Protocol
NOTA: Todas as amostras dos pacientes foram obtidos com o consentimento informado, e os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Stanford University Institutional Review Board (Protocolo nº 2188 e # 9999).
1. Isolamento celular e Cultura:
- Obter tecido adiposo subcutâneo humano de pacientes saudáveis do sexo feminino submetidos a lipoaspiração eletiva do abdômen, flanco, e / ou região de coxa sob anestesia local / geral. Certifique-se de que Institutional Review Board (IRB) a aprovação foi obtida para o protocolo de isolar ASC de tecidos humanos, e siga as precauções de segurança institucionais ao trabalhar com esses materiais.
- Para obter o SVF a partir do tecido adiposo lipoaspirated, lava-se a primeira lipoaspirado três vezes com volumes iguais de solução salina tamponada 1x com fosfato estéril (PBS). Aspirar cuidadosamente e descartar a camada aquosa inferior.
- Preparar o tampão de digestão de colagenase: 0,075% de colagenase do Tipo I em HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampão de FACS: 2% de FBS, 1% P188 e 1% de Pen-Strep em PBS. Filtrar ambas as soluções através de um tamanho de poro de 0,22 um fluxo rápido filtro polietersulfona disponível comercialmente.
- Para digerir o tecido adiposo lavada, adicionar um volume igual de tampão de digestão com colagenase e colocar vaso de digestão de forma segura em um banho de água com agitação durante 60 min a 37 ° C (cerca de 180 agitações / min).
NOTA: É melhor utilizar um vaso de digestão volume maior do que o necessário, pois isso permite uma digestão durante a agitação máxima (isto é, 250 ml de tampão de digestão com colagenase, de 250 ml de tecido adiposo lavado em um frasco estéril 1L). - Neutraliza-se a actividade enzimática por adição de um volume igual de tampão de FACS e permitindo a sentar-se à TA durante 5 min. Em seguida, centrifugar a 233 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o SVF pellet de alta densidade.
- Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de RT vermelhocélulas de tampão de lise, com base no tamanho da pelota. Deixar a solução sentar à temperatura ambiente durante 5 min e centrifugar a 233 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento, adicionando 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho da pelota (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / FBS a 10% / 1% de solução de penicilina-estreptomicina [pen-strep]).
- Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 100 mm de nylon para remover os detritos celulares.
- Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho do sedimento.
- Coloque 2 x 10 6 células em uma placa de cultura de 15 centímetros padrão e estabelecer culturas primárias O / N a 37 ° C / 21% de O2, 5% de CO 2. Mantém-se a níveis sub-confluente para impedir a diferenciação espontânea a 37 ° C / 21% de O2, 5% de CO 2 em meio de crescimento.
A densidade celular em um plenamente: NOTAconfluente 15 centímetros da placa é de aproximadamente 4-6 x 10 6 células.
2. Coloração
- ASC Cultura em meio de crescimento tradicional, a 37 ° C / 21% de O2, 5% de CO 2, por 36 horas antes da coloração / classificação.
- ASC carona de placas de cultura utilizando Accutase (de acordo com o protocolo do fabricante).
- Lave as células uma vez com tampão de FACS (PBS com 2% de FBS e 1% de pen-strep).
- Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender as células em 0,5-1 mL de tampão de FACS (dependendo do número de células e a quantidade de anticorpo desejado).
NOTA: O volume da suspensão de células, de acordo com as recomendações do fabricante do anticorpo FACS, determina a concentração de anticorpos. No entanto, a titulação da concentração de anticorpo, utilizando uma concentração de partida de 1: 100, é normalmente aconselhada se é a primeira vez que a utilização de um anticorpo. - Contar o número total decélulas utilizando um hemocitómetro.
- Reserva alíquotas de 100 ul em tubos de 1,5 ml de centrífuga a ser utilizado para uma amostra não corado e controlos de cor única (de acordo com o número de anticorpos fluorescentes utilizados).
- Adicionar os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência adequados (em concentrações pré-determinadas, segundo as instruções do fabricante) e incubar durante 20-30 minutos em gelo, protegida da luz.
- Para etiquetar subpopulação osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humano (endoglina)) em tampão de SCAF até uma concentração de 1:50.
- Para identificar as outras populações de células (por exemplo, hematopoiética e células endoteliais): Diluir anti-CD45 (anti-CD45 humano do Pacífico azul), anti-CD34 (anti-CD34 humano APC), e / ou anti-CD31 (anti-humano CD31 PE ) em tampão de FACS para uma concentração de 1:50.
- Se não utilizando anticorpos directamente conjugados, utilizar um anticorpo primário biotinilado com um segundo conjugado de estreptavidina-apropriadaanticorpo ária, tal como estreptavidina PE-Cy7, a uma diluição de 1: 100.
- Após a incubação, lavar as células duas vezes: encher os tubos com tampão de SCAF e centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, o sobrenadante por aspiração.
- Ressuspender as células em 400-500 amostras ul FACS tampão e filtro através de um 70 um filtro de células nylon para remover aglomerados de células.
- Transferir células marcadas em tubos de FACS com topo do filtro e manter as amostras em gelo durante a duração da análise.
3. activadas por fluorescência celular
NOTA: Os passos seguintes mandato conhecimento prévio em células activadas por fluorescência (FACS) ou a assistência de um técnico especializado.
- Usando o software FACS adequadas, parcelas de análise de projeto para examinar dispersão para a frente (FSC), dispersão lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Blue Pacific, Fluorescein Isothiocyanate (ITCF), aloficocianina (APC) e qualquer outro uso fluorophored para marcar as células.
- Antes de carregar no separador de células, brevemente vórtice cada amostra para voltar a suspender as células.
- Começar com a análise da amostra não corado, de modo a definir portas para a população total de células, para excluir os detritos celulares, e para determinar a linha de base da autofluorescência.
- Adiciona-se iodeto de propídio (PI) para a amostra não corado e analisá-lo, a fim de visualizar a população de células vivas na população total de células. Construir um portão em torno desta população.
- Analisar uma amostra de controlo de cor única para cada fluorocromo, a fim de definir a compensação de fluorescência.
- Analisar a amostra corada para definir a posição de portas para a classificação.
- Adicionar PI para a amostra corada de forma a corar as células mortas.
- Organize as populações de células marcadas. Separar por quer tubos de 1,5 ml de centrífuga ou tubos cónicos (15 ml) contendo meio de cultura.
- Cessar a triagem manual, uma vez a quantidade necessária de células foi obtido.
- Nósing FACS, executar uma verificação de pureza por análise de uma pequena fracção (por exemplo., células 500) da população de células obtidas.
NOTA: Este passo confirma a pureza das populações de células classificadas. Idealmente, a pureza deverá ser superior a 90-95%. - Centrifugar células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C imediatamente após a conclusão de triagem e ressuspender em 1 ml de meio fresco contendo 10% de FBS.
NOTA: A quantidade de material utilizado pode ser aumentado com base no tamanho do sedimento celular. - Placa em placas revestidas com gelatina para melhorar a viabilidade celular. Dependendo do rendimento celular final, a placa de 300.000 células por cavidade em uma placa de 6 poços, 100000 células por poço numa placa de 12 poços.
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Representative Results
Usando CD90 como um marcador para células com melhores resultados de osteogénese no isolamento de uma população altamente enriquecidas de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC foram coradas com azul-Pacífico CD45 conjugado anti-humano, conjugado com FITC anti-CD105 humano, e CD90 anti-humano conjugado com APC. Após a separação, o nível de pureza foi superior a 98%, tal como quantificado por análise post-tipo.
Definição de grupos de células com base em perfis de transcrição permitiu o isolamento prospectivo de duas novas subpopulações. Para caracterizar o potencial osteogénico de cada subpopulação promissor (CD90 + CD105 e baixo), bem como a da população não triados in vitro, as células foram cultivadas em meio de diferenciação osteogénica durante 14 dias, como previamente descrito 6,8,9. Coloração da fosfatase alcalina (utilizado para a detecção precoce da formação de osso 10) no dia 7 foi significativamente aumentada no CD90 + (Figura 2A). Isto foi observado tanto grosseira e depois a quantificação (Figura 2A). Do mesmo modo, a coloração de alizarina vermelha (um ensaio utilizado para detectar a mineralização da matriz extracelular e uma métrica de diferenciação osteogénica-terminal 9) no Dia 14 mostrou que CD90 + ASC foram capazes de mineralizar uma significativamente maior quantidade de matriz extracelular (Figura 2B). Isolado ASC reter a capacidade para sofrerem diferenciação osteogénica depois da triagem, mas podem requerer alguns dias para recuperar. É essencial para realizar todas as outras experiências com células de baixa passagem, como ASC tornam-se senescentes durante a propagação em cultura.
Figura 1: (A) Os portões de tamanho celular e complexidade foram desenhados para excluir os detritos celulares e isolar um o Populaçãof células individuais para análise posterior. (b) a análise FACS de single-classificadas CD90 (esquerda) e single-classificadas CD105 (à direita) ASC 36 hr após ASC colheita. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: (A) Coloração com fosfatase alcalina (topo) e quantificação (inferior) de ASC após 7 dias de cultura em meio de diferenciação osteogénica (B) coloração com vermelho de alizarina (topo) e quantificação da coloração (fundo) de ASC após 14 dias. de cultura em meio de diferenciação osteogênica. ASC CD90 + CD105 e as células mostram um aumento de coloração baixas fosfatase alcalina e mineralização da matriz extracelular em comparação com células não triados (* p <0,05; bicaudal do estudante det-teste). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Actualmente, o isolamento de subpopulações homogéneas de ASC de SVF de tecido adiposo humano continua a ser um desafio embora objectivo desejável. Isolamento de subpopulações ASC pró-osteogénicas é particularmente desejável, uma vez que tais células podem ser utilizadas para estudar a formação e a homeostase do tecido esquelético. No entanto, o SVF de tecido adiposo abriga heterogeneidade significativa no que diz respeito a conter capacidade celular e potencial de diferenciação. 11 A base molecular para esta heterogeneidade não pode ser entendida a partir de populações agrupadas de células e, em vez requer análise única célula. 12 Com esta abordagem, marcadores de superfície intimamente associada com a capacidade de diferenciação osteogénica de ASC pode ser identificado.
O factor mais crítico para o sucesso de enriquecimento ASC, como descrito no método acima, está relacionada com os anticorpos utilizados por FACS. Deve ser prudente seleccionar um anticorpo com uma elevada afinidade para o celmarcador l-superfície em questão. Idealmente, deve ser um anticorpo conjugado primária em oposição a um método de coloração indireta, o que requer várias etapas e, portanto, maior chance de morte celular, perda de células e erro de competência. Além disso, pequenas alterações durante FACS pode aumentar a viabilidade celular. Estes incluem triagem para um recipiente fresco, mantendo-se as células em gelo em todos os momentos, a triagem de células em recipientes que contêm os meios de cultura e também, plaqueamento das populações de células em placas de cultura de adquiridos que tenham sido pré-revestidos com 10% de gelatina. É importante a realização de uma análise da pureza de pós-tipo, a fim de assegurar a pureza das células separadas.
Esta técnica é limitada pela disponibilidade de equipamentos e conhecimentos FACS dentro de uma instalação. Além disso, como as amostras primárias são heterogéneos, a expressão de marcadores de superfície irá mudar numa base individual. Como acima mencionado, é essencial para realizar todas as experiências com as células de passagem baixa, como ASCs tornam-se senescentes durante a propagação da cultura. Além disso, sabe-se que as ASC exibem uma mudança na expressão fenotípica em condições in vitro que podem alterar a biologia das células estaminais. Assim, para a tradução clínico, seria ideal para obter uma população altamente purificada de células para transplante ou sementeira directa célula a um andaime, sem a necessidade para o cultivo in vitro. Além disso, os grandes volumes de lipoaspirado que precisam ser processados para isolar o SVF pode ser pesada para aqueles não familiarizados com a técnica, como discutido e abordado por Zuk e colegas em uma publicação recente 13. De acordo com o método descrito por Zuk et ai., Este protocolo pode ser facilmente ajustados para cima ou para baixo para acomodar o volume de lipoaspirado e pode ser adaptado para isolar as ASC obtidas a partir de tecido de gordura por meio de abdominoplasties e outros processos semelhantes.
CD90 e CD105 foram previamente identificados o mais cedo c-tronco mesenquimaisell marcadores, tanto em populações ASC BM-MSC e. De acordo com a investigação anterior, a população CD90 + representou cerca de 50% de SVF isolada de fresco 14 Em contraste., Apenas cerca de 5-10% de SVF inicial expressa CD105. 6 Notavelmente, com passagens sucessivas, a expressão de CD105 aumenta rapidamente a partir de quase zero a expressão quase onipresente após 4-7 dias em cultura. Sabe-se que as ASC exibem importante desvio fenotípico durante a expansão in vitro, as quais podem alterar a biologia das células estaminais. 15-17 Idealmente, aplicações clínicas para as células-tronco envolveria a utilização imediata de populações de células purificadas de transplante ou sementeira directa sobre um andaime , sem a necessidade para o cultivo in vitro. A porcentagem de células CD90 + podem variar entre diferentes amostras lipoaspirado em uma origem dependente do depósito de gordura ou de forma dependente da idade. No entanto, usando CD90 como um marcador da superfície celular permite o enriquecimentofa subpopulação de ASC humanos com potencial osteogênico reforçada. Este método de enriquecimento osteogénico tem o potencial de servir como um novo meio para promover a formação óssea rápida e robusta em pacientes com defeitos esqueléticos críticos de tamanho. Rotineiramente, observa-se que o rendimento de células a partir de lipoaspirado aproximada padrão é de 5 x 10 7 células nucleadas / 500 ml de lipoaspirado usando o método acima mencionado colheita, embora, como acima descrito esta pode variar com base na origem depósito de gordura ou de dados demográficos do paciente. 18 Yoshimura e colegas relataram que ASC representar 10-35% da população de células nucleadas na 19 Portanto SVF., há um considerável potencial para plantio direto de um andaime para a implementação de estratégias de engenharia de tecido ósseo seguinte enriquecimento osteogênico de ASC usando FACS.
Baseada em células de engenharia de tecidos para aplicações experimentais e clínicos têm muitas vezes requer populações de células altamente purificadas. Outros oimétodos gh-rendimento de purificação existem como alternativas mais simples para FACS, incluem panning, esgotamento complemento, e célula magnética ativado triagem (MACS). No entanto, em certas situações, FACS é necessário e vantajoso: quando o isolamento de subpopulações altamente puros é desejada, quando o marcador de superfície alvo raramente ocorre na população de células, ou quando as células devem ser separados com base em diferentes níveis de expressão na mesma superfície marcador.
Utilizando tanto célula única análise de microfluidos à base de transcrição e de triagem de células activadas por fluorescência, endoglina (CD105) e Thy-1 (CD90) foram identificados como associados com as diferenças na expressão de genes ASC osteogénicas. A análise estatística dos perfis de transcrição unicelulares demonstrado que a baixa expressão de CD105 e alta expressão de CD90 descrever subgrupos de ASC com maior capacidade osteogênica. Estas proteínas foram subsequentemente utilizados para enriquecimento em subpopulações de células osteogénicas derived a partir de tecido adiposo subcutâneo humano. 6,20
Juntos, estes dados ilustram a eficácia da triagem ASC com base em marcadores específicos da superfície celular que se correlacionam com a actividade de transcrição osteogénico. Embora a viabilidade desta abordagem é aqui demonstrada através da utilização de CD90 e CD105 como exemplos, uma análise posterior tem de ser feito de modo a incluir todas as combinações promissoras de expressão de antigénios de superfície que altamente correlacionadas com a actividade de transcrição osteogénico.
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Disclosures
Nenhum dos autores têm um interesse financeiro em qualquer um dos produtos, dispositivos ou drogas mencionadas neste artigo. Nenhum dos autores tem qualquer interesse financeiro competindo para relatar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Research concessão R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessão R01-DE019434 para MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship para MTCDCW foi apoiado pela ACS Franklin Martin Faculdade Research Fellowship, O Laboratório Hagey for Pediatric Regenerative Medicine, e do Instituto de Pesquisa de Saúde Infantil da Universidade de Stanford Faculdade Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
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