Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

अलगाव और मानव का संवर्धन बढ़ी अस्थिजनन के लिए stromal कोशिकाओं वसा व्युत्पन्न

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University
* These authors contributed equally

Protocol

नोट: सभी रोगी के नमूने सूचित सहमति के साथ प्राप्त किया गया है, और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा की और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड (प्रोटोकॉल # 2188 और # 9999) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. सेल अलगाव और संस्कृति:

  1. सामान्य / स्थानीय संज्ञाहरण के तहत पेट, दिशा, और / या जांघ क्षेत्र के वैकल्पिक lipoaspiration के दौर से गुजर स्वस्थ महिला रोगियों से मानव चमड़े के नीचे वसा ऊतकों प्राप्त करते हैं। संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) की मंजूरी मानव ऊतकों से ASCs अलग-थलग करने के प्रोटोकॉल के लिए प्राप्त किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, और इस तरह के माल के साथ काम कर रहा है, जबकि संस्थागत सुरक्षा सावधानियों का पालन करें।
  2. Lipoaspirated वसा ऊतकों से SVF प्राप्त करने के लिए, पहली 1x बाँझ फॉस्फेट बफर खारा की बराबर मात्रा (पीबीएस) के साथ lipoaspirate तीन बार धोएं। ध्यान से महाप्राण और नीचे जलीय परत त्यागें।
  3. मैं हांक में collagenase 0.075% प्रकार: collagenase पाचन बफर तैयारबैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS)। FACS बफर तैयार: 2% FBS के, 1% P188 और पीबीएस में 1% पेन Strep के। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार तेजी से प्रवाह के polyethersulfone फिल्टर का उपयोग दोनों के समाधान फ़िल्टर।
  4. धोया वसा ऊतकों को पचाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस (लगभग 180 हिलाता / मिनट) पर 60 मिनट के लिए एक मिलाते हुए पानी के स्नान में सुरक्षित रूप से पाचन पोत collagenase पाचन बफर के एक बराबर मात्रा जोड़ने के लिए और जगह है।
    नोट: इस झटकों के दौरान अधिक से अधिक पाचन के लिए अनुमति देता है, क्योंकि यह आवश्यकता की तुलना में एक बड़ी मात्रा पाचन पोत का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है (यानी, collagenase पाचन बफर के 250 मिलीलीटर, एक 1L बाँझ फ्लास्क में धोया वसा ऊतकों के 250 मिलीलीटर)।
  5. FACS बफर के एक बराबर मात्रा जोड़ने और 5 मिनट के लिए आरटी पर बैठने के लिए अनुमति देकर enzymatic गतिविधि बेअसर। अगला, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 233 XG पर अपकेंद्रित्र।
  6. ध्यान से महाप्राण और उच्च घनत्व SVF गोली परेशान नहीं ख्याल रख रही है, सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. आरटी लाल के 5-10 मिलीलीटर में गोली Resuspendसेल गोली आकार के आधार पर, बफर lysis। आरटी पर 5 मिनट के लिए 233 XG पर 5 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए आरटी पर बैठने के लिए समाधान के लिए छोड़ दें।
  8. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और गोली आकार के आधार पर पारंपरिक विकास मीडिया के 5-10 मिलीलीटर, जोड़कर गोली resuspend (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम [DMEM] / 10% FBS के / 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान [कलम-स्ट्रेप])।
  9. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एक 100 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 233 XG पर अपकेंद्रित्र, और गोली बाधा पहुँचा के बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  11. गोली आकार के आधार पर पारंपरिक विकास मीडिया के 5-10 मिलीलीटर, में गोली resuspend।
  12. एक 15 सेमी मानक संस्कृति डिश में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्लेस और 37 डिग्री सेल्सियस / 21% 2 हे, 5% सीओ 2 पर प्राथमिक संस्कृतियों हे / एन की स्थापना। 37 डिग्री सेल्सियस / 21% 2 हे, विकास मीडिया में 5% सीओ 2 में सहज भेदभाव को रोकने के लिए उप मिला हुआ स्तरों पर बनाए रखें।
    नोट: एक पूरी तरह से में सेल घनत्वमिला हुआ 15 सेमी थाली लगभग 4-6 x 10 6 कोशिकाओं है।

2. धुंधला

  1. धुंधला होने से पहले 36 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 21% 2 हे, 5% सीओ 2, पर पारंपरिक मध्यम विकास में संस्कृति ASCs / छँटाई।
  2. (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) Accutase का उपयोग करते हुए संस्कृति प्लेटों से लिफ्ट ASCs।
  3. एक बार (2% FBS और 1% कलम-स्ट्रेप साथ पीबीएस) FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 233 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. गोली बाधा पहुँचा के बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें। FACS बफर के 0.5-1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend (सेल नंबर और इच्छित एंटीबॉडी की मात्रा पर निर्भर करता है)।
    नोट: सेल निलंबन की मात्रा, FACS के एंटीबॉडी निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, एंटीबॉडी एकाग्रता निर्धारित करता है। हालांकि, एंटीबॉडी एकाग्रता का अनुमापन, एक की एक प्रारंभिक एकाग्रता का उपयोग: यह एक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए पहली बार है कि अगर 100, आमतौर पर सलाह दी है।
  6. की कुल संख्या की गणनाएक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं।
  7. 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रिजर्व 100 उल aliquots के एक बेदाग नमूना और (प्रयुक्त फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की संख्या के हिसाब से) एकल रंग नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  8. (निर्माता के निर्देशों के अनुसार, पूर्व निर्धारित सांद्रता में) उचित fluorescently लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ें और प्रकाश से परिरक्षित बर्फ पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं।
    1. Osteogenic उप-जनसंख्या लेबल करने के लिए: 01:50 के एक एकाग्रता के लिए FACS बफर में विरोधी CD90 (एपीसी मानव विरोधी CD90 (Thy1)) या विरोधी CD105 (FITC विरोधी मानव CD105 (endoglin)) पतला।
    2. अन्य सेल आबादी (जैसे, hematopoietic और endothelial कोशिकाओं) लेबल करने के लिए: विरोधी CD45 (एंटी ह्यूमन CD45 प्रशांत ब्लू), विरोधी CD34 (एंटी ह्यूमन CD34 एपीसी), और / या विरोधी CD31 (एंटी ह्यूमन CD31 पीई पतला ) FACS में 01:50 के एक एकाग्रता के लिए बफर।
    3. सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग नहीं करते हैं, तो एक उपयुक्त streptavidin संयुग्मित दूसरे के साथ एक biotinylated प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोगएक के कमजोर पड़ने पर इस तरह के Streptavidin पीई Cy7 के रूप में आरे एंटीबॉडी,: 100।
  9. सतह पर तैरनेवाला aspirating, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 233 XG पर FACS बफर और अपकेंद्रित्र के साथ ट्यूब भरने: ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  10. सेल clumps को दूर करने के लिए एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से 400-500 μl FACS बफर और फिल्टर नमूनों में कोशिकाओं Resuspend।
  11. फिल्टर के साथ शीर्ष FACS ट्यूबों में लेबल कोशिकाओं स्थानांतरण और विश्लेषण की अवधि के लिए बर्फ पर नमूने रहते हैं।

3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी

नोट: निम्न चरणों पिछले प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल में ज्ञान छँटाई (FACS) या एक कुशल तकनीशियन की सहायता जनादेश।

  1. आगे तितर बितर (एफएससी), ओर तितर बितर (एसएससी) की जांच करने के लिए, डिजाइन विश्लेषण भूखंडों उपयुक्त FACS के सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, phycoerythrin (पीई) -Texas लाल, प्रशांत ब्लू, fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC), Allophycocyanin (एपीसी) और किसी भी अन्य फ्लोरोफोरे उपयोगडी कोशिकाओं लेबल।
  2. सेल सॉर्टर, संक्षेप में भंवर कोशिकाओं resuspend प्रत्येक नमूने में लोड करने से पहले।
  3. सेलुलर मलबे को बाहर करने के लिए, और आधारभूत autofluorescence निर्धारित करने के लिए, कुल सेल की आबादी के लिए द्वार स्थापित करने के लिए आदेश में बेदाग नमूने के विश्लेषण के साथ शुरू।
  4. बेदाग नमूना propidium आयोडाइड (पीआई) जोड़ें और कुल सेल आबादी के भीतर जीवित कोशिकाओं की आबादी कल्पना करने के क्रम में यह विश्लेषण। इस आबादी के चारों ओर एक फाटक का निर्माण।
  5. प्रतिदीप्ति मुआवजा निर्धारित करने के लिए आदेश में प्रत्येक fluorochrome के लिए एक एकल रंग नियंत्रण नमूना विश्लेषण।
  6. छंटाई के लिए द्वार की स्थिति निर्धारित करने के लिए दाग नमूना विश्लेषण।
  7. मृत कोशिकाओं दाग के क्रम में दाग नमूने के पीआई जोड़ें।
  8. लेबल सेल आबादी तरह। क्रमबद्ध 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब या संस्कृति के माध्यम से युक्त शंक्वाकार ट्यूब (15 मिलीलीटर) में या तो।
  9. मैन्युअल कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा प्राप्त किया गया है एक बार छँटाई रहेगा।
  10. हमेंFACS के आईएनजी, एक छोटा सा अंश का विश्लेषण (जैसे।, 500 कोशिकाओं) का अधिग्रहण सेल की आबादी के द्वारा एक शुद्धता की जांच करते हैं।
    नोट: इस कदम पर छाँटे सेल आबादी की शुद्धता की पुष्टि करता है। आदर्श रूप में, पवित्रता 90-95% से अधिक होना चाहिए।
  11. 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 233 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं तुरंत 10% FBS युक्त ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर में छँटाई के पूरा होने और resuspend निम्नलिखित सी।
    नोट: इस्तेमाल किया मीडिया की राशि सेल गोली के आकार के आधार पर वृद्धि की जा सकती है।
  12. जिलेटिन लेपित प्लेटों पर प्लेट सेल व्यवहार्यता में सुधार होगा। अंतिम सेल उपज, थाली 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 300,000 कोशिकाओं, एक 12 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 100,000 कोशिकाओं पर निर्भर करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मानव ASCs (चित्रा 1 ए, 1 बी) के एक बेहद समृद्ध आबादी के अलगाव में बढ़ाया अस्थिजनन परिणामों के साथ कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में CD90 का उपयोग करना। ASCs प्रशांत ब्लू संयुग्मित मानव विरोधी CD45, FITC संयुग्मित विरोधी मानव CD105, और APC संयुग्मित मानव विरोधी CD90 के साथ दाग रहे थे। पोस्ट-प्रकार का विश्लेषण द्वारा मात्रा के रूप में छँटाई करने के बाद, शुद्धता का स्तर, अधिक से अधिक से अधिक 98% थी।

दो उपन्यास उप-जनसंख्या के संभावित अलगाव के लिए अनुमति दी ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के आधार पर कोशिकाओं के समूह को परिभाषित करना। पहले से 6,8,9 के रूप में वर्णित प्रत्येक होनहार उप-जनसंख्या (कम CD90 + और ​​CD105) के osteogenic संभावित है, साथ ही इस बात का विट्रो में unsorted आबादी को चिह्नित करने के लिए, कोशिकाओं, 14 दिनों के लिए osteogenic भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत थे। 7 दिन में (हड्डी गठन 10 का जल्दी पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता) alkaline फॉस्फेट धुंधला काफी CD90 + में वृद्धि की गई थी (2A चित्रा) के लिए जनसंख्या के सापेक्ष। यह दोनों निहायत और मात्रा का ठहराव (2A चित्रा) के बाद मनाया गया। इसी तरह, Alizarin लाल धुंधला दिवस 14 (बाह्य मैट्रिक्स खनिज और अंत टर्मिनल osteogenic भेदभाव 9 के लिए एक मीट्रिक पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है एक परख) CD90 + ASCs बाह्य मैट्रिक्स (चित्रा 2 बी) के एक काफी बड़ी राशि धातु के लिए सक्षम थे कि पता चला है। पृथक ASCs छंटाई के बाद osteogenic भेदभाव से गुजरना करने की क्षमता बनाए रखने के लिए, लेकिन ठीक करने के लिए कुछ दिनों के लिए आवश्यकता हो सकती। ASCs संस्कृति में प्रचार के दौरान वृद्ध होनेवाला बन के रूप में यह कम बीतने कोशिकाओं के साथ आगे की सभी प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है।

चित्रा 1
चित्रा 1: सेल आकार और जटिलता के लिए (ए) गेट्स सेल मलबे को बाहर और एक जनसंख्या ओ अलग करने के लिए तैयार किया गयाआगे के विश्लेषण के लिए एफ एकल कक्षों। (बी) के एकल हल CD90 (बाएं) और एकल हल CD105 (दाएं) 36 घंटा ए एस सी फसल के बाद ASCs के FACS विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2: (ए) alkaline फॉस्फेट धुंधला (ऊपर) और osteogenic भेदभाव माध्यम में संस्कृति के 7 दिनों के बाद ASCs की मात्रा का ठहराव (नीचे) (बी) के 14 दिनों के बाद ASCs के Alizarin लाल धुंधला (ऊपर) और धुंधला (नीचे) की मात्रा का ठहराव। osteogenic भेदभाव माध्यम में संस्कृति की। दो पूंछ छात्र की; CD90 + ASCs और CD105 कम कोशिकाओं unsorted कोशिकाओं (* पी <0.05 की तुलना में alkaline फॉस्फेट धुंधला और बाह्य मैट्रिक्स खनिज वृद्धि हुई दिखानेटी परीक्षण)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्तमान में, मानव वसा ऊतकों के SVF से ASCs के समरूप उप-जनसंख्या के अलगाव वांछनीय लक्ष्य हालांकि एक चुनौती बनी हुई है। ऐसी कोशिकाओं कंकाल ऊतकों के गठन और homeostasis को अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में समर्थक osteogenic एएससी उप-जनसंख्या के अलगाव, विशेष रूप से वांछनीय है। हालांकि, वसा ऊतकों के SVF। सेल क्षमता और भेदभाव संभावित स्टेम के संबंध में इस विविधता के लिए आणविक आधार कोशिकाओं की जमा आबादी से समझा नहीं जा सकता 11 महत्वपूर्ण विविधता बंदरगाहों, और इसके बजाय एकल कोशिका विश्लेषण की आवश्यकता है। 12 इस दृष्टिकोण के साथ, सतह मार्करों बारीकी से ASCs के osteogenic भेदभाव क्षमता पहचाना जा सकता है के साथ जुड़े।

उपरोक्त विधि के रूप में वर्णित ASCs के सफल संवर्धन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है, FACS के लिए उपयोग किया एंटीबॉडी के लिए संबंधित है। एक सेल के लिए एक उच्च आत्मीयता के साथ एक एंटीबॉडी का चयन करने के लिए विवेकपूर्ण होना चाहिएसवाल में एल-सतह मार्कर। आदर्श रूप में, यह इस प्रकार कई कदम और, कोशिका मृत्यु, सेल नुकसान और त्रुटि उपार्जन की वृद्धि की संभावना की आवश्यकता है जो एक अप्रत्यक्ष धुंधला विधि, विरोध के रूप में एक प्राथमिक संयुग्मित एंटीबॉडी होना चाहिए। इसके अलावा, FACS के दौरान मामूली संशोधनों सेल व्यवहार्यता को बढ़ा सकते हैं। ये 10% जिलेटिन के साथ पूर्व लेपित किया गया है जो संस्कृति प्लेटों पर अधिग्रहीत सेल आबादी चढ़ाना, एक शांत गोदाम में छँटाई सभी समय पर बर्फ पर कोशिकाओं रखते हुए भी संस्कृति मीडिया होते हैं और जो पात्र में कोशिकाओं छँटाई शामिल हैं। इसे हल कोशिकाओं की शुद्धता सुनिश्चित करने के क्रम में, एक के बाद क्रमबद्ध पवित्रता विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है।

इस तकनीक में एक सुविधा के भीतर FACS के उपकरण और विशेषज्ञता की उपलब्धता सीमित है। प्राथमिक नमूने विषम के रूप में इसके अलावा, सतह मार्करों की अभिव्यक्ति एक व्यक्ति के आधार पर बदल जाएगा। Aforementioned के रूप में, यह ए एस सी के रूप में, कम बीतने कोशिकाओं के साथ सभी प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैसंस्कृति में प्रचार के दौरान वृद्ध होनेवाला हो जाते हैं। इसके अलावा, यह ASCs स्टेम कोशिका जीव विज्ञान को बदल सकता है जो इन विट्रो शर्तों के तहत प्ररूपी अभिव्यक्ति में एक बदलाव है कि प्रदर्शन के लिए जाना जाता है। इस प्रकार, नैदानिक ​​अनुवाद के लिए, यह इन विट्रो में खेती के लिए आवश्यकता के बिना एक पाड़ के लिए सीधी प्रत्यारोपण या सेल बोने के लिए एक उच्च शुद्ध सेल आबादी प्राप्त करने के लिए इष्टतम होगा। पर चर्चा की और हाल ही में एक प्रकाशन 13 में Zuk और उनके सहयोगियों ने संबोधित इसके अलावा, जैसा की जरूरत है जो lipoaspirate की बड़ी मात्रा, SVF तकनीक के साथ अपरिचित उन लोगों के लिए भारी हो सकता है अलग करने के लिए संसाधित किया जाना है। Zuk एट अल द्वारा वर्णित विधि के अनुसार।, इस प्रोटोकॉल को आसानी से बढ़ाया जा सकता है या नीचे lipoaspirate की मात्रा समायोजित करने के लिए और abdominoplasties और इसी तरह की अन्य प्रक्रियाओं के माध्यम से प्राप्त वसा ऊतकों से ASCs अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

CD90 और CD105 पहले से जल्दी mesenchymal स्टेम सी के रूप में पहचान की गई हैबीएम-एमएससी और ए एस सी आबादी में दोनों पक्ष मार्कर,। पिछले अनुसंधान के साथ रखने में, CD90 + जनसंख्या हौसले से अलग SVF का लगभग 50% का प्रतिनिधित्व किया। इसके विपरीत 14, प्रारंभिक SVF के बारे में केवल 5-10% CD105 व्यक्त की है। छह विशेष रूप से, लगातार मार्ग के साथ, CD105 अभिव्यक्ति तेजी से लगभग से बढ़कर संस्कृति में लगभग सर्वव्यापक अभिव्यक्ति के लिए शून्य 4-7 दिनों के बाद। यह ASCs स्टेम कोशिकाओं के जीव विज्ञान को बदल सकता है जो इन विट्रो विस्तार के दौरान काफी प्ररूपी बहाव है कि प्रदर्शन के लिए जाना जाता है। 15-17 आदर्श रूप में, स्टेम कोशिकाओं के लिए नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के एक चबूतरा पर प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण या बोने के लिए शुद्ध सेल आबादी के तत्काल उपयोग शामिल होगा इन विट्रो खेती के लिए आवश्यकता के बिना। CD90 + कोशिकाओं का प्रतिशत एक मोटी डिपो पर निर्भर मूल में अलग lipoaspirate नमूने या उम्र पर निर्भर ढंग के बीच भिन्न हो सकते हैं। फिर भी, एक कोशिका की सतह मार्कर के रूप में CD90 का उपयोग कर संवर्धन ओ के लिए अनुमति देता हैबढ़ाया osteogenic क्षमता के साथ मानव ASCs के एफए उप-जनसंख्या। Osteogenic संवर्धन का यह तरीका एक उपन्यास महत्वपूर्ण आकार के कंकाल दोष के साथ रोगियों में तेजी से और मजबूत हड्डी गठन को बढ़ावा देने के लिए साधन के रूप में सेवा करने की क्षमता है। हम नियमित रूप से इस ऊपर वर्णित हालांकि वसा डिपो मूल या रोगी जनसांख्यिकी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।, मानक lipoaspirate से कि लगभग सेल उपज के aforementioned फसल पद्धति का उपयोग lipoaspirate के 5 10 x 7 एकल कोशिकाओं / 500 मिलीलीटर है निरीक्षण 18 Yoshimura और उनके सहयोगियों ने खबर दी है कि ASCs इसलिए SVF। 19 में एकल कक्षों की जनसंख्या का 10-35% का प्रतिनिधित्व करते हैं, FACS का उपयोग कर ASCs के osteogenic संवर्धन निम्नलिखित अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के कार्यान्वयन के लिए एक पाड़ की सीधी बुवाई के लिए काफी संभावनाएं मौजूद हैं।

अक्सर अत्यधिक शुद्ध सेल आबादी की आवश्यकता प्रयोगात्मक और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए सेल आधारित ऊतक इंजीनियरिंग स्टेम। हाय अन्यशुद्धि जी एच-तरीकों, FACS के लिए आसान विकल्प के रूप में मौजूद हैं, panning पूरक कमी, और चुंबकीय सक्रिय सेल (एमएसीएस) छँटाई शामिल हैं। हालांकि, कुछ स्थितियों में, FACS के दोनों जरूरी है और लाभप्रद है: अत्यधिक शुद्ध उप-जनसंख्या के अलगाव वांछित है, जब लक्ष्य सतह मार्कर सेल की आबादी में कभी कभी होता है, या कोशिकाओं अलग किया जाना चाहिए जब एक ही सतह के अलग अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर जब मार्कर।

Microfluidic आधारित एकल कोशिका ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई, endoglin (CD105) और तेरा -1 (CD90) दोनों का प्रयोग osteogenic जीनों के ए एस सी अभिव्यक्ति में अंतर के साथ जुड़े होने के लिए पाए गए। एकल कक्ष ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सांख्यिकीय विश्लेषण CD105 और CD90 के उच्च अभिव्यक्ति की कम अभिव्यक्ति की वृद्धि हुई osteogenic क्षमता के साथ ASCs के उपसमूहों का वर्णन है कि प्रदर्शन किया। ये प्रोटीन बाद में डी कोशिकाओं के osteogenic उप-जनसंख्या के लिए समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गयामानव चमड़े के नीचे वसा ऊतकों से erived। 6,20

साथ में, इन आंकड़ों osteogenic ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के साथ सहसंबंधी कि विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों के आधार पर ASCs छँटाई की प्रभावशीलता को वर्णन। इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता उदाहरण के रूप में CD90 और CD105 के उपयोग के माध्यम से यहां का प्रदर्शन किया जाता है, आगे के विश्लेषण के अत्यधिक osteogenic ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के साथ सहसंबंधी कि सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति के सभी होनहार संयोजन शामिल करने के लिए किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों में से कोई भी इस पांडुलिपि में उल्लेख किया उत्पादों, उपकरणों, या दवाओं में से किसी में एक वित्तीय हित है। लेखकों में से कोई भी रिपोर्ट करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है।

Acknowledgments

इस अध्ययन के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान R01-DE021683-01 और स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान R01-DE019434 के राष्ट्रीय संस्थानों MTL के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था; MTCDCW को हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट रिसर्च फैलोशिप एसीएस फ्रेंकलिन मार्टिन संकाय रिसर्च फैलोशिप, बाल चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा के लिए Hagey प्रयोगशाला, और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय बाल स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान संकाय विद्वान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes Corning (Thomas Scientific) 2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement Gibco 10566-016
PBS, pH 7.4 Gibco 10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution Purdue  PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X Cellgro 21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin Gibco 16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution Stem Cell Technologies 7920
APC Mouse Anti-Human CD90 BD Pharmingen 559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) BD Pharmingen 561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)  eBioscience 48-9459-41
Anti-Human CD34 APC eBioscience 17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE eBioscience 12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7 eBioscience 25-4317-82
BD FACS Aria II instrument BD Biosciences
BD FACSDiva Software BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
  2. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
  3. Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
  4. Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
  5. Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
  6. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
  7. Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
  8. Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
  9. Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
  10. James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720 (2009).
  11. Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
  12. Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211 (2011).
  13. Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585 (2013).
  14. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
  15. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  16. Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
  17. McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
  18. Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).
  19. Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
  20. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 95 CD90 तेरा-1 छंटाई सकारात्मक चयन osteogenic भेदभाव
अलगाव और मानव का संवर्धन बढ़ी अस्थिजनन के लिए stromal कोशिकाओं वसा व्युत्पन्न
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zielins, E. R., Tevlin, R., Hu, M.… More

Zielins, E. R., Tevlin, R., Hu, M. S., Chung, M. T., McArdle, A., Paik, K. J., Atashroo, D., Duldulao, C. R., Luan, A., Senarath-Yapa, K., Walmsley, G. G., Wearda, T., Longaker, M. T., Wan, D. C. Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis. J. Vis. Exp. (95), e52181, doi:10.3791/52181 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter