Isolering och anrikning av humant Fett-stromala celler för Enhanced Osteogenesis

Protocol

OBS: Alla patientprover erhölls med informerat samtycke, och experimentella protokoll granskades och godkändes av Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 och # 9999).

1. Cell Isolering och kultur:

1. Skaffa human subkutan fettvävnad från friska kvinnliga patienter som genomgår elektiv Lypoaspiration av buken, flank, och / eller region låret under lokal / narkos. Se till att Institutional Review Board (IRB) godkännande har erhållits för protokollet att isolera DSKer från mänskliga vävnader och följ institutionella säkerhetsåtgärder när du arbetar med sådant material.
2. För erhållande av SVF från lipoaspirated fettvävnad, först tvätta lipoaspirate tre gånger med lika stora volymer av 1x steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Försiktigt aspirera och kasta den nedre vattenskiktet.
3. Förbered kollagenasdigestion buffert: 0,075% typ I kollagenas i HanksBalanced Salt Solution (HBSS). Förbered FACS buffert: 2% FBS, 1% P188 och 1% Pen-Strep i PBS. Filtrera båda lösningar med hjälp av en kommersiellt tillgänglig 0,22 um porstorlek snabbt flöde polyetersulfon filter.
4. För att smälta den tvättade fettvävnad, tillsätt en lika volym av kollagenasspjälkning buffert och placera digestionskärl säkert i ett skakande vattenbad under 60 minuter vid 37 ° C (ungefär 180 skakningar / minut).
   OBS: Det är bäst att använda en större volym matsmältningen kärl än vad som krävs, eftersom detta gör det möjligt för maximal uppslutning under skakning (dvs 250 ml kollagenas matsmältningen buffert, 250 ml tvättad fettvävnad i en 1L steril kolv).
5. Neutralisera enzymatiska aktiviteten genom tillsats av en lika stor volym av FACS buffert och gör det möjligt att sitta vid RT i 5 min. Därefter centrifugera vid 233 xg under 20 min vid 4 ° C.
6. Försiktigt aspirera och kassera supernatanten, noga med att inte störa hög densitet SVF pellet.
7. Återsuspendera pelleten i 5 till 10 ml av RT rödcell lysbuffert, baserat på pelletstorlek. Lämna lösningen att sitta vid RT i 5 min och centrifugera vid 233 xg under 5 min vid RT.
8. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten genom tillsättning av 5-10 ml traditionella tillväxtmedier, baserade på pelletstorlek (Dulbeccos Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin-lösning [pen-strep]).
9. Filtrera suspensionen genom en 100 ìm nylon cell sil för att ta bort cellrester.
10. Centrifugera vid 233 xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten utan att störa pelleten.
11. Återsuspendera pelleten i 5 till 10 ml av traditionella tillväxtmedier, baserade på pelletstorlek.
12. Placera 2 x 10 ⁶ celler i en 15 cm standardodlingsskål och etablera primära odlingar O / N vid 37 ° C / 21% O _2, 5% _CO2. Bibehåll vid sub-konfluenta nivåer för att förhindra spontan differentiering vid 37 ° C / 21% O _2, 5% _CO2 i tillväxtmedium.
    OBS: Celldensitet i en fulltsammanflytande 15 cm plattan är ca 4-6 x 10 ⁶ celler.

2. Färgning

1. Kultur DSKer i traditionell tillväxtmedium vid 37 ° C / 21% O _2, 5% _CO2, under 36 h före färgning / sortering.
2. Lift DSKer från odlingsplattor som använder Accutase (enligt tillverkarens protokoll).
3. Tvätta cellerna en gång med FACS-buffert (PBS med 2% FBS och 1% pen-strep).
4. Centrifugera vid 233 xg under 5 min vid 4 ° C.
5. Kassera supernatanten utan att störa pelleten. Resuspendera cellerna i 0,5-1 ml FACS buffert (beroende på antalet celler och mängden antikroppar önskas).
   OBSERVERA: Volymen av cellsuspensionen, i enlighet med FACS antikropps tillverkarens rekommendationer, bestämmer antikroppskoncentration. Emellertid titrering av antikroppskoncentration, med användning av en utgångskoncentration av 1: 100, vanligen rekommenderas om det är första gången för att använda en antikropp.
6. Räkna det totala antaletceller med användning av en hemocytometer.
7. Reserv 100 ul alikvoter i 1,5 ml centrifugrör som skall användas för en ofärgade prov och enkelfärgkontroller (beroende på antalet fluorescerande antikroppar används).
8. Lägg lämpliga fluorescensmärkta monoklonala antikroppar (vid förutbestämda koncentrationer, enligt tillverkarens instruktioner) och inkubera under 20-30 min på is, avskärmad från ljus.
   1. Att märka osteogen subpopulationen: Späd anti-CD90 (APC-anti-human CD90 (Thy1)) eller anti-CD105 (FITC anti-human CD105 (endoglin)) i FACS-buffert till en koncentration av 1:50.
   2. Att märka andra cellpopulationer (t.ex. hematopoetiska och endotelceller): Späd anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), och / eller anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) i FACS buffert till en koncentration av 1:50.
   3. Om du inte använder direkt konjugerade antikroppar, använd en biotinylerad primär antikropp med en lämplig streptavidinkonjugerat sekundary antikropp, såsom Streptavidin PE-Cy7, vid en utspädning av 1: 100.
9. Efter inkubering tvättas cellerna två gånger: fylla rören med FACS-buffert och centrifugera vid 233 xg under 5 min vid 4 ° C, aspire supernatanten.
10. Resuspendera cellerna i 400-500 pl FACS buffert och filterprov genom ett 70 pm nylon cell sil för att ta bort cellklumpar.
11. Överför märkta celler i FACS rör med filter topp och hålla prover på is under hela analysen.

3. Fluorescens-aktiverad cellsortering

OBS: Följande steg mandat förkunskaper i fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) eller hjälp av en skicklig tekniker.

1. Använda lämpliga FACS mjukvara, design analys tomter att undersöka framåtspridning (FSC), sidospridning (SSC), Phycoerythrin (PE) -Texas Röd, Pacific Blue, fluoresceinisotiocyanat (FITC), allofykocyanin (APC) och alla andra fluoroforen användningd för att märka celler.
2. Före lastning i cellen sorterare, kort vortex varje prov för att suspendera cellerna.
3. Börja med analys av det ofärgade prov för att ställa portarna för den totala cellpopulationen, för att utesluta cellrester, och för att bestämma baslinjen autofluorescens.
4. Lägg propidiumjodid (PI) till ofärgade provet och analysera den för att visualisera den population av levande celler i den totala cellpopulationen. Konstruera en grind runt denna population.
5. Analysera ett kontrollprov enda färg för varje fluorokrom för att ställa fluorescens kompensation.
6. Analysera färgade prov för att ställa in läget för portarna för sortering.
7. Lägg PI till det färgade provet för att färga döda celler.
8. Sortera märkta cellpopulationer. Sortera in i antingen 1,5 ml centrifugrör eller koniska rör (15 ml) innehållande odlingsmedium.
9. Upphöra manuellt sortera efter önskad mängd celler har erhållits.
10. Ossing FACS, utföra en renhetskontroll genom att analysera en liten fraktion (t.ex.., 500 celler) av den förvärvade cellpopulationen.
    OBS: Detta steg bekräftar renheten av de sorterade cellpopulationer. Helst bör renhet vara större än 90-95%.
11. Centrifugera cellerna vid 233 xg under 5 min vid 4 ° C omedelbart efter fullföljande av sortering och återsuspendera i 1 ml färskt medium innehållande 10% FBS.
    OBS: Den mängd medier som används kan ökas baserat på storleken av cellpelleten.
12. Plate på gelatinbelagda plattor för att förbättra cellernas livskraft. Beroende på slutlig cellutbyte, platta 300000 celler per brunn i en 6-brunnars platta, 100.000 celler per brunn i en 12-brunnars platta.

Representative Results

Använda CD90 som en markör för celler med förbättrade osteogenesis leder isolering av en höganrikat populationer av mänskliga DSK (Figur 1A, 1B). DSKer färgades med Pacific Blue-konjugerat anti-humant CD45, FITC-konjugerat anti-humant CD105, och APC-konjugerad anti-human CD90. Efter sortering, nivån av renhet var större än 98%, såsom kvantifierades genom eftersorteringsanalys.

Definiera grupper av celler baserat på transkription profiler tillåts för blivande isolering av två nya subpopulationer. För att karakterisera den osteogena potentialen hos varje lovande subpopulationen (CD90 ⁺ och CD105 ^låg), liksom den för den osorterade populationen in vitro, odlades cellerna i osteogent differentieringsmedium för 14 dagar, såsom beskrivits tidigare ^6,8,9. Alkaliskt fosfatas färgning (används för tidig upptäckt av benbildning ¹⁰⁾ vid Dag 7 ökade signifikant i CD90 ⁺ (Figur 2A). Detta observerades både grovt och efter kvantifiering (Figur 2A). Likaså Alizarin Red-färgning (en analys som används för att detektera extracellulär matris mineralisering och en metrisk för end-terminala osteogen differentiering ⁹⁾ vid dag 14 visade att CD90 ⁺ DSKer kunde mineraliserar en betydligt större mängd extracellulär matris (Figur 2B). Isolerade ASCs behåller förmågan att genomgå osteogen differentiering efter sortering men kan kräva ett par dagar att återhämta sig. Det är viktigt att utföra alla ytterligare experiment med låga passageceller, som ASCs blir senescent under förökning i kultur.

Figur 1: (A) Gates för cellstorlek och komplexitet drogs att utesluta cellrester och isolera en befolkning of enstaka celler för vidare analys. (B) FACS analys av enkel sorterade CD90 (vänster) och single-sorterade CD105 (höger) DSKer 36 timmar efter ASC skörd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: (A) Alkaliskt fosfatas färgning (överst) och kvantifiering (botten) av ASCs efter 7 dagars kultur i osteogen differentiering medium (B) Alizarin red färgning (överst) och kvantifiering av färgning (botten) av ASCs efter 14 dagar. av kultur i osteogen differentiering medium. CD90 ⁺ ASCs och CD105 ^låga celler visar ökad alkalisk fosfatas färgning och extracellulärmatrix mineralisering jämfört med osorterade celler (* p <0,05; tvåsidiga Studentst-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

För närvarande, isolering av homogena delpopulationer av ASCs från SVF av mänsklig fettvävnad förblir ett utmanande men önskvärt mål. Isolering av pro-osteogena ASC subpopulationer är särskilt önskvärd, eftersom sådana celler kan användas för att studera bildningen och homeostas av skelettvävnader. Men SVF av fettvävnad hyser betydande heterogenitet när det gäller stamcellskapacitet och differentiering potential. ¹¹ Den molekylära grunden för denna heterogenitet kan inte förstås från poolade populationer av celler, och i stället kräver enda cell analys. ¹² Med detta synsätt, ytmarkörer nära förbunden med osteogen differentiering kapacitet ASCs kan identifieras.

Den mest kritiska faktorn för framgångsrik anrikning av DSKer, såsom beskrivits i ovanstående metod, är relaterad till antikropparna som utnyttjas för FACS. Man måste vara försiktig för att välja en antikropp med en hög affinitet för cell-ytmarkör i fråga. Helst ska det vara en primär antikropp i motsats till en indirekt färgningsmetod, som kräver flera steg och därmed ökad risk för celldöd, cellförlust och fel periodiserad. Dessutom kan mindre ändringar under FACS ökar cellernas livskraft. Dessa inkluderar sortering i en sval kärl, hålla cellerna på is vid alla tidpunkter, sortering celler i kärl som innehåller odlingsmedia och även, plätering de förvärvade cellpopulationer på odlingsplattor vilka har förbelagts med 10% gelatin. Det är viktigt att utföra ett eftersorteringsrenhetsanalys, för att säkerställa renheten hos de sorterade cellerna.

Denna teknik begränsas av tillgången på FACS utrustning och kompetens inom en anläggning. Eftersom de delprov är heterogena, kommer uttrycket av ytmarkörer förändras på individuell basis. Som tidigare nämnts är det viktigt att utföra alla experiment med låga passageceller, som ASCs blir senescent under förökning i kultur. Dessutom är det känt att DSKer uppvisar en förskjutning i fenotypisk expression under in vitro-förhållanden som kan ändra den stamcellsbiologi. Således, för klinisk översättning, skulle det vara optimalt att erhålla en höggradigt renad cellpopulation för direkt transplantation eller cellsådd på en byggnadsställning utan behov av odling in vitro. Dessutom att de stora volymerna av lipoaspirate som behöver bearbetas för att isolera SVF kan vara betungande för dem obekanta med tekniken, som diskuteras och åtgärdas genom Zuk och kollegor i en nyligen publicerad ^13. Per metoden beskriven av Zuk et al., Kan detta protokoll enkelt skalas upp eller ner för att rymma volymen lipoaspirate och kan anpassas för att isolera DSKer från fettvävnad erhållits genom abdominoplasties och liknande förfaranden.

CD90 och CD105 har tidigare identifierats som tidiga mesenkymala stam cELL markörer, både i BM-MSC och ASC populationer. I linje med tidigare forskning, att CD90 ⁺ populationen utgjorde cirka 50% av den nyligen isolerade SVF. ¹⁴ Däremot endast ca 5-10% av den initiala SVF uttryckte CD105. ⁶ Noterbart med successiva passager, CD105 uttryck snabbt ökat från nästan noll till nästan ubiquitous expression efter 4-7 dagar i odling. Det är känt att DSKer uppvisar betydande fenotypisk Avvikelsen under in vitro expansion, vilket kan förändra biologin av stamceller. ^15-17 Helst skulle kliniska tillämpningar för stamceller innefatta omedelbar användning av renade cellpopulationer för direkt transplantation eller sådd på en byggnadsställning , utan behov av odling in vitro. Den procentuella andelen CD90 ⁺ celler kan variera mellan olika lipoaspirate prover i en fet depå beroende ursprung eller åldersberoende sätt. Ändå använder CD90 som cellytmarkör möjliggör anrikning ofa subpopulation av mänskliga ASCs med förbättrad osteogen potential. Denna metod för osteogen anrikning har potential att fungera som ett nytt medel för att främja en snabb och robust benbildning hos patienter med kritiska stora skelettdefekter. Vi observerar rutinmässigt som ungefärliga cellutbyte från standard lipoaspirate är 5 x 10 ⁷ kärn celler / 500 ml lipoaspirate användning av ovannämnda skörden metoden, även om enligt ovan detta kan variera beroende på fettdepå ursprung eller demografiska patientdata. ¹⁸ Yoshimura och kollegor rapporterade att DSKer representerar 10-35% av befolkningen i kärnförsedda celler i ¹⁹ Därför SVF., det finns en stor potential för direktsådd av en byggnadsställning för genomförandet av benvävnad tekniska strategier efter osteogen anrikning av DSK: er med FACS.

Stamcellsbaserad vävnadsteknik för experimentella och kliniska tillämpningar kräver ofta mycket renade cellpopulationer. Andra HIgh genomströmning reningsmetoder existera som enklare alternativ till FACS, inkluderar panorering, komplement utarmning, och magnetaktiverad cellsortering (MACS). Men i vissa situationer, är FACS både nödvändigt och fördelaktigt: när isoleringen av mycket rena subpopulationer önskas, när målet ytmarkören inträffar sällan i cellpopulationen, eller när cellerna måste separeras utifrån varierande uttrycksnivåer av samma yta markör.

Använda både mikroflödesbaserade enda cell transkriptionsanalys och fluorescens-aktiverad cellsortering, endoglin (CD105) och Thy-1 (CD90) befanns vara associerade med skillnader i ASC uttryck av osteogena gener. Statistisk analys av enstaka cell transkription profiler visade att lågt uttryck av CD105 och högt uttryck av CD90 beskriver subgrupper av DSKer med ökad osteogen kapacitet. Dessa proteiner har därefter använts för att anrika osteogena subpopulationer av celler derived från human subkutan fettvävnad. ^6,20

Tillsammans utgör dessa uppgifter visar effektiviteten av sorterings ASCs baserade på specifika cellytmarkörer som korrelerar med osteogena transkriptionsaktivitet. Även möjligheten att detta tillvägagångssätt demonstreras här med hjälp av CD90 och CD105 som exempel, behöver ytterligare analyser göras för att inkludera alla lovande kombinationer av ytantigen uttryck som starkt korrelerar med osteogen transkriptionsaktivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences