隔离和人力富集脂肪基质细胞的成骨增强

Protocol

注：所有患者的样品与知情同意而获得的，和实验方案进行了审查并批准了斯坦福大学的机构审查委员会（议定书＃2188和＃9999）。

1.细胞分离培养：

1. 获得健康的女性患者在局部/全身麻醉进行腹部，胁肋，和/或大腿区域的选修lipoaspiration人类皮下脂肪组织。确保机构审查委员会（IRB）的批准已经从人体组织隔离携带者的协议获得的，并按照机构的安全防范措施，而这种材料的工作。
2. 以获得从lipoaspirated脂肪组织的SVF，先洗吸脂物三次1×无菌磷酸盐缓冲盐水等体积（PBS）中。小心吸弃底部水层。
3. 准备胶原酶消化缓冲液：0.075％I型胶原酶在汉克的平衡盐溶液（HBSS）中。制备FACS缓冲液：2％FBS，1％P188和1％青霉素 - 链霉素的PBS。过滤用市售0.22μm孔径快速流动聚醚砜过滤器这两种解决方案。
4. 消化洗涤脂肪组织，安全地在振荡水浴60分钟，在37℃（大约180摇动/分钟）添加的胶原酶消化缓冲等体积并放置消化容器中。
   注：它是最好使用较大体积的消化容器比要求，因为这允许对最大消化振荡期间（ 即 ，加入250毫升的胶原酶消化缓冲，加入250毫升洗涤脂肪组织中的1L无菌烧瓶）。
5. 通过加入的FACS缓冲液等体积​​并允许坐在RT 5分钟中和酶的活性。接着，在离心机233×g离心20分钟，在4℃。
6. 小心吸弃上清，注意不要打扰高密度SVF颗粒。
7. 悬浮颗粒在5-10毫升RT红细胞裂解缓冲液，是根据粒料的大小。离开溶液坐在RT 5分钟，并离心在233×g离心5分钟，在室温。
8. 吸去上清液，并通过加入5-10毫升的传统的生长培养基的基础上，丸粒尺寸重悬沉淀（Dulbecco氏改良的Eagle培养基[DMEM] / 10％FBS / 1％青霉素 - 链霉素溶液〔笔链球菌]）。
9. 通过100微米的尼龙细胞过滤器过滤该悬浮液以去除细胞碎片。
10. 离心机在233×g离心5分钟，在4℃下，并弃去上清液而不扰乱沉淀。
11. 悬浮颗粒在5-10毫升的传统媒体增长的基础上，颗粒大小。
12. 放置2×10 ⁶个细胞在15cm的标准培养皿，并建立原代培养物O / N在37℃/ 21％O _2，5％的CO _2。保持在亚汇合的水平，以防止自发分化，在37℃/ 21％O _{2，5％CO 2}中生长培养基。
    注：在一个完全细胞密度汇合15厘米板是约4-6×10 ^6个细胞。

2.染色

1. 染色前培养的ASCs在传统生长培养基，在37℃/ 21％O _2，5％的CO _2中 ，36小时/排序。
2. 从培养板使用的Accutase（按照制造商的协议）电梯携带者。
3. 一旦用FACS缓冲液（PBS，2％FBS和1％青霉素 - 链霉素）洗涤细胞。
4. 离心机在233×g离心5分钟，在4℃。
5. 弃去上清液而不扰乱沉淀。将细胞重悬于0.5-1毫升FACS缓冲液（取决于细胞数和抗体的期望的量）。
   注：细胞悬浮液的体积，按照用FACS抗体生产商的建议，确定抗体浓度。然而，滴定抗体浓度，使用1起始浓度：100，通常建议，如果它是第一次使用的抗体。
6. 计数的总数目使用血球细胞。
7. 用于未染色样品与单色彩控制（根据所使用的荧光抗体的数量）在1.5ml的离心管储备100微升等分试样。
8. 添加适当的荧光标记的单克隆抗体（以预定的浓度，每制造商的说明），并孵育20-30分钟在冰上，避光。
   1. 标记成骨细胞亚群的稀释：抗CD90（APC抗 - 人CD90（Thy1肾炎））或抗CD105（FITC抗 - 人CD105（内皮糖蛋白））在FACS缓冲液以1:50的浓度。
   2. 来标记其它的细胞群（ 例如 ，造血细胞和内皮细胞）的稀释：抗CD45（抗人CD45太平洋蓝），抗CD34（抗人CD34 APC），和/或抗CD31（抗人CD31 PE ）在FACS缓冲液以1:50的浓度。
   3. 如果不使用直接标记的抗体，使用生物素化初级抗体用适当的链霉亲和共轭二进制抗体，如链霉亲和PE-Cy7的，在稀释度为1：100。
9. 在4℃下填充管用FACS缓冲液，并离心在233×g离心5分钟，吸上清：温育后，洗细胞两次。
10. 通过一个70微米的尼龙细胞过滤悬浮细胞在400-500微升FACS缓冲和过滤样品以去除细胞团块。
11. 转移标记的细胞进入FACS管，带过滤器的顶部和保持样品在冰上进行分析的持续时间。

3.荧光激活细胞分选

注意：下面的步骤强制以前的知识在荧光激活细胞分选（FACS）或熟练的技术人员的协助。

1. 使用适当的FACS软件，设计分析图检查前向散射（FSC），侧向散射（SSC），藻红蛋白（PE）-Texas红，蓝太平洋，异硫氰酸荧光素（FITC），别藻蓝蛋白（APC）以及其他任何使用荧光ð标记细胞。
2. 之前加载到细胞分选仪，简要地涡旋每个样品重悬细胞。
3. 与未染色样品的分析，以便确定门的总细胞群，以排除细胞碎片，并确定基线自发荧光展开。
4. 加入碘化丙啶（PI）至未染色样品，并将其进行分析，以可视化的总细胞群中活细胞的群体。构建解决这个人口大门。
5. 为了设置荧光补偿每个荧光染料的单色对照样品分析。
6. 染色样品设置门的位置进行排序分析。
7. 加入PI的染色样品，以染色死细胞。
8. 分类标记的细胞群。排序成为1.5毫升离心管中，或含有培养基锥形管（15ml）中。
9. 手动停止一旦已经获得了所需的细胞数量排序。
10. 我们荷兰国际集团的FACS，通过分析一小部分（ 例如 ，500个细胞）所获得的细胞群进行纯度检查。
    注：此步骤确认排序细胞群的纯度。理想情况下，纯度应大于90％-95％。
11. 离心细胞，在233×g离心5分钟，在4℃下排序的完成和重悬后立即在1ml含有10％FBS的新鲜培养基中。
    注意：使用介质的量可根据细胞沉淀的尺寸增大。
12. 板在明胶包被的板，以提高细胞生存力。取决于最终的细胞产量，板300000细胞每孔在6孔板中，每孔100,000个细胞在12孔板中。

Representative Results

使用CD90作为标记的细胞具有增强成骨结果在人的ASC（ 图1A，1B）的高度富集的群体的隔离。携带者沾满太平洋蓝偶联的抗人CD45，FITC缀合的抗人类CD105，和APC缀合的抗人CD90。排序后，纯度水平大于98％，如通过量化后的排序分析。

定义的基础上允许两种新型亚群的前瞻性孤立转录谱细胞群体。表征每个亚群有前途的（CD90 ⁺和CD105 ^低 ）的成骨潜力，以及作为该未分类的种群在体外 ，细胞在成骨分化培养基中培养14天，如先前所描述^6,8,9。碱性磷酸酶染色（用于早期发现骨形成^10）在7天的CD90 ⁺是显著增加图2A）的人口。这个观察既严重和定量（ 图2A）以后。同样，茜素红染色，在第14天（用于检测细胞外基质的矿化和一个度量为终端终端的成骨分化⁹的测定法）表明，CD90 ⁺携带者能矿化一个显著更大量的细胞外基质（ 图2B）的。隔离携带者保留排序后经过成骨分化的能力，但可能需要数天才能恢复。有必要执行所有进一步的实验以低传代细胞，在培养中繁殖期间作为携带者成为衰老。

图1：（A）盖茨细胞的大小和复杂程度被吸引，以排除细胞碎片和隔离人群Ø˚F单个细胞进行进一步的分析。（B）单排序CD90（左）和单排序CD105（右）携带者36小时ASC收获后的FACS分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：（A）碱性磷酸酶染色（顶部）和7天之后在培养的成骨分化培养基中的ASC的定量（底部）（B）中的ASC的茜素红染色（顶部）和染色（底部）的量化后的14天。文化在成骨分化培养基。 CD90 ⁺的ASC和CD105 ^low细胞显示增加碱性磷酸酶染色和细胞外基质的矿化比未分选的细胞（* P <0.05;双尾学生的t检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

目前，来自人体脂肪组织的SVF的ASC的均质亚群的分离仍然虽然期望目标的一个具有挑战性的。亲骨ASC亚隔离是特别理想的，因为这样的细胞可用于研究骨骼肌组织的形成和稳态。然而，脂肪组织的SVF窝藏显著异质对于干细胞的能力和分化潜能^。11这种异质性的分子基础，不能从细胞的混合种群的理解，而是需要单细胞分析¹²用这种方法，表面标志物与先进的结构陶瓷的成骨分化能力，可以识别密切相关。

为携带者的成功富集的最关键的因素，如在上述方法中描述，是涉及到用于FACS的抗体。一个必须谨慎地选择抗体的CEL高亲和力升表面标记物中的问题。理想的情况下，它应该是相对于一个间接染色方法，该方法需要多个步骤，因此，细胞死亡，细胞损失和误差累积的增加的机会的初级结合的抗体。此外，FACS期间稍作修改可提高细胞活力。这些包括分拣成凉爽容器，在任何时候都在冰上保持细胞，分选的细胞在其中含有培养基和还插座，镀上培养板所获取的细胞群已预先涂敷有10％的明胶。它执行后排序纯度分析，以确保在分选的细胞的纯度是重要的。

这种技术是通过FACS设备和专业技术范围内的设施的可用性的限制。另外，作为主要的样品是异质的，表面标志物的表达将改变以个人为基础。如前面提到的，这是至关重要的，以执行与低传代细胞的所有实验中，作为ASCS IN文化传播过程中变得衰老。此外，已知的是携带者表现出的表型表达的移位在体外条件下，可能会改变干细胞生物学。因此，对于临床的翻译，这将是最佳的，以获得高度纯化的细胞群体用于直接移植或细胞接种到支架而不需要在体外培养。此外，脂肪抽吸物的大体积，需要加以处理以分离出SVF可以是繁重的那些不熟悉的技术中，如所讨论的，并通过ZUK及其同事在最近的出版物¹³寻址。按照由Zuk 等人描述的方法。，该协议可以很容易地放大或缩小，以适应脂肪抽吸物的体积，并可以适于从通过abdominoplasties和其他类似的方法获得的脂肪组织分离的ASCs。

CD90和CD105先前已鉴定为初期充质干ÇELL标志，无论是在BM-MSC和ASC人群。在保持与先前的研究中，CD90 ⁺群体表示的新鲜分离的SVF的约^50％。14相反，只有约5％-10％的初始SVF表达CD105 ⁶值得注意的是，在连续的通路，CD105表达迅速从几乎增加零到近无处不在的表达4-7天后的文化。已知的是携带者中的体外扩增 ，其可改变干细胞的生物学表现出相当大的表型漂移^。15-17理想的是，干细胞的临床应用将在棚架涉及立即使用纯化的细胞群体用于直接移植或播种的，而不需要在体外培养。 CD90 ⁺细胞的百分比可在脂肪库依赖性起源不同脂肪抽吸物样品或年龄依赖性之间变化。然而，使用CD90作为细胞表面标记允许富集ö发亚群人类携带者具有增强成骨潜能。成骨富集的这种方法具有作为一种新颖的装置，用于促进快速和坚固的骨形成患者的临界尺寸的骨骼缺陷的可能性。我们经常观察从标准脂肪抽吸物即近似细胞产量是5×10 ⁷个有核细胞/500毫升使用上述的收获方法脂肪抽吸物，虽然上述这种描述可以基于脂肪库起源或病人的人口统计而有所不同^。18吉村和同事报道说ASC的代表有核细胞在SVF ¹⁹所以人口的10-35％，有以下使用FACS携带者的成骨富集相当大的潜力棚架的实施骨组织工程战略的直接播种。

茎实验和临床应用基于细胞的组织工程往往需要高度纯化的细胞群。其它喜纯化的GH通量方法存在以FACS简单的替代品，包括平移，补体耗竭，和磁性激活细胞分选（MACS）。然而，在某些情况下，流式细胞仪是必要的和有利的：当对高纯度的亚群的分离是需要的，当目标表面标志不常发生在细胞群，或当细胞必须分开以在同一表面上的不同的表达水平标记。

同时使用微流体基单细胞转录分析和荧光激活细胞分选，内皮糖蛋白（CD105）和THY-1（CD90）被发现与在成骨基因的ASC表达的差异有关。单细胞转录谱的统计分析表明，CD105和高表达CD90的低表达描述的ASC具有增加骨容量的子组。这些蛋白质随后被用来富集的细胞成骨细胞亚群ð从人体皮下脂肪组织^{erived。6,20}

总之，这些数据说明基于与成骨转录活性相关的特定细胞表面标记分选的ASC的有效性。虽然这种方法的可行性，在此展示了通过使用CD90和CD105的作为例子，进一步的分析需要做，以包括表面抗原表达的所有有希望的组合是高度关联与成骨转录活性。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences