Protocol
OPMERKING: Alle patiënten monsters werden verkregen met informed consent, en experimentele protocollen werden beoordeeld en door Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188 en # 9999) goedgekeurd.
1. Cell Isolatie en Cultuur:
- Verkrijgen menselijk onderhuids vetweefsel van gezonde vrouwelijke patiënten die een electieve lipoaspiration de buik, flank, en / of de dij regio onder plaatselijke / algemene verdoving. Zorg ervoor dat Institutional Review Board (IRB) goedkeuring is verkregen voor het protocol van het isoleren van ASC's van menselijke weefsels en volg voorzorgsmaatregelen institutionele veiligheid tijdens het werken met deze stoffen.
- De SVF uit de lipoaspirated vetweefsel verkrijgen wassen op de lipoaspirate driemaal met gelijke volumina 1x steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorgvuldig te zuigen en de onderste waterlaag weggooien.
- Bereid de collagenase spijsvertering buffer: 0,075% type I collagenase in Hank'sBalanced Salt Solution (HBSS). Bereid FACS-buffer: 2% FBS, 1% P188 en 1% Pen-Strep in PBS. Filter beide oplossingen met behulp van een in de handel verkrijgbaar 0,22 pm poriegrootte snelle doorstroming polyethersulfone filter.
- De gewassen vetweefsel verteren, voeg een gelijk volume van collagenase digestie buffer en plaats ontsluitvat stevig in een schuddend waterbad gedurende 60 minuten bij 37 ° C (ongeveer 180 shakes / min).
LET OP: Het beste is om een groter volume ontsluitvat gebruiken dan nodig is, omdat dit zorgt voor maximale vertering tijdens het schudden (dat wil zeggen, 250 ml collagenase spijsvertering buffer, 250 ml gewassen vetweefsel in een 1L steriele kolf). - Neutraliseer enzymatische activiteit door toevoeging van een gelijk volume FACS buffer en waardoor zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vervolgens centrifuge bij 233 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Zorgvuldig aspireren en gooi het supernatant, het verzorgen van de high-density SVF pellet niet te verstoren.
- Resuspendeer de pellet in 5-10 ml RT roodcellysis buffer basis van korrelgrootte. Laat oplossing zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig supernatant en resuspendeer de pellet door het toevoegen van 5-10 ml van de traditionele groeimedia, gebaseerd op korrelgrootte (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicilline-streptomycine oplossing [pen-strep]).
- Filter de suspensie door een 100 um nylon cel zeef om cellulaire vuil te verwijderen.
- Centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de pellet in 5-10 ml traditionele groeimedia basis van korrelgrootte.
- Plaats 2 x 10 6 cellen in een 15 cm kweekschaal standaard en primaire kweken O / N vast bij 37 ° C / 21% O2, 5% CO2. Handhaaf op sub-samenvloeiende niveaus spontane differentiatie bij 37 ° C / 21% O2, 5% CO2 in groeimedia voorkomen.
OPMERKING: Celdichtheid in een volledigsamenvloeiende 15 cm plaat is ongeveer 4-6 x 10 6 cellen.
2. kleuring
- Cultuur ASC in traditionele groeimedium bij 37 ° C / 21% O2, 5% CO2 gedurende 36 uur voor kleuring / sortering.
- Lift ASC uit selkweekplaten behulp Accutase (volgens het protocol van de fabrikant).
- Was de cellen eenmaal met FACS buffer (PBS met 2% FBS en 1% pen-strep).
- Centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet. Resuspendeer de cellen in 0.5-1 ml FACS buffer (afhankelijk van het aantal cellen en de hoeveelheid antilichaam gewenst).
Opmerking: Het volume van de celsuspensie, overeenkomstig aanbevelingen van de fabrikant FACS antilichaam bepaalt antilichaamconcentratie. Echter, titratie van antilichaamconcentratie, met een beginconcentratie van 1: 100 wordt gewoonlijk aangeraden als het de eerste keer een antilichaam te gebruiken. - Tel het aantalcellen met een hemocytometer.
- Reserve 100 ul aliquots in 1,5 ml centrifugebuizen worden gebruikt voor een ongekleurde monster en eenkleurige controles (afhankelijk van het aantal fluorescente antilichamen gebruikt).
- Voeg de juiste fluorescent gemerkte monoklonale antilichamen (met vooraf bepaalde concentraties instructies van de fabrikant) en incubeer gedurende 20-30 minuten op ijs, afgeschermd van licht.
- Osteogene subpopulatie labelen: Verdun anti-CD90 (APC anti-humaan CD90 (Thy1)) of anti-CD105 (FITC anti-humaan CD105 (endoglin)) in FACS-buffer tot een concentratie van 1:50.
- Voor andere celpopulaties (bijvoorbeeld hematopoietische en endotheelcellen) label: Verdun anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-menselijk CD34 APC), en / of anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS buffer tot een concentratie van 1:50.
- Als u geen direct geconjugeerde antilichamen, gebruik dan een gebiotinyleerd primair antilichaam met een passende streptavidine- geconjugeerde tweedeary antilichaam, zoals Streptavidine PE-Cy7, bij een verdunning van 1: 100.
- Na incubatie was de cellen tweemaal: vul buizen met FACS buffer en centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, bovenstaande vloeistof opzuigen.
- Resuspendeer de cellen in 400-500 pi FACS buffer en filter monsters door een 70 micrometer nylon zeef cel naar cel klonten te verwijderen.
- Overdracht gelabelde cellen in FACS buisjes met filter dak en houdt monsters op ijs voor de duur van de analyse.
3. fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting
OPMERKING: De volgende stappen mandaat voorkennis in fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) of de hulp van een vakman.
- Met behulp van de juiste FACS software, ontwerp analyse percelen aan voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC) te onderzoeken, fycoerythrine (PE) -Texas Rood, Pacific Blue, fluoresceïneisothiocyanaat (FITC), allophycocyanine (APC) en eventuele andere fluorofoor gebruikd om cellen te labelen.
- Voorafgaand aan het laden in de cel sorter, kort vortex elk monster om de cellen opnieuw in suspensie.
- Beginnen met een analyse van de niet-gekleurde monster om poorten te stellen voor de totale celpopulatie, cellulaire puin uit te sluiten, en de uitgangswaarde autofluorescentie bepalen.
- Voeg propidium jodide (PI) aan de ongekleurde monster en analyseren om de populatie van levende cellen te visualiseren in de totale celpopulatie. De bouw van een hek rondom deze populatie.
- Analyseer een eenkleurige controlemonster voor elke fluorochroom om fluorescentie schadevergoeding in te stellen.
- Analyseer de gekleurde monster om de positie van de poorten voor het sorteren.
- PI toe te voegen aan het gekleurde monster om dode cellen te kleuren.
- Sorteer de gelabelde cel populaties. Sorteren op hetzij 1,5 ml centrifugebuizen of conisch (15 ml) kweekmedium.
- Handmatig ophouden sorteren zodra de benodigde hoeveelheid cellen is verkregen.
- Onsing FACS, voeren een zuiverheid controle door het analyseren van een kleine fractie (bijv., 500 cellen) van de overgenomen celpopulatie.
OPMERKING: Deze stap bevestigt de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties. Idealiter zuiverheid van meer dan 90-95%. - Centrifugeer cellen bij 233 g gedurende 5 min bij 4 ° C onmiddellijk na de voltooiing van sorteren en resuspendeer in 1 ml vers medium bevattende 10% FBS.
OPMERKING: De hoeveelheid gebruikte medium kan worden verhoogd op basis van de grootte van de cel pellet. - Plaat gelatine beklede platen om cellevensvatbaarheid te verbeteren. Afhankelijk eindcelconcentratie opbrengst plaat 300.000 cellen per putje in een 6-wells plaat, 100.000 cellen per putje in een 12-wells plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met CD90 als een merker voor cellen met verhoogde osteogenesis leidt tot isolatie van een sterk verrijkte populaties van humane ASC (Figuur 1A, 1B). ASC werden gekleurd met Pacific Blue-geconjugeerd anti-humaan CD45 FITC-geconjugeerd anti-humaan CD105 en APC-geconjugeerd anti-humaan CD90. Na het sorteren, de zuiverheid groter dan 98%, zoals gekwantificeerd door post-sort analyse.
Het definiëren van groepen van cellen op basis van transcriptionele profielen toegestaan voor potentiële isolatie van twee nieuwe subpopulaties. Om het osteogene potentieel van elk veelbelovende subpopulatie (CD90 + CD105 en laag), alsmede die van de ongesorteerde bevolking in vitro karakteriseren, werden cellen gekweekt in osteogene differentiatie medium gedurende 14 dagen, zoals eerder beschreven 6,8,9. Alkalische fosfatase kleuring (gebruikt voor de vroegtijdige opsporing van botvorming 10) op dag 7 was significant verhoogd in de CD90 + (Figuur 2A). Dit werd zowel grove en na kwantificering (Figuur 2A) waargenomen. Evenzo alizarinerood kleuring (een assay gebruikt om extracellulaire matrix mineralisatie en een metriek voor eindstation osteogene differentiatie 9 sporen) op dag 14 bleek dat CD90 + ASC konden een aanzienlijk grotere hoeveelheid extracellulaire matrix (figuur 2B) mineraliseren. Geïsoleerde ASCs behouden de mogelijkheid om osteogene differentiatie ondergaan na sortering, maar kan een paar dagen nodig om te herstellen. Het is essentieel voor alle verdere experimenten met lage passage cellen voeren, ASC's worden verouderde tijdens propagatie in kweek.
Figuur 1: (A) Poorten voor celgrootte en complexiteit werden getrokken celresten sluiten en isoleren van een populatie of enkele cellen voor verdere analyse. (B) FACS analyse van single-naargelang CD90 (links) en single-naargelang CD105 (rechts) ASC 36 uur na ASC oogst. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: (A) alkalische fosfatase kleuring (boven) en kwantificering (onderkant) van ASC na 7 dagen kweken in osteogene differentiatie medium (B) alizarine rood kleuring (boven) en kwantificering van kleuring (onderkant) van ASC na 14 dagen. van cultuur in osteogene differentiatie medium. CD90 + ASC en CD105 laag cellen vertonen verhoogde alkalische fosfatase vlekken en extracellulaire matrix mineralisatie in vergelijking met ongesorteerde cellen (* p <0,05; tweezijdige studentt-test). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Momenteel is de isolatie van homogene subpopulaties van ASC's uit de SVF van menselijk vetweefsel blijft een uitdagende wel wenselijk doel. Isolatie van pro-osteogene ASC subpopulaties is bijzonder wenselijk, omdat dergelijke cellen kunnen worden gebruikt om de vorming en homeostase van skeletale weefsels te bestuderen. De SVF van vetweefsel herbergt opmerkelijke heterogeniteit wat celcapaciteit en differentiatie potentieel stam. 11 De moleculaire basis voor deze heterogeniteit is niet begrepen worden uit samengevoegde populaties van cellen, in plaats waarvan single cell analyse. 12 Met deze benadering oppervlakmerkers nauw verbonden met de osteogene differentiatie capaciteit van ASCs kan worden geïdentificeerd.
De belangrijkste factor voor een succesvolle verrijking van ASC, zoals beschreven in de bovenstaande werkwijze, is gerelateerd aan de antilichamen gebruikt voor FACS. Men moet voorzichtig zijn om een antilichaam te selecteren met een hoge affiniteit voor de CELl-oppervlak marker in kwestie. Idealiter zou het een primair geconjugeerd antilichaam in tegenstelling tot een indirecte kleuring werkwijze die meerdere stappen en derhalve grotere kans op celdood, verlies en fouten opbouw vereist zijn. Bovendien kunnen kleine wijzigingen in FACS cellevensvatbaarheid vergroten. Deze omvatten het sorteren in een koele houder, waarbij de cellen op ijs te allen tijde sorteren cellen in houders die kweekmedium bevat en ook, plating de verworven celpopulaties op kweekplaten die vooraf zijn bekleed met 10% gelatine. Het is belangrijk om een post-soort zuiverheid analyse uit te voeren, teneinde de zuiverheid van de gesorteerde cellen waarborgen.
Deze techniek wordt beperkt door de beschikbaarheid van FACS apparatuur en deskundigheid in een inrichting. Zoals de primaire monsters heterogeen, de expressie van oppervlaktemerkers verandert op individuele basis. Zoals vermeld, is het essentieel om alle experimenten met lage passage cellen uitvoeren, zoals ASCs senescent geworden tijdens de propagatie in de cultuur. Bovendien is bekend dat ASC vertonen een verschuiving in fenotypische expressie onder in vitro omstandigheden die de stamcelbiologie kunnen veranderen. Zo klinische toepassing, zou optimaal zijn om een sterk gezuiverde celpopulatie directe transplantatie of zaaien van cellen op een steiger verkregen zonder in vitro kweken. Bovendien, de grote hoeveelheden lipoaspirate die moeten worden verwerkt tot isoleren SVF kan belastend degenen die niet bekend met de techniek, zoals besproken en Zuk en collega's in een recente publicatie 13 gericht. Volgens de door Zuk et al., Dit protocol kan gemakkelijk worden opgeschaald of omlaag om het volume van lipoaspirate ontvangen en kan worden aangepast aan ASC isoleren van vetweefsel verkregen via abdominoplasties en andere soortgelijke procedures.
CD90 en CD105 eerder zijn geïdentificeerd als vroeg mesenchymale cell markers, zowel in BM-MSC en ASC populaties. In overeenstemming met eerder onderzoek, de CD90 + populatie vertegenwoordigen ongeveer 50% van de vers geïsoleerde SVF. 14 daarentegen slechts ongeveer 5-10% van de oorspronkelijke SVF uitgedrukt CD105. 6 name opeenvolgende passages, CD105 expressie sterk gestegen van bijna nul tot bijna alomtegenwoordige uitdrukking na 4-7 dagen in de cultuur. Het is bekend dat ASC sterk kunnen fenotypische drift tijdens in vitro expansie, waarbij de biologie van stamcellen kunnen veranderen. 15-17 Idealiter klinische toepassingen stamcellen het onmiddellijke gebruik van gezuiverde celpopulaties directe transplantatie of zaaien betrekking op een steiger , zonder in vitro kweken. Het percentage CD90 + cellen kunnen variëren tussen verschillende lipoaspirate monsters in een vet depot-afhankelijke afkomst of leeftijd-afhankelijke manier. Maar met CD90 als een celoppervlak marker maakt verrijking ofa subpopulatie van menselijke ASC's met verbeterde osteogeen potentieel. Deze methode van osteogene verrijking heeft het potentieel om te dienen als een nieuw middel voor het bevorderen van snelle en robuuste botvorming bij patiënten met skeletafwijkingen kritische grootte. We regelmatig constateren dat benaderende cel opbrengst van de standaard lipoaspirate is 5 x 10 7 cellen met kern / 500 ml lipoaspirate behulp van de hiervoor genoemde oogst methode, hoewel zoals hierboven beschreven dit kan variëren op basis van vet depot herkomst of patiëntgegevens. 18 Yoshimura en collega's gemeld dat ASC's vertegenwoordigen 10-35% van de bevolking van cellen met kernen in de SVF. 19 Daarom is er een aanzienlijk potentieel voor direct zaaien van een steiger voor de uitvoering van botweefsel strategieën volgende osteogenic verrijking van ASC's met behulp van FACS.
Stamcelgebaseerde tissue engineering voor experimentele en klinische toepassingen vereist vaak sterk gezuiverde celpopulaties. Andere high-throughput methoden van zuivering bestaan als eenvoudigere alternatieven voor FACS, onder meer panning, complement uitputting, en magnetische-geactiveerde cel sortering (MACS). In bepaalde situaties, FACS noodzakelijk en voordelig: als de isolatie van zeer zuivere subpopulaties gewenst, wanneer het doeloppervlak marker niet vaak voorkomt in de celpopulatie, of wanneer de cellen worden gescheiden gebaseerd op wisselende expressie van hetzelfde oppervlak marker.
Met zowel microfluidic gebaseerde single cell transcriptionele analyse en fluorescentie-geactiveerde celsortering, endogline (CD105) en Thy-1 (CD90) bleken geassocieerd met verschillen in ASC expressie van osteogene genen. Statistische analyse van enkele cel transcriptie profielen aangetoond dat lage expressie van CD105 en hoge expressie van CD90 beschrijven subgroepen van ASC's met een verhoogde osteogene capaciteit. Deze eiwitten werden vervolgens gebruikt om te verrijken voor osteogene subpopulaties van cellen derived uit menselijk onderhuids vetweefsel. 6,20
Samen vormen deze gegevens illustreren de effectiviteit van sortering ASC basis van specifieke celoppervlak merkers die correleren met osteogene transcriptionele activiteit. Ofschoon de uitvoerbaarheid van deze benadering hier wordt aangetoond door het gebruik van CD90 en CD105 als voorbeelden verdere analyse moet worden gedaan om alle veelbelovende combinaties van oppervlakte-antigeen expressie die sterk correleren met osteogene transcriptionele activiteit omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs een financieel belang in elk van de producten, inrichtingen, of dit manuscript vermelde geneesmiddelen. Geen van de auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te melden.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Research subsidie R01-DE021683-01 en de National Institutes of Health Research subsidie R01-DE019434 aan MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship aan MTCDCW werd gesteund door de ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, De Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, en de Stanford University Child Health Research Institute Faculteit Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
References
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
- Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
- Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
- Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
- Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
- Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
- James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720 (2009).
- Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
- Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211 (2011).
- Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585 (2013).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
- Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
- McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
- Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).
- Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
