym DMEM utan FdU och uridin för användning över 1-2 månader. Lägg FdU och uridin till mindre volymer som kan vara klar inom två veckor |
| MM2 | MM1 10 iM FdU 10 iM Uridin | Lägg FdU och uridin till mindre volymer av medium som kan vara klar inom två veckor. |
| 10x MT-PBS pH 7,4 | 28,48 g / L (160 mM) Na 2 HPO 4 • 2 H2O 5,52 g / L (40 mM) NaH 2 PO 4 • H2O 87,66 g / l (1,5 M) NaCl | Lägg till avjoniserat vatten och justera pH till 7,4 med 10 N NaOH |
| 1x MT-PBS | 10x MT-PBS Avjoniserat vatten | Späd 10x MT-PBS 1:10 i avjoniserat vatten till 1x MT-PBS |
| 10x boratbuffert (1,5 M) | 18.55 g Borsyra 1x MT-PBS | Lös borsyra i 150 ml 1x MT-PBS. Justera till pH 8.56 med 10 N NaOH och föra slutliga volymen till 200 ml med 1x MT-PBS. Autoklav |
| 1x boratbuffert (0,15 M) | 10x boratbuffert 1x MT-PBS | Bered 100 ml av denna buffert för att lösa upp PLN i. Tillsätt 10 ml 10x boratbuffert (pH 8,56) till 90 ml 1x MT-PBS |
| 0,5 mg / ml poly-L-ornitin (PLN) | 50mg poly-L-ornitin Hydrobromide 0,15 M boratbuffert (pH 8,56) | Lös 50 mg av poly-L-ornitin hydrobromid i 100 ml 1x boratbuffert. Filtersterilisera (0,22 pm filter) och förvara vid 4 ° C i upp till en månad |
| 100x Poly-D-lysin (PDL) | 5 mg poly-D-lysin Sterilt, avjoniserat vatten | 100x PDL bestånd kan frysas vid -20 ° C i engångs portioner. Vid användning, späd till 1x i sterilt, avjoniserat vatten |
| Papain buffert | Se Tabell 2 | |
| DNas | 12500 U DNas I 1 ml EBSS | På is, upplösa DNas I i 1 ml kyld EBSS. Alikvot (t.ex., 300 ^ il / rör) och frys natten vid -20 ° C. Förvara vid -20 ° C. |
| 4% BSA | 8 g BSA 200 ml DPBS | Upplös BSA i 150 ml DPBS vid 37 ° C. Justera pH till 7,4 med ~1 ml av en IN NaOH. Bringa volymen till 200 ml. Filtrera genom ett 0,22 ìm filter för att sterilisera. Gör en ml alikvoter och förvara vid -20 ° C. |
| 10x Lo Ovomucoid | 3 g BSA 200 ml DPBS 3 g Trypsininhibitor | Lägg BSA till 150 ml DPBS och blanda väl. Lägg trypsin inhibitor och blanda för att lösa upp. Lägg ~ 1 ml av en N NaOH för att justera pH till 7,4. Ta volymen till 200 ml med DPBS. Filter-sterilisera genom ett 0,22 pm filter. Gör en ml alikvoter och förvara vid -20 ° C. |
| 6x Hi Ovomucoid | 6 g BSA 200 ml DPBS 6 g trypsininhibitor | Lägg BSA till 150 ml DPBS och blanda väl. Lägg trypsin inhibitor och blanda för att lösa upp. Lägg ~ 1 ml 1 N NaOH för att justera pH till 7,4. Ta volymen till 200 ml med DPBS. Filter-sterilisera genom ett 0,22 pm filter. Gör en m portioner och förvara vid -20 ° C. |
| SATO bas | Se Tabell 3 | |
| SATO media (råtta) | 1% SATO bas 1% penicillin / streptomycin 1% 0,5 mg / ml Insulin 1% L-glutamin 0,1% NAC 0,1% Biotin Späd med DMEM och filtrera sterilisera. | |
| SATO medier (mus) | 1% SATO bas 1% 0,5 mg / ml insulin 1% penicillin / streptomycin 1% L-glutamin 0,1% NAC 0,1% Biotin 0,1% spårämnen B 2% B27 Späd med DMEM och filtrera sterilisera. | |
| Insulin | 10 mg insulin 20 ml Sterilt deionzed vatten | Lägg insulin till avjoniserat vatten och tillsätt 100 | il av en N HCl för att tillåta insulin att upplösas. Blanda väl. Filtrera genom ett 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C under 4-6 veckor |
| NAC (N-acetyl-L-cystein) | 5 mg / ml NAC DMEM | Lös NAC i DMEM att göra en 5 mg/ Ml lösning, alikvot och förvara vid -20 ° C. |
| d-biotin | 50 | ig / ml biotin Sterilt, avjoniserat vatten | Lös biotin i vatten för att göra en 50 | ig / ml lösning, alikvot och förvara vid -20 ° C. |
| CNTF (ciliär neurotrof faktor) | 10 | ig / ml CNTF 0,2% BSA i DPBS | Späd CNTF för att göra en 10 | ig / ml lösning med steril 0,2% BSA i DPBS. Alikvot, blixt frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. |
| PDGF (blodplättshärledd tillväxtfaktor) | 10 | ig / ml PDGF 0,2% BSA i DPBS | Späd PDGF mästare lager (beredd enligt tillverkarens anvisningar) till 10 ng / ml med steril 0,2% BSA i DPBS. Alikvot, blixt frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. |
| NT3 (Neurotrofin-3) | 1 pg / ml NT-3 0,2% BSA i DPBS | Späd NT3 mästare stock (beredd enligt tillverkarens anvisningar) till 1 ng / ml med steril 0,2% BSA i DPBS. Alikvot, blixt frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. |
| Forskolin | 50 mg Forskolin Steril DMSO | Tillsätt 1 ml steril DMSO till 50 mg flaska forskolin och blanda väl att resuspendera fullt. Överföring till 15 ml rör och tillsätt 11 ml sterilt DMSO för att nå en koncentration av 4,2 mg / ml. Alikvotera och förvara vid -20 ° C. |
Tabell 3. Stamlösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelination av axoner är en avgörande process för optimal funktion av både de centrala och perifera nervsystemet hos ryggradsdjur. Generering och underhåll av myeliniserade axoner är en komplex och samordnad process med molekylära interaktioner mellan neuronal, gliaceller (från Schwann celler eller oligodendrocyter) och extra cellulära matrixproteiner. Betydelsen och tillämpligheten av detta protokoll är att det tillåter manipulering av proteiner i en specifik celltyp inom de blandade samodling inställningar. Som flera celltyper är inblandade i myelinisering både in vivo och in vitro myelination analysen i, med trubbiga farmakologiska verktyg för att blockera aktiviteten hos vissa proteiner eller signalvägar kan inte ge specifik information om det inflytande som proteiner utövar på myelinisering från antingen en neuronal eller gliaceller perspektiv, om proteinet är unikt uttrycks av en celltyp. Således myelination in vitro somsäger i samband med användning av Lentivirus att specifikt transduce OPCs tillåter oss att förhöra de effekter som oligodendrogliala proteiner utövar på myelinisering. Vi har framgångsrikt använt 2K7 Lentivirus att överuttrycker särskilda proteiner specifikt i oligodendrocyter för myelination analysen in vitro för att dissekera den effekt som oligodendrogliala signaler utövar på CNS myelination 9.
För att uppnå reproducerbara resultat i den omvandlade OPC i myelination vitro, är optimering krävs för varje steg av protokollet från kloning genom dissektioner och OPC sådd. Det är absolut nödvändigt att, vid nivån av DNA, är pENTR vektorn innehållande den märkta genen av intresse konstrukt sekvenserades och att 2K7 DNA med den märkta genen av intresse kontrolleras genom western blöt för expression av taggen och genen av intresse, före användning av DNA: t för att generera virus. Det är viktigt att välja antingen HEK293Tcells eller HEK293FT-celler för att generera viruset och växa under mykoplasma fri miljö. Efter producera lentivirus är det viktigt att titrera varje sats av virus för att bestämma den optimala utspädningen att använda på OPCs. Detta kan göras genom att lägga till en rad virala utspädningar till HEK293T celler eller till OPC. Eftersom 2K7 konstruktionen innehåller både genen av intresse och GFP, kan uppskattas effekten av transduktion genom uttryck av GFP genom fluorescensmikroskopi och genom att analysera uttryck av taggen och genen av intresse genom western blot-analys. Ljusare GFP + celler kommer att bli synliga med högre koncentrationer virus, eftersom det är möjligt för flera viruspartiklar för att infektera en enda cell. Kontroll av uttryck av GFP via fluorescensmikroskopi är en användbar indikator av titer av virus och uttryck av GFP, men kan inte användas som ett surrogat för att kontrollera uttrycket av proteinet av intresse. Det är därför kritiskt att kontrollera expressionsnivån av proteinet av intresse för både HEK293T celleroch OPCs genom Western blot-analys. Om proteinet av intresse uttrycks endogent av nervceller i samkulturer kan överuttryck av OPCs / OLS maskeras när man analyserar samodlingssystemet lysat av western blot; därför är det viktigt att antingen tagga proteinet av intresse eller kultur syster OPCs efter sådd så kan verifieras uttryck av proteinet av intresse i syster OPCs om inte i co-kulturen.
Kvaliteten på både DRG och OPC kulturen avgör direkt om experimenten lyckas. I coculture inställningarna kan råtta DRG nervceller att samodlades med OPCs härrör från antingen råtta eller mus. OPC kräver varsam och snabb hantering. Det är viktigt att optimera virustiter för OPCs som för lite misslyckas med att effektivt transducera de OPCs leder till låga nivåer av uttryck av proteinet av intresse och för mycket virus är giftigt för OPCs så det finns för få celler till sådant utsäde på nervceller. Båda dessa sub optimala transduktioner kan Resulti unanalyzable eller obetydliga förändringar i myelinisering eller myelinproteinuttryck. OPCs differentiera om de blir över sammanflytande och kan inte seedas efter att de har differentierade, därmed antalet OPCs odlade och omvandlade måste optimeras till lokala förhållanden. Det är önskvärt att ympa samma antal OPCs för varje myelination analys möjliggör direkta jämförelser av antalet myeliniserade axonal segment som ska jämföras mellan förhållandena under flera experiment.
En potentiell begränsning av denna teknik är variationen i basala myelination nivåer mellan myelinisering analyser. Efter viral transduktion, är den basala nivån av myeline reduceras, vilket antyder att viralt infekterade OPCs inte myelinate liksom de naiva (icke-virusinfekterade) OPCs. Detta kan övervinnas genom att kvantifiera omfattningen av myeline relativt den basala myelinisering i varje analys. Sålunda måste tom vektor som endast uttrycker GFP kan användas som en intern control. Förutom myelinisering, kan uttrycket av ett protein av intresse också påverka andra aspekter av OPCs såsom överlevnad, proliferation och differentiering, vilket leder till en indirekt effekt på myelinisering. Därför bör analysen av OPC beteenden som cellviabilitet göras parallellt med myelinisering analyser.
De virala transduktion metoder som beskrivs här är inte begränsade till studiet av oligodendrocyt myelination; i själva verket kan generaliseras och tillämpas för att studera andra celltyper, såsom Schwann-celler, astrocyter och neuron men optimering kan krävas för individuell celltyp. Detta protokoll ger stor flexibilitet för att studera cellbeteende såsom proliferation och differentiering genom selektiv överexpression av ett protein av intresse (vildtyp eller mutant) i den önskade celltypen, som har särskilda fördelar vid användning av en blandad cellkultursystem. De celler som används för transduktion kan isoleras från antingen råtta ellermus (vildtyp eller transgena), vilket möjliggör den målinriktade studier av signalering och kompensationsmekanismer i transgena djur, som vanligtvis är svår att uppnå och mycket mer tidskrävande än att använda en in vivo-transgen musmodell. Nya rön tyder på att lentiviral-baserade strategi har framgångsrikt använts för cell transduktion i djurmodeller 13, vilket tyder på en stark potential transducera oligodendrogliala celler genom att använda de lentivirala metoder in vivo.
Sammanfattningsvis kombinerar vitro myelination analysen in med Lentiviral infektion av OPCs ger ett strategiskt verktyg för analys av molekylära mekanismer som är involverade i myelinisering. Rollen av specifika proteiner i myelinisering kan förfrågas och eftersom OPCs kan isoleras från råttor och möss för användning på rått-DRG samkulturer, kan också användas Lentiviral tillvägagångssätt i kombination med knockout-teknik av olika muslinjer att förhöra mechnismer av ersättning i processerna för myelinisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody - Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody - Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin-streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
