Protocol
ملاحظة: تم الحصول على جميع عينات المرضى للموافقة المسبقة عن، وتم استعراض البروتوكولات التجريبية والمعتمدة من قبل جامعة ستانفورد مجلس المراجعة المؤسسية (بروتوكول # 2188 و # 9999).
1. عزل خلية والثقافة:
- الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد الإنسان من المرضى من النساء الأصحاء تمر lipoaspiration الاختيارية من البطن، الجناح، و / أو منطقة الفخذ تحت تخدير موضعي / عام. تأكد من أن مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) الموافقة قد تم الحصول عليها عن بروتوكول لعزل ASCS من الأنسجة البشرية، واتباع احتياطات السلامة المؤسسية بينما كان يعمل مع مثل هذه المواد.
- للحصول على صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية lipoaspirated، وغسل لأول مرة lipoaspirate ثلاث مرات مع أحجام متساوية من 1X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). نضح بعناية وتجاهل الطبقة المائية أسفل.
- إعداد العازلة كولاجيناز الهضم: 0.075٪ النوع الأول كولاجيناز في لهانكمحلول ملحي متوازن (HBSS). إعداد عازلة FACS: 2٪ FBS، 1٪ P188 و 1٪ القلم بكتيريا في برنامج تلفزيوني. تصفية كل من حلول باستخدام المتاحة تجاريا 0.22 ميكرون حجم المسام تدفق سريع مرشح polyethersulfone.
- لهضم الأنسجة الدهنية غسلها، إضافة حجم مساو من كولاجيناز عازلة الهضم ووضع سفينة الهضم بشكل آمن في حمام مائي تهتز لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية (حوالي 180 يهز / دقيقة).
ملاحظة: فمن الأفضل لاستخدام أكبر حجم الوعاء الهضم مما هو مطلوب، وهذا يسمح للهضم القصوى خلال الهز (أي 250 مل من العازلة كولاجيناز الهضم، 250 مل من الأنسجة الدهنية غسلها في قارورة معقمة 1L). - تحييد النشاط الأنزيمي بإضافة حجم مساو من العازلة FACS والسماح للجلوس على RT لمدة 5 دقائق. وبعد ذلك، الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نضح بعناية وتجاهل طاف، مع الحرص على عدم تعكير صفو عالية الكثافة SVF بيليه.
- resuspend الكرية في 5-10 مل من RT الأحمرخلية تحلل العازلة، استنادا إلى حجم بيليه. ترك حل للجلوس على RT لمدة 5 دقائق والطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- نضح طاف و resuspend بيليه بإضافة 5-10 مل من وسائط النمو التقليدي، استنادا إلى حجم بيليه (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة [DMEM] / 10٪ FBS / 1٪ البنسلين الستربتومايسين حل [القلم بكتيريا]).
- تعليق تصفية من خلال 100 ميكرون خلية النايلون مصفاة لإزالة الحطام الخلوي.
- الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
- resuspend الكرية في 5-10 مل من وسائط النمو التقليدي، استنادا إلى حجم بيليه.
- ضع 2 × 10 6 خلايا في طبق ثقافة 15 سم القياسية وإقامة الثقافات الأولية O / N عند 37 درجة مئوية / 21٪ O 2، 5٪ CO 2. الحفاظ على المستويات دون متموجة لمنع التمايز عفوية في 37 ° C / 21٪ O 2، 5٪ CO 2 في وسائل الاعلام النمو.
كثافة خلية في كامل ملاحظة:متموجة 15 سم لوحة ما يقرب من 4-6 × 10 6 خلايا.
2. تلطيخ
- ASCS الثقافة في متوسطة النمو التقليدي عند 37 درجة مئوية / 21٪ O 2، 5٪ CO 2، لمدة 36 ساعة قبل تلطيخ / الفرز.
- ASCS رفع من لوحات ثقافة استخدام Accutase (وفقا للبروتوكول الشركة المصنعة).
- غسل خلايا مرة واحدة مع FACS العازلة (PBS مع 2٪ FBS و 1٪ القلم بكتيريا).
- الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف دون الإخلال بيليه. resuspend الخلايا في 0.5-1 مل من العازلة FACS (اعتمادا على عدد الخلايا وكمية من الأجسام المضادة المطلوبة).
ملاحظة: حجم التعليق الخلية، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة الأجسام المضادة FACS، ويحدد تركيز الأجسام المضادة. ومع ذلك، المعايرة تركيز الأجسام المضادة، وذلك باستخدام تركيز الانطلاق من 1: 100، وينصح عادة إذا كان هذا هو المرة الأولى لاستخدام الأجسام المضادة. - عد العدد الإجمالي للالخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- الاحتياطي 100 UL مأخوذة في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي التي تستخدم في عينة غير ملوثين والضوابط أحادية اللون (وفقا لعدد من الأجسام المضادة الفلورسنت المستخدمة).
- إضافة الاجسام المضادة المناسبة fluorescently المسمى (بتركيزات محددة سلفا، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة)، واحتضان لمدة 20-30 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
- لتسمية حيوانية عظمي المنشأ: تمييع مكافحة CD90 (APC CD90 مكافحة الإنسان (Thy1)) أو مكافحة CD105 (FITC مكافحة الإنسان CD105 (endoglin)) في المخزن FACS إلى تركيز 01:50.
- لتسمية السكان الخلية الأخرى (على سبيل المثال، المكونة للدم والخلايا البطانية): تمييع مكافحة CD45 (مكافحة CD45 الإنسان والمحيط الهادئ الأزرق)، ومكافحة CD34 (مكافحة الإنسان CD34 APC)، و / أو مكافحة CD31 (مكافحة CD31 الإنسان PE ) في FACS العازلة إلى تركيز 01:50.
- إذا لم تكن تستخدم الأجسام المضادة مترافق مباشرة، واستخدام الأجسام المضادة الأولية المعقدة البيروكسيديز مع-streptavidin مترافق الثاني المناسبةالأجسام المضادة آرى، مثل Streptavidin PE-Cy7، في التخفيف من 1: 100.
- بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين: ملء الأنابيب مع FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وطاف الشفط.
- resuspend الخلايا في 400-500 ميكرولتر FACS العازلة ومرشح عينات من خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة لإزالة كتل الخلية.
- نقل الخلايا المسمى في أنابيب FACS مع كبار تصفية والاحتفاظ بعينات على الجليد لمدة التحليل.
3. تنشيط الإسفار الفرز خلية
ملاحظة: الخطوات التالية ولاية معرفة سابقة في الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) أو مساعدة من أحد الفنيين المهرة.
- باستخدام برنامج FACS المناسبة والمؤامرات تحليل تصميم لدراسة مبعثر إلى الأمام (FSC)، والجانب مبعثر (SSC)، فيكوإيريترين (PE) -Texas الأحمر، الأزرق المحيط الهادئ، فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، Allophycocyanin (APC) وأي استخدام fluorophore أخرىد لتسمية الخلايا.
- قبل تحميل في فارز الخلية، لفترة وجيزة دوامة كل عينة إلى resuspend الخلايا.
- تبدأ مع تحليل العينة غير ملوثين من أجل وضع بوابات بالنسبة لمجموع السكان الخلية، لاستبعاد الحطام الخلوي، وتحديد خط الأساس تألق ذاتي.
- إضافة يوديد propidium (PI) على عينة غير ملوثين وتحليلها من أجل رؤية السكان من الخلايا الحية داخل مجموع السكان الخلية. بناء بوابة حول هذه الفئة من السكان.
- تحليل عينة سيطرة أحادية اللون لكل تألقي من أجل وضع تعويض مضان.
- تحليل العينة الملون لتحديد موقف من البوابات للفرز.
- إضافة إلى PI العينة الملون من أجل وصمة عار الخلايا الميتة.
- فرز السكان الخلية المسمى. ترتيب إما إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي أو أنابيب مخروطية (15 مل) التي تحتوي على مستنبت.
- وقف الفرز مرة واحدة وقد تم الحصول على الكمية المطلوبة من خلايا يدويا.
- لناFACS جي، إجراء فحص النقاء من خلال تحليل جزء صغير (على سبيل المثال، 500 خلية) من سكان الخلية المكتسبة.
ملاحظة: هذه الخطوة تؤكد على نقاء السكان الخلية فرزها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون النقاء أكبر من 90-95٪. - خلايا الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية التالية مباشرة الانتهاء من الفرز وresuspend في 1 مل من المتوسط الطازجة تحتوي على 10٪ FBS.
ملاحظة: يمكن زيادة كمية سائل الإعلام المستخدمة على أساس حجم الخلية بيليه. - لوحة على لوحات الجيلاتين المغلفة لتحسين بقاء الخلية. اعتمادا على محصول خلية النهائي، لوحة 300،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا، 100،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 12-جيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام CD90 كعلامة للخلايا مع تعزيز النتائج تكون العظم في عزلة من سكان عالي التخصيب من ASCS الإنسان (الشكل 1A، 1B). كانت ملطخة ASCS مع باسيفيك بلو-مترافق CD45 مكافحة الإنسان، FITC مترافق CD105 مكافحة الإنسان، وAPC-مترافق CD90 مكافحة الإنسان. بعد الفرز، وكان مستوى من النقاء أكبر من 98٪، كما كميا عن طريق تحليل ما بعد الفرز.
تحديد مجموعات من الخلايا استنادا لمحات النسخي يسمح لعزل المحتملين اثنين من مجموعات سكانية فرعية جديدة. لتوصيف إمكانية المكونة للعظم من كل حيوانية واعد (CD90 + وCD105 منخفض)، فضلا عن أن السكان لم يتم فرزها في المختبر، كانت الخلايا المستزرعة في عظمي المنشأ متوسطة التمايز لمدة 14 يوما، كما هو موضح سابقا 6،8،9. تم زيادة القلوية تلطيخ الفوسفاتيز (التي تستخدم للكشف المبكر عن تكوين العظام 10) في يوم 7 بشكل كبير في CD90 + (الشكل 2A). وقد لوحظ ذلك على حد سواء بشكل فاضح وبعد الكمي (الشكل 2A). وبالمثل، أظهر الصبغ الأحمر الأحمر تلطيخ (مقايسة تستخدم لكشف الخلية تمعدن المصفوفة ومقياس للنهاية الطرفية التمايز عظمي المنشأ 9) في يوم 14 أن CD90 + ASCS تمكنوا من يتمعدن كمية أكبر بكثير من المصفوفة خارج الخلية (الشكل 2B). ASCS معزولة تحتفظ القدرة على الخضوع المكونة للعظم التمايز بعد الفرز ولكنها قد تتطلب بضعة أيام للتعافي. ومن الضروري لأداء جميع التجارب مزيد من بخلايا مرور منخفضة، كما تصبح ASCS هرمة خلال نشر في الثقافة.
الشكل (1): وضعت (A) بوابات حجم الخلية والتعقيد لاستبعاد الحطام الخلية وعزل س السكانو الخلايا واحد لمزيد من التحليل. (ب) تحليل FACS من أحادية فرز CD90 (يسار) واحد فرز CD105 (يمين) ASCS 36 ساعة بعد الحصاد ASC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: (A) تلطيخ الفوسفاتيز القلوية (أعلى) والكمي (القاع) من ASCS بعد 7 أيام من الثقافة في عظمي المنشأ المتوسطة التمايز (B) الصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر (أعلى) والكمي لتلطيخ (القاع) من ASCS بعد 14 يوما. الثقافة في عظمي المنشأ المتوسطة التمايز. CD90 + ASCS وCD105 خلايا المنخفضة تظهر زيادة تلطيخ الفوسفاتيز القلوية وخارج الخلية مصفوفة تمعدن مقارنة مع الخلايا التي لم يتم فرزها (* P <0.05، واثنان الذيل الطالباختبار t). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حاليا، وعزل مجموعات سكانية فرعية متجانسة من ASCS من صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان لا يزال يشكل تحديا على الرغم من الهدف المرغوب فيه. عزلة المجموعات السكانية الفرعية ASC الموالية للالمكونة للعظم أمر مرغوب فيه بشكل خاص، كما مثل هذه الخلايا يمكن استخدامها لدراسة تشكيل والتوازن من الأنسجة العظمية. ومع ذلك، فإن صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية المرافئ عدم تجانس كبير فيما يتعلق كبح قدرة الخلايا وإمكانية التمايز. 11 والأساس الجزيئي لهذا التجانس لا يمكن أن يفهم من سكان المجمعة من الخلايا، وبدلا من ذلك يتطلب تحليل خلية واحدة. 12 مع هذا النهج، علامات سطح ترتبط ارتباطا وثيقا ويمكن تحديد قدرة التمييز المكونة للعظم من ASCS.
العامل الأكثر أهمية لتخصيب الناجح لASCS، كما هو موضح في الأسلوب أعلاه، هو ذات الصلة إلى الأجسام المضادة المستخدمة لFACS. يجب على المرء أن يكون من الحكمة لتحديد الأجسام المضادة مع قابلية عالية للسلعلامة ل سطح في السؤال. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون الضد مترافق الأساسي بدلا من طريقة تلطيخ غير مباشر، الأمر الذي يتطلب خطوات متعددة، وبالتالي، وزيادة فرصة موت الخلايا، وفقدان الخلايا والخطأ الاستحقاق. وعلاوة على ذلك، يمكن للتعديلات طفيفة خلال FACS زيادة قابلية الخلية. وتشمل هذه الفرز في وعاء بارد، وحفظ الخلايا على الجليد في جميع الأوقات، والفرز الخلايا في الأوعية التي تحتوي على وسائل الإعلام والثقافة، وأيضا، والطلاء على السكان الخلية حصلت على لوحات ثقافة التي تم المغلفة قبل مع 10٪ الجيلاتين. من المهم إجراء تحليل النقاء بعد الفرز، وذلك لضمان نقاء من الخلايا فرزها.
وهذه التقنية محدودة بسبب توافر المعدات والخبرات FACS داخل مرفق. وعلاوة على ذلك، حيث أن العينات الأولية غير متجانسة، فإن التعبير عن علامات سطح تغيير على أساس فردي. كما سبق ذكره، فمن الضروري لأداء جميع التجارب مع الخلايا مرور منخفضة، كما ASCالصورة تهرم خلال نشر في الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المعروف أن ASCS يحمل تحولا في التعبير المظهري في المختبر تحت الظروف التي قد يغير بيولوجيا الخلايا الجذعية. وهكذا، على الترجمة السريرية، فإنه سيكون الأمثل للحصول على السكان الخلية عالي النقاء لزرع المباشر أو البذر الخلية إلى سقالة دون الحاجة للزراعة في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كميات كبيرة من lipoaspirate التي تحتاج إلى معالجة لعزل SVF يمكن أن تكون مرهقة لغير المطلعين على هذه التقنية، كما تمت مناقشته وZuk وزملاؤه تناولها في منشور صدر مؤخرا (13). وفقا للطريقة التي وصفها Zuk وآخرون، يمكن بسهولة أن تحجيم هذا البروتوكول أعلى أو لأسفل لاستيعاب حجم lipoaspirate ويمكن تكييفها لعزل ASCS من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من خلال abdominoplasties وغيرها من الإجراءات المماثلة.
وقد سبق تحديد CD90 وCD105 في وقت مبكر الوسيطة الجذعية جعلامات الذراع، سواء في BM-MSC والسكان ASC. وتمشيا مع الأبحاث السابقة، وCD90 + السكان يمثل ما يقرب من 50٪ من صندوق التبرعات الخاص المعزولة حديثا 14 وفي المقابل، أعرب فقط حوالي 5-10٪ من SVF الأولي CD105. 6 والجدير بالذكر، مع مقاطع متتالية، CD105 التعبير زاد بسرعة من تقريبا صفر إلى التعبير في كل مكان تقريبا بعد 4-7 أيام في الثقافة. ومن المعروف أن ASCS يحمل الانجراف المظهري كبيرا خلال التوسع في المختبر، الأمر الذي قد يغير بيولوجيا الخلايا الجذعية. 15-17 ومن الناحية المثالية، والتطبيقات السريرية للخلايا الجذعية من شأنه أن ينطوي على استخدام الفوري من السكان الخلية المنقى لزرع المباشر أو البذر على سقالة ، دون الحاجة للزراعة في المختبر. النسبة المئوية للخلايا CD90 + قد تختلف بين العينات lipoaspirate مختلفة في تعتمد على مستودع أصل الدهون أو بطريقة تعتمد على العمر. ومع ذلك، وذلك باستخدام CD90 كعلامة سطح الخلية يسمح لس التخصيباتحاد كرة القدم حيوانية من ASCS الإنسان مع تعزيز إمكانات المكونة للعظم. هذا الأسلوب من تخصيب عظمي المنشأ لديه القدرة على أن تكون بمثابة رواية سيلة لتعزيز تكوين العظام السريع والقوي في المرضى الذين يعانون من عيوب هيكلية حرجة الحجم. ونلاحظ بشكل روتيني أن العائد خلية تقريبي من lipoaspirate القياسية هو 5 × 10 7 خلايا الأنوية / 500 مل من lipoaspirate باستخدام طريقة الحصاد المذكور، على الرغم من النحو المبين أعلاه وهذا يمكن أن تختلف على أساس الأصل مستودع الدهون أو التركيبة السكانية للمرضى. وأفاد 18 يوشيمورا وزملاؤه ان ASCS تمثل 10-35٪ من السكان الخلايا الأنوية في 19 لذلك SVF.، هناك إمكانيات كبيرة لالبذر المباشر من سقالة لتنفيذ استراتيجيات هندسة الأنسجة العظمية التالية تخصيب عظمي المنشأ من ASCS باستخدام FACS.
وقف هندسة الأنسجة القائمة على خلية للتطبيقات التجريبية والسريرية وغالبا ما يتطلب السكان الخلية عالي النقاء. البعض مرحباتوجد طرق GH-مرت من تنقية كبدائل لأبسط FACS، وتشمل بالغسل، واستنزاف مكملا، وخلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MACS). ومع ذلك، في بعض الحالات، FACS أصبح من الضروري والمفيد: عند رغبتك فى عزلة المجموعات السكانية الفرعية نقية للغاية، عند حدوث علامة سطح الهدف من النادر في السكان الخلية، أو عندما يجب فصل الخلايا استنادا متفاوتة مستويات التعبير من نفس السطح علامة.
تم العثور على استخدام كلا على أساس ميكروفلويديك خلية واحدة تحليل النسخي ومضان تنشيط الخلايا الفرز، endoglin (CD105) وخاصتك-1 (CD90) لتترافق مع وجود اختلافات في ASC التعبير عن الجينات المكونة للعظم. أظهر التحليل الإحصائي للخلية واحدة لمحات النسخي هذا التعبير انخفاض CD105 والتعبير عالية من CD90 وصف مجموعات فرعية من ASCS مع زيادة القدرات المكونة للعظم. واستخدمت هذه البروتينات في وقت لاحق لإثراء لمجموعات سكانية فرعية من الخلايا المكونة للعظم دerived من الأنسجة الدهنية تحت الجلد الإنسان. 6،20
معا، وتوضح هذه البيانات فعالية فرز ASCS على أساس علامات محددة سطح الخلية التي ترتبط مع النشاط النسخي عظمي المنشأ. على الرغم من أن أثبتت جدوى هذا النهج هنا من خلال استخدام CD90 وCD105 كأمثلة، يحتاج إلى مزيد من التحليل الذي يتعين القيام به ليشمل جميع توليفات واعدة من سطح المستضد التعبير التي ترتبط إلى حد كبير مع النشاط النسخي عظمي المنشأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أي من الكتاب لديهم مصلحة مالية في أي من المنتجات والأجهزة وأو المخدرات المذكورة في هذه المخطوطة. أي من الكتاب لديه أي مصلحة مالية المتنافسة لتقديم تقرير.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للبحوث الصحية منحة R01-DE021683-01 والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية منحة R01-DE019434 إلى MTL. وأيد زمالة أبحاث معهد هوارد هيوز الطبي لMTCDCW من قبل فرانكلين مارتن كلية زمالة ACS البحوث، ومختبر Hagey للأطفال الطب التجديدي، وجائزة معهد بحوث صحة الطفل بجامعة ستانفورد كلية إجابات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
References
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
- Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
- Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
- Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
- Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
- Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
- James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720 (2009).
- Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
- Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211 (2011).
- Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585 (2013).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
- Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
- McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
- Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).
- Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
