בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Protocol

הערה: כל דגימות המטופל התקבלו עם הסכמה מדעת, ופרוטוקולי ניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד Institutional Review Board (פרוטוקול # 2,188 ו# 9999).

1. בידוד תא ותרבות:

1. רקמת שומן תת-עורי לקבל אדם ממטופלות בריאה עוברות lipoaspiration בחירה של הבטן, אגף, ו / או באזור הירך בהרדמה הכללית מקומית /. ודא שInstitutional Review Board אישור (IRB) אושר על הפרוטוקול של בידוד ASCs מרקמות אנושיות, ופעל אמצעי בטיחות מוסדי בעת שעבד עם חומרים כאלה.
2. כדי להשיג את SVF מרקמת שומן lipoaspirated, לשטוף ראשון lipoaspirate שלוש פעמים עם כמויות שווים של פוספט שנאגרו מלוח סטרילית 1x (PBS). בזהירות לשאוב וזורקים את השכבה המימית התחתונה.
3. הכן את חיץ עיכול collagenase: סוג 0.075% אני Collagenase בהאנק שלפתרון מאוזן מלח (HBSS). הכן חיץ FACS: 2% FBS, P188 1% לבין 1% פן-דלקת בPBS. סנן פתרונות הן באמצעות מסנן זמין מסחרי 0.22 מיקרומטר גודל נקבובית זרימה מהירה polyethersulfone.
4. לעכל את רקמת השומן נשטפה, להוסיף נפח שווה של חיץ עיכול collagenase ולמקם את כלי עיכול באופן מאובטח באמבט מים רועד במשך 60 דקות ב 37 ° C (כ 180 שייקים / min).
   הערה: עדיף להשתמש בכלי עיכול נפח גדול יותר מהנדרש, כמו זו מאפשרת לעיכול מקסימאלי במהלך רועד (כלומר, 250 מיליליטר של חיץ עיכול collagenase, 250 מיליליטר של רקמת שומן נשטפה בבקבוק 1 ליטר סטרילי).
5. לנטרל פעילות האנזימטית על ידי הוספת נפח שווה של חיץ FACS ומאפשר לשבת על RT במשך 5 דקות. בשלב הבא, צנטריפוגות ב 233 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant, נזהרים שלא להפריע את כדור SVF בצפיפות הגבוהה.
7. Resuspend גלולה ב5-10 מיליליטר של אדום RTתא תמוגה חיץ, המבוסס על גודל גלולה. השאר פתרון לשבת בRT עבור 5 דקות ו צנטריפוגות ב 233 XG במשך 5 דקות בRT.
8. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ידי הוספת 5-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המסורתית, המבוססים על גודל גלולה (הנשר בינוני השתנה Dulbecco [DMEM] / 10% FBS / 1% [עט-סטרפטוקוקוס] פניצילין, סטרפטומיצין פתרון).
9. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר להסיר פסולת הסלולר.
10. צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant מבלי לשבש את גלולה.
11. Resuspend גלולה ב5-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המסורתית, המבוסס על גודל גלולה.
12. מקום 2 x 10 ⁶ תאים בצלחת תרבות 15 סנטימטר סטנדרטית ולהקים תרבויות עיקריות O / N ב 37 מעלות צלזיוס / 21% O _2, 5% CO _2. לשמור ברמות תת-ומחוברות למניעת התמיינות ספונטנית על 37 מעלות צלזיוס / 21% O _2, 5% CO ₂ בתקשורת צמיחה.
    צפיפות תאים באופן מלא: הערהצלחת 15 סנטימטר ומחוברות היא כ 4-6 x 10 ⁶ תאים.

2. מכתים

1. ASCs תרבות במדיום גידול מסורתי על 37 מעלות צלזיוס O / 21% _2, 5% CO _2, 36 שעות לפני מכתים / מיון.
2. ASCs Lift מצלחות התרבות באמצעות Accutase (לפי הפרוטוקול של היצרן).
3. לשטוף את תאי פעם עם חיץ FACS (PBS עם FBS 2% לבין 1% עט-סטרפטוקוקוס).
4. צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
5. בטל supernatant מבלי לשבש את גלולה. Resuspend התאים 0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS (תלוי במספר תאים וכמות הנוגדנים הרצויים).
   הערה: הנפח של ההשעיה התא, בהתאם להמלצות יצרן נוגדני FACS, קובעת ריכוז נוגדן. עם זאת, טיטרציה של ריכוז נוגדנים, באמצעות ריכוז התחלתי של 1: 100, בדרך כלל מומלץ אם זה בפעם הראשונה להשתמש נוגדן.
6. לספור את המספר הכולל שלתאים באמצעות hemocytometer.
7. שמורת 100 aliquots ul בצינורות 1.5 מיליליטר צנטריפוגות כדי לשמש למדגם בלא כתם ובקרות חד-צבע (לפי מספר נוגדני ניאון בשימוש).
8. הוסף את הנוגדנים חד-שבטיים fluorescently שהכותרת המתאימים (בריכוזים שנקבעו מראש, לפי הוראות יצרן) ו דגירה של 20-30 דקות על קרח, מוגן מפני אור.
   1. לתייג תת-אוכלוסיית osteogenic: לדלל אנטי CD90 (CD90 APC אנטי-אנושי (Thy1)) או אנטי-CD105 (FITC אנטי אנושי CD105 (endoglin)) במאגר FACS לריכוז של 1:50.
   2. לתייג אוכלוסיות תאים אחרות (לדוגמא, hematopoietic ותאי האנדותל): לדלל אנטי CD45 (Anti-האדם CD45 Pacific Blue), אנטי-CD34 (Anti-אדם CD34 APC), ו / או אנטי-CD31 (Anti-האדם CD31 PE ) בFACS חיץ לריכוז של 1:50.
   3. אם לא באמצעות נוגדנים מצומדות ישירות, להשתמש נוגדן ראשוני biotinylated עם שנייה streptavidin מצומדות- מתאימהנוגדן האר"י, כגון streptavidin PE-Cy7, בדילול של 1: 100.
9. לאחר דגירה, לשטוף את התאים פעמיים: למלא צינורות עם חיץ FACS ו צנטריפוגות ב 233 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, aspirating supernatant.
10. Resuspend התאים 400-500 דגימות μl FACS חיץ ומסנן דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר להסיר גושי תא.
11. העבר את התאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם ראש המסנן ולשמור על דגימות קרח למשך ניתוח.

3. מיון תא הקרינה המופעל

הערה: השלבים הבאים מחייבים ידע קודם בתא הקרינה המופעל מיון (FACS) או סיוע של טכנאי מיומן.

1. שימוש בתוכנת FACS המתאים, מגרשי ניתוח העיצוב לבחון פיזור קדימה (FSC), פיזור צד (SSC), Phycoerythrin (PE) -טקסס אדום, פסיפיק הכחול, והעמסת isothiocyanate (FITC), Allophycocyanin (APC) וכל שימוש אחר fluorophoreד לתייג תאים.
2. לפני הטעינה לסדרן התא, בקצרה מערבולת מדגם זה לresuspend התאים.
3. להתחיל עם ניתוח של המדגם בלא כתם כדי להגדיר שערים לכלל אוכלוסיית התא, להוציא פסולת הסלולר, ולקבוע autofluorescence תחילת המחקר.
4. להוסיף יודיד propidium (PI) למדגם בלא כתם ולנתח אותו כדי להמחיש את האוכלוסייה של תאי חיים בתוך כלל אוכלוסיית התא. לבנות שער סביב אוכלוסייה זו.
5. ניתוח מדגם שליטה יחיד צבע עבור כל fluorochrome כדי להגדיר פיצוי הקרינה.
6. לנתח את המדגם המוכתם כדי לקבוע את המיקום של שערים למיון.
7. להוסיף PI למדגם המוכתם כדי להכתים תאים מתים.
8. למיין את אוכלוסיות תאים שכותרתו. מיין לתוך או 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה או צינורות חרוטי (15 מיליליטר) המכילים מדיום התרבות.
9. באופן ידני להפסיק מיון פעם אחת הכמות הנדרשת של תאים הושגה.
10. שלנוing FACS, לבצע בדיקת טוהר על ידי ניתוח חלק קטן (למשל., 500 תאים) של אוכלוסיית התא שנרכשה.
    הערה: שלב זה מאשר את טוהר של אוכלוסיות תאים הממוינים. באופן אידיאלי, טוהר צריך להיות גדול מ 90-95%.
11. תאי צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס מייד לאחר השלמת מיון וגלול ב 1 מיליליטר של מדיום טרי המכיל 10% FBS.
    הערה: הסכום של תקשורת המשמשת עשוי להיות מוגבר המבוסס על גודלו של התא גלולה.
12. צלחת על צלחות מצופים ג'לטין כדי לשפר את כדאיות תא. בהתאם לתשואה סופית תא, צלחת 300,000 תאים לכל גם בצלחת 6-היטב, 100,000 תאים לכל גם בצלחת 12 גם.

Representative Results

באמצעות CD90 כסמן לתאים עם תוצאות משופרות Osteogenesis בבידוד של אוכלוסיות מועשרות של ASCs האנושי (איור 1 א, 1 ב '). ASCs הוכתמו CD45 פסיפיק בלו-מצומדות אנטי-אנושי, CD105 אנטי אנושי FITC מצומדות-, וCD90 אנטי אנושי APC-מצומדות. לאחר המיון, רמת טוהר הייתה גדול יותר מ- 98%, כפי שלכמת ידי ניתוח שלאחר-מין.

הגדרת קבוצות של תאים המבוססים על פרופילי תעתיק אפשרו לבידוד פוטנציאלי של שתי תת-אוכלוסיות רומן. כדי לאפיין את הפוטנציאל של כל תת-אוכלוסיית osteogenic מבטיחה (CD90 ⁺ וCD105 ^נמוך), כמו גם זה של האוכלוסייה לא ממוינת במבחנה, תאים בתרבית בינוני בידול osteogenic למשך 14 יום, כפי שתוארו בעבר ^6,8,9. צביעת phosphatase אלקליין (המשמשת לגילוי מוקדם של עצם היווצרות ¹⁰⁾ ביום 7 הוגדלה באופן משמעותי ^ב+ CD90 (איור 2 א). זה נצפה שני גס ולאחר הכימות (איור 2 א). באופן דומה, מכתים Alizarin האדום (assay משמש לאיתור מינרליזציה מטריצת חוץ תאית ומדד לסוף-מסוף בידול osteogenic ⁹⁾ ביום 14 הראה כי CD90 ⁺ ASCs הצליחו mineralize כמות גדולה יותר באופן משמעותי של מטריצה ​​תאית (איור 2). ASCs המבודד לשמר את היכולת לעבור התמיינות osteogenic לאחר המיון אבל עשוי לדרוש כמה ימים כדי להתאושש. זה חיוני כדי לבצע את כל ניסויים נוספים עם תאי מעבר נמוכים, כASCs הפך senescent במהלך התפשטות בתרבות.

איור 1: שערים () לגודל תא ומורכבות נמשכו להוציא פסולת תא ולבודד o אוכלוסייהf תאים בודדים לניתוח נוסף. (ב) ניתוח FACS של-מסודרים יחיד CD90 (משמאל) ו- מסודרים יחיד CD105 (מימין) ASCs 36 שעות לאחר קציר ASC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: צביעת phosphatase אלקליין (למעלה) וכימות (תחתון) של ASCs לאחר 7 ימים של התרבות במדיום בידול osteogenic (א) (ב) מכתים Alizarin אדום (למעלה) וכימות של הכתמה (תחתון) של ASCs לאחר 14 ימים. תרבות במדיום בידול osteogenic. CD90 ⁺ ASCs ותאים ^נמוכים CD105 להראות מוגברים צביעת phosphatase אלקליין ומינרליזציה מטריצה ​​תאית בהשוואה לתאים לא ממוינים (* p <0.05; תלמיד שני זנבמבחן t). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

נכון לעכשיו, את בידודה של תת-אוכלוסיות הומוגניות של ASCs מSVF של רקמת שומן אנושית נותר מאתגר אף מטרה רצויה. בידוד של אוכלוסיות ASC פרו-osteogenic במיוחד רצוי, כפי שניתן להשתמש בם תאים כאלה כדי ללמוד את ההיווצרות והומאוסטזיס של רקמות שלד. עם זאת, SVF של רקמת שומן נמלי הטרוגניות משמעותית בכל קשור לגזע קיבולת תא ופוטנציאל התמיינות. ¹¹ הבסיס המולקולרי להטרוגניות זו לא ניתן להבין מאוכלוסיות משולבות של תאים, ובמקום זאת דורש ניתוח תא בודד. ¹² עם גישה זו, סמני משטח קשר הדוק עם יכולת ההבחנה osteogenic של ASCs ניתן לזהות.

הגורם הקריטי ביותר להעשרה מוצלחת של ASCs, כפי שמתואר בשיטה הנ"ל, קשור לנוגדנים מנוצלים לFACS. אחד חייב להיות זהיר כדי לבחור נוגדן עם זיקה חזקה לcelסמן l-פני השטח בשאלה. באופן אידיאלי, זה צריך להיות נוגדנים מצומדות עיקריים בניגוד לשיטת צביעה עקיפה, אשר דורשת שלבים מרובים וכך, סיכוי מוגבר למוות של תאים, תאי אובדן וצבירת שגיאה. יתר על כן, שינויים קלים במהלך FACS יכולים להגדיל את כדאיות תא. אלה כוללים מיון לתוך כלי קיבול מגניבים, שמירה על תאים על קרח בכל העת, מיון תאים לתוך כלי קיבול המכיל תקשורת ותרבות וגם, ציפוי אוכלוסיות תאים שנרכשו על צלחות תרבות שכבר מראש מצופות עם ג'לטין 10%. חשוב לבצע ניתוח שלאחר טהרת מין-, על מנת להבטיח את הטוהר של התאים הממוינים.

טכניקה זו היא מוגבלת על ידי הזמינות של ציוד FACS ומומחיות בתוך מתקן. יתר על כן, כדוגמות העיקריות הן הטרוגנית, הביטוי של סמני משטח ישתנה על בסיס פרטני. כאמור, זה הכרחי כדי לבצע את כל הניסויים בתאי מעבר נמוכים, כASCים הפך senescent במהלך התפשטות בתרבות. בנוסף, ידוע כי ASCs להציג שינוי בביטוי פנוטיפי תחת במבחנה תנאים אשר עשוי לשנות את הביולוגיה של תאי גזע. כך, לתרגום קליני, זה יהיה אופטימלי להשיג אוכלוסיית תא נקיה במיוחד להשתלה ישירה או זריעת תאים לפיגום ללא הצורך בטיפוח במבחנה. בנוסף, הכמויות הגדולות של lipoaspirate אשר צריכים להיות מעובד לבודד את SVF יכול להיות מעיק למי שלא מכיר את הטכניקה, כפי שנדונו וטופל על ידי צוק ועמיתים בפרסום האחרון ^13. לפי השיטה שתוארה על ידי צוק et al., פרוטוקול זה יכול בקלות להיות scaled למעלה או למטה כדי להתאים את עוצמת הקול של lipoaspirate וניתן להתאים לבודד ASCs מרקמת שומן שהושגה באמצעות abdominoplasties ונהלים דומים אחרים.

CD90 וCD105 בעבר זוהו כתחילת ג גזע mesenchymalסמני ell, הן בBM-MSC ואוכלוסיות ASC. בקנה אחד עם מחקרים קודמים, CD90 ⁺ האוכלוסייה היוותה כ -50% מSVF המבודדים הטרי. ¹⁴ לעומת זאת, רק כ 5-10% מSVF הראשוני הביעו CD105. ⁶ יש לציין, עם קטעים רצופים, ביטוי CD105 גדל בקצב מהיר כמעט מ אפס לביטוי כמעט בכל מקום לאחר 4-7 ימים בתרבות. זה ידוע שASCs התערוכה להיסחף פנוטיפי ניכר במהלך התרחבות במבחנה, אשר עשוי לשנות את הביולוגיה של תאי גזע. ^15-17 באופן אידיאלי, יישומים קליניים בתאי גזע יהיה כרוכים בשימוש המיידי של אוכלוסיות תאים מטוהרים להשתלה או זריעה ישירה על פיגום , ללא הצורך בטיפוח במבחנה. אחוז תאי CD90 ⁺ עשוי להשתנות בין מדגמים השונים lipoaspirate במקור דיפו תלוי שומן או אופן תלוי גיל. עם זאת, שימוש בCD90 כסמן תא שטח מאפשר לo העשרהתת-אוכלוסייה של fa ASCs אדם עם פוטנציאל osteogenic משופר. שיטה זו של העשרת osteogenic יש הפוטנציאל לשמש כמנגנון חדש לקידום היווצרות עצם מהירה וחזקה בחולים עם מומי שלד קריטיים בגודל. אנו שגרתי לראות כי תשואת תא משוערת מlipoaspirate הסטנדרטי היא 5 x 10 ⁷ תאי בעלי גרעין / 500 מיליליטר של lipoaspirate בשיטת הקציר האמורה, למרות שכפי שתואר לעיל זה יכול להשתנות בהתאם למוצא מחסן שומן או דמוגרפי מטופל. ¹⁸ יושימורה ועמיתים דיווחו כי ASCs מייצג 10-35% מהאוכלוסייה של תאי בעלי הגרעין בSVF. ¹⁹ לכן, יש פוטנציאל רב לזריעה ישירה של פיגום ליישומן של אסטרטגיות הנדסת רקמות העצם הבא העשרת osteogenic של ASCs באמצעות FACS.

גזע הנדסת רקמות מבוססי תאים עבור יישומים ניסיוניים וקליניים לעתים קרובות דורש אוכלוסיות תאים נקיות במיוחד. אחר היישיטות GH-תפוקה של טיהור להתקיים כחלופות פשוטות לFACS, כוללות צילום פנורמי, דלדול משלים, ותא-מגנטי הופעל מיון (MACS). עם זאת, במצבים מסוימים, FACS הוא גם הכרחי ומועיל: כאשר הבידוד של אוכלוסיות טהורות ביותר הוא רצוי, כאשר סמן משטח היעד מתרחש לעתים רחוקות באוכלוסיית התא, או כאשר תאים יש להפריד מבוסס על רמות ביטוי שונות של אותו המשטח סמן.

שימוש בשתי ניתוח מבוסס microfluidic תא בודד תעתיק ומיון תא הקרינה המופעל, endoglin (CD105) וThy-1 (CD90) נמצאו כקשורים להבדלים בביטוי של גני ASC osteogenic. ניתוח סטטיסטי של פרופילי תעתיק תא בודד הוכיח כי ביטוי נמוך של CD105 וביטוי גבוה של CD90 לתאר תת-קבוצות של ASCs עם קיבולת osteogenic מוגברת. חלבונים אלה שמשו לאחר מכן להעשרה לאוכלוסיות osteogenic של תאי דerived מרקמת שומן תת-עורי אנושית. ^6,20

יחד, נתונים אלה מדגימים את היעילות של מיון ASCs מבוסס על סמנים פני תא ספציפיים המתואמים עם פעילות תעתיק osteogenic. למרות שאת הכדאיות של גישה זו באה לידי הביטוי כאן באמצעות CD90 וCD105 כדוגמאות, ניתוח נוסף שצריך לעשות כדי לכלול את כל שילובים המבטיחים של ביטוי אנטיגן שטח שמאוד לתאם עם פעילות תעתיק osteogenic.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences