Protocol
REMARQUE: Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Conseil d'examen Stanford University institutionnel (Protocole N ° 2188 et # 9999).
1. Isolement et culture cellulaire:
- Obtenir le tissu adipeux sous-cutané humain provenant de patients sains de sexe féminin subissant lipoaspiration élective de l'abdomen, du flanc, et / région ou de la cuisse sous anesthésie locale / générale. Assurez-vous que l'Institutional Review Board (IRB) l'approbation a été obtenue pour le protocole d'isoler ASC de tissus humains, et suivre les précautions de sécurité institutionnels tout en travaillant avec de tels matériaux.
- Pour obtenir le SVF à partir du tissu adipeux lipoaspirated, le lipoaspirat premier laver trois fois avec des volumes égaux de 1x solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Aspirer soigneusement et jeter la couche aqueuse inférieure.
- Préparer le tampon collagénase de digestion: 0,075% collagénase de type I dans HankBalanced Salt Solution (HBSS). Préparer tampon FACS: 2% de FBS, 1% et 1% P188 Pen-Strep dans du PBS. Filtrez les deux solutions en utilisant un 0,22 um taille des pores débit rapide filtre polyéthersulfone disponible dans le commerce.
- Pour digérer le tissu adipeux lavé, ajouter un volume égal de tampon de digestion à la collagénase et le placer récipient de digestion en toute sécurité dans un bain-marie à agitation pendant 60 min à 37 ° C (environ 180 secousses / min).
REMARQUE: Il est préférable d'utiliser un récipient de digestion de volume plus important que nécessaire, car cela permet à la digestion maximale pendant l'agitation (c.-250 ml de tampon de digestion collagénase, 250 ml de tissu adipeux lavé dans un flacon stérile 1L). - Neutraliser l'activité enzymatique par addition d'un volume égal de tampon pour FACS et permettant de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 233 g pendant 20 min à 4 ° C.
- Aspirer soigneusement et jeter le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot SVF-haute densité.
- Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de RT rougeTampon de lyse cellulaire, selon la taille du culot. Laissez la solution de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min et centrifuger à 233 g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot en ajoutant 5-10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille de pellets (milieu de Eagle modifié Dulbecco [DMEM] / 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine solution [pen-strep]).
- On filtre la suspension à travers un filtre cellulaire en nylon de 100 um pour éliminer les débris cellulaires.
- Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, et jeter le surnageant sans perturber le culot.
- Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille du culot.
- Placez 2 x 10 6 cellules dans une boîte de culture de 15 cm standard et établir des cultures primaires O / N à 37 ° C / 21% d'O 2, 5% de CO 2. Maintenir au niveau sous-confluentes à prévenir une différenciation spontanée à 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 dans des milieux de croissance.
La densité cellulaire dans un cadre entièrement: NOTEconfluentes 15 cm plaque est d'environ 4-6 x 10 6 cellules.
2. coloration
- CSA de la culture dans un milieu de croissance classique à 37 ° C / 21% O 2, 5% de CO 2, pendant 36 heures avant la coloration / tri.
- ASC Ascenseur à partir de plaques de culture à l'aide Accutase (selon le protocole du fabricant).
- Laver les cellules une fois avec du tampon FACS (PBS avec 2% de FBS et 1% de Pen-strep).
- Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant sans perturber le culot. Remettre en suspension les cellules dans 0,5 à 1 ml de tampon FACS (selon le nombre de cellules et la quantité souhaitée de l'anticorps).
NOTE: Le volume de la suspension cellulaire, selon les recommandations du fabricant d'anticorps FACS, détermine la concentration d'anticorps. Cependant, le titrage de la concentration en anticorps, en utilisant une concentration de départ de 1: 100, est habituellement conseillé si ce est la première fois d'utiliser un anticorps. - Comptez le nombre total decellules en utilisant un hémocytomètre.
- Réserve aliquotes de 100 ul dans 1,5 ml tubes de centrifugeuse à utiliser pour un échantillon non colorées et les contrôles d'une seule couleur (selon le nombre d'anticorps fluorescents utilisés).
- Ajouter les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence appropriés (à des concentrations prédéterminées, selon les instructions du fabricant) et incuber pendant 20-30 min sur la glace, à l'abri de la lumière.
- Pour étiqueter sous-population ostéogénique: Diluer anti-CD90 (CD90 APC anti-humain (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humain (endogline)) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50.
- Pour marquer d'autres populations de cellules (par exemple, hématopoïétiques et les cellules endothéliales): Diluer anti-CD45 (anti-humain CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-humain CD34 APC), et / ou anti-CD31 (anti-humain CD31 PE ) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50.
- Si vous ne utilisez anticorps directement conjugués, utiliser un anticorps primaire biotinylé avec une seconde de streptavidine conjugué appropriéeary anticorps, tels que la streptavidine PE-Cy7, à une dilution de 1: 100.
- Après incubation, laver les cellules deux fois: remplir les tubes avec du tampon FACS et centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, aspiration surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 400 à 500 échantillons ul FACS tampons et filtrer à travers une cellule de nylon filtre 70 um pour éliminer les grumeaux de cellules.
- Transfert cellules marquées dans des tubes FACS avec le dessus du filtre et conserver des échantillons sur la glace pendant la durée de l'analyse.
3. fluorescence tri cellulaire activé
REMARQUE: Les étapes suivantes prescrivent des connaissances préalables dans la cellule activé par fluorescence (FACS) ou l'assistance d'un technicien qualifié.
- Utilisation du logiciel FACS appropriées, parcelles d'analyse de conception pour examiner diffusion vers l'avant (FSC), diffusion latérale (SSC), la phycoérythrine (PE) -Texas rouge, bleu Pacifique, isothiocyanate de fluorescéine (FITC), Allophycocyanin (APC) et toute autre utilisation de fluorophored pour marquer les cellules.
- Avant de charger dans le trieur de cellules, vortex brièvement chaque échantillon pour remettre en suspension les cellules.
- Commencer avec l'analyse de l'échantillon non coloré afin de mettre en portes pour la population totale de la cellule, pour exclure les débris cellulaires, et de déterminer autofluorescence base.
- Ajouter l'iodure de propidium (PI) à l'échantillon non colorées et les analyser afin de visualiser la population de cellules vivantes dans la population totale de la cellule. Construire une porte autour de cette population.
- Analyser un échantillon de contrôle d'une seule couleur pour chaque fluorochrome pour régler la compensation de fluorescence.
- Analyser l'échantillon teinté pour régler la position des portes pour le tri.
- Ajouter PI à l'échantillon coloré pour colorer les cellules mortes.
- Trier les populations cellulaires marqués. Trier soit 1,5 ml dans des tubes à centrifuger ou tubes coniques (15 ml) contenant du milieu de culture.
- Cesser tri manuellement une fois que la quantité requise de cellules a été obtenue.
- Nousing FACS, effectuer une vérification de la pureté en analysant une petite fraction (ex., 500 cellules) de la population de cellules acquise.
NOTE: Cette étape confirme la pureté des populations de cellules triées. Idéalement, la pureté soit supérieure à 90-95%. - Centrifuger les cellules à 233 g pendant 5 min à 4 ° C immédiatement après la fin du tri et remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais contenant 10% de FBS.
REMARQUE: La quantité de support utilisé peut être augmentée en fonction de la taille du culot cellulaire. - Plate sur des plaques revêtues de gélatine pour améliorer la viabilité des cellules. Selon le rendement cellulaire finale, plaque 300000 cellules par puits dans une plaque à 6 puits, 100 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits.
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Representative Results
Utilisation de CD90 en tant que marqueur pour des cellules avec des résultats améliorés d'ostéogenèse en isolement d'une population hautement enrichi de CSA humains (Figure 1A, 1B). CSA ont été colorées avec Pacific Blue-CD45 anti-humain conjugué, conjugué à FITC anti-CD105 humain, et APC conjugué anti-CD90 humain. Après le tri, le niveau de pureté était supérieure à 98%, telle que quantifiée par une analyse post-tri.
Définir les groupes de cellules en fonction des profils de transcription permis pour l'isolement prospective de deux nouveaux sous-populations. Pour caractériser le potentiel ostéogénique de chaque sous-population prometteur (CD90 + et CD105 bas), ainsi que celle de la population non triés in vitro, les cellules ont été cultivées dans du milieu de différenciation ostéogénique pendant 14 jours, comme décrit précédemment 6,8,9. Coloration de la phosphatase alcaline (utilisé pour la détection précoce de la formation osseuse 10) au Jour 7 a été significativement augmentée dans le CD90 + (figure 2A). Ceci a été observé à la fois grossièrement et après quantification (figure 2A). De même, la coloration rouge d'alizarine (un test utilisé pour détecter la minéralisation de la matrice extracellulaire et une métrique de terminal d'extrémité différenciation ostéogénique 9) au jour 14 a montré que CD90 + CSA ont été capables de minéraliser une quantité significativement plus grande de la matrice extracellulaire (figure 2B). ASC isolés conservent la capacité de subir une différenciation ostéogénique après le tri, mais peuvent nécessiter quelques jours pour récupérer. Il est essentiel d'effectuer toutes les autres expériences avec des cellules de passage faible, comme CSA deviennent sénescentes lors de la propagation dans la culture.
Figure 1: (A) Portails de la taille des cellules et la complexité ont été établis pour exclure les débris cellulaires et d'isoler une population of cellules individuelles pour une analyse plus approfondie. (B) d'analyse FACS de simple triés CD90 (à gauche) et un seul triés CD105 (à droite) ASC 36 h après la récolte de l'ASC. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: (A) La phosphatase alcaline coloration (en haut) et de quantification (en bas) des CSA après 7 jours de culture en milieu de différenciation ostéogénique (B) Alizarine coloration rouge (en haut) et la quantification de la coloration (en bas) des CSA après 14 jours. de culture dans un milieu de différenciation ostéogénique. CD90 + ASC et CD105 cellules faibles montrent une augmentation de la phosphatase alcaline et de coloration extracellulaire minéralisation de la matrice par rapport aux cellules non triés (* p <0,05; bilatéral ÉLÈVEt-test). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Actuellement, l'isolement des sous-populations homogènes de CSA de la SVF de tissu adipeux humain reste un défi si objectif souhaitable. L'isolement de sous-populations de l'ASC pro-ostéogéniques est particulièrement souhaitable, car ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la formation et l'homéostasie des tissus squelettiques. Toutefois, le SVF du tissu adipeux abrite hétérogénéité significative en ce qui concerne d'endiguer la capacité des cellules et le potentiel de différenciation. 11 La base moléculaire de cette hétérogénéité ne peut être comprise à partir de populations regroupées des cellules, et requiert plutôt l'analyse d'une seule cellule. 12 Avec cette approche, les marqueurs de surface étroitement associé à la capacité de différenciation ostéogénique des CSA peut être identifié.
Le facteur le plus critique pour l'enrichissement réussi des CSA, comme décrit dans le procédé ci-dessus, est lié à des anticorps utilisés pour FACS. Il faut être prudent de choisir un anticorps avec une forte affinité pour l'celmarqueur en question l-surface. Idéalement, il devrait être un anticorps primaire conjugué par opposition à une méthode de coloration indirecte, ce qui nécessite de multiples étapes et donc, une plus grande chance de la mort cellulaire, la perte de cellules et de l'erreur d'exercice. En outre, des modifications mineures au cours de FACS peuvent augmenter la viabilité cellulaire. Il se agit notamment de tri dans un récipient froid, en gardant les cellules sur la glace en tout temps, le tri des cellules dans des récipients qui contiennent des milieux de culture et aussi, l'étalement des populations de cellules acquises sur des plaques de culture qui ont été pré-revêtues de 10% de gélatine. Il est important d'effectuer une analyse de pureté post-tri, afin d'assurer la pureté des cellules triées.
Cette technique est limitée par la disponibilité de l'équipement et de l'expertise FACS dans une installation. En outre, comme les échantillons primaires sont hétérogènes, l'expression de marqueurs de surface va changer sur une base individuelle. Comme mentionné précédemment, il est essentiel d'effectuer toutes les expériences avec des cellules de passage faibles, comme étant l'ASCs deviennent sénescentes lors de la propagation de la culture. En outre, il est connu que les CSA présentent un changement dans l'expression phénotypique dans des conditions in vitro qui peut modifier la biologie des cellules souches. Ainsi, pour l'application clinique, il serait optimal pour obtenir une population cellulaire hautement purifiée pour la transplantation directe ou l'ensemencement des cellules dans un échafaudage sans la nécessité d'une culture in vitro. En outre, les grands volumes de lipoaspirat qui doivent être traitées pour isoler le SVF peut être lourde pour ceux qui ne connaissent la technique, tel que discuté et adressée par Zuk et ses collègues dans une publication récente 13. Conformément à la méthode décrite par Zuk et al., Ce protocole peut facilement être agrandie ou réduite pour accueillir le volume de lipoaspirat et peut être adapté pour isoler ASC du tissu adipeux obtenu par plasties abdominales et d'autres procédures similaires.
CD90 et CD105 ont déjà été identifiés le plus tôt mésenchymateuses souches cmarqueurs Ell, tant en BM-MSC et les populations de l'ASC. En accord avec des recherches antérieures, le CD90 + population représentaient environ 50% de la SVF fraîchement isolés. 14 En revanche, seulement environ 5-10% de la première SVF exprimé CD105. 6 Notamment, avec des passages successifs, l'expression CD105 rapidement passé de près de zéro à l'expression presque omniprésente après 4-7 jours de culture. Il est connu que les CSA présentent dérive phénotypique considérable lors de l'expansion in vitro, ce qui peut modifier la biologie des cellules souches. 15-17 Idéalement, les applications cliniques des cellules souches impliquerait l'utilisation immédiate de populations de cellules purifiées pour la transplantation directe ou ensemencement sur un échafaud sans qu'il soit nécessaire pour la culture in vitro. Le pourcentage de cellules CD90 + peut varier entre les différents échantillons de lipoaspirat à une origine du dépôt dépendant de graisse ou de manière dépendant de l'âge. Néanmoins, en utilisant CD90 comme marqueur de la surface cellulaire permet o enrichissementfa sous-population des CSA humains avec amélioré potentiel ostéogénique. Ce procédé d'enrichissement ostéogénique est susceptible de servir de moyen pour promouvoir une nouvelle formation osseuse rapide et solide chez les patients avec des défauts squelettiques taille critique. Nous observons régulièrement que le rendement cellulaire approximative de lipoaspirat norme est de 5 x 10 7 cellules nucléées / 500 ml de lipoaspirat l'aide de la méthode de récolte précitée, bien que, comme décrit ci-dessus cela peut varier en fonction de l'origine du dépôt de graisse ou de données démographiques des patients. 18 Yoshimura et ses collègues ont indiqué que ASC représentent 10 à 35% de la population de cellules nucléées dans le SVF. 19 Par conséquent, il existe un potentiel considérable pour le semis direct d'un échafaudage pour la mise en œuvre de stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse après un enrichissement ostéogénique des CSA en utilisant FACS.
Souches ingénierie tissulaire à base de cellules pour des applications expérimentales et cliniques nécessite souvent des populations de cellules hautement purifiés. Autres salutméthodes de purification gh-débit existent comme des alternatives plus simples à FACS, comprennent panoramique, complément épuisement, et la cellule magnétique activé tri (MACS). Cependant, dans certaines situations, FACS est à la fois nécessaire et avantageux: Lorsque l'isolement de sous-populations très pures est souhaité, lorsque le marqueur de surface de la cible se produit rarement dans la population de cellules, ou lorsque les cellules doivent être séparées basées sur des niveaux variables de la même surface d'expression marqueur.
Utilisant à la fois l'analyse microfluidique à base de cellule unique de transcription et de tri cellulaire activé par fluorescence, endogline (CD105) et Thy-1 (CD90) ont été trouvés à être associée à des différences dans l'expression des gènes ASC ostéogéniques. L'analyse statistique des profils de transcription cellulaires démontré que seule une faible expression du CD105 et CD90 expression élevée de décrire sous-groupes de CSA avec une capacité accrue ostéogénique. Ces protéines ont ensuite été utilisés pour enrichir les sous-populations de cellules ostéogéniques dirées du tissu adipeux sous-cutané humain. 6,20
Ensemble, ces données illustrent l'efficacité de la CSA tri basé sur les marqueurs de surface cellulaire spécifiques qui sont en corrélation avec l'activité transcriptionnelle ostéogénique. Bien que la faisabilité de cette approche est démontré ici par l'utilisation de CD90 et CD105 à titre d'exemples, une analyse plus approfondie doit être fait pour inclure toutes les combinaisons prometteuses d'expression de l'antigène de surface qui sont en corrélation avec hautement activité transcriptionnelle ostéogénique.
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Disclosures
Aucun des auteurs ont un intérêt financier dans l'un des produits, dispositifs ou médicaments mentionnés dans ce manuscrit. Aucun des auteurs ne ont aucun intérêt financier concurrence à signaler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par les Instituts nationaux de recherche en santé subvention R01-DE021683-01 et National Institutes of Health Research subvention R01-DE019434 à MTL; Howard Hughes Medical Institute bourse de recherche à MTCDCW a été soutenu par l'ACS Franklin Martin Faculté de bourses de recherche, le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative, et de la Faculté Scholar Award Child Health Research Institute de l'Université de Stanford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
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