Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52182
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

Abstract

يتكون دفاع مبكر ضد مسببات الأمراض المخاطية لكل من حاجز الظهارية والخلايا المناعية الفطرية. وimmunocompetency على حد سواء، والاتصال الداخلي، ولها أهمية قصوى لحماية ضد الالتهابات. من الأفضل أن التحقيق تفاعلات الخلايا المناعية الفطرية الظهارية ومع الممرض في الجسم الحي، حيث تتكشف سلوك معقد عبر الزمان والمكان. ومع ذلك، النماذج الحالية لا تسمح لسهولة التصوير المكانية والزمانية للمعركة مع مسببات الأمراض على مستوى الغشاء المخاطي.

النموذج المطور هنا يخلق إصابة الغشاء المخاطي عن طريق الحقن المباشر للممرض فطري، المبيضات البيض، في swimbladder من الزرد الأحداث. العدوى الناجمة تمكن عالية الدقة التصوير السلوك الخلايا المناعية الظهارية والفطري في جميع أنحاء تطور مرض الغشاء المخاطي. براعة هذا الأسلوب يسمح للاستجواب من المضيف للتحقيق في تسلسل مفصل للأحداث المناعة مما يؤدي إلى فتاهالتوظيف agocyte وللنظر في أدوار معينة أنواع الخلايا والمسارات الجزيئية في مجال الحماية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير سلوك الممرض بوصفها وظيفة من الهجوم المناعي في وقت واحد باستخدام الفلورسنت، معربا عن بروتين C. البيض. زيادة القرار المكانية للتفاعل المضيف الممرض هو ممكن أيضا باستخدام تقنية swimbladder تشريح السريعة وصفها.

نموذج إصابة الغشاء المخاطي الموصوفة هنا واضح وصريح وتكرار للغاية، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة داء المبيضات المخاطية. هذا النظام قد يكون أيضا للترجمة على نطاق واسع لمسببات الأمراض المخاطية الأخرى مثل الميكروبات المتفطرات، البكتيرية أو الفيروسية التي تصيب عادة من خلال الأسطح الظهارية.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ كافة بروتوكولات الرعاية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة تحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) بروتوكول A2012-11-03.

1. الزرد تربية إلى 4 أيام بعد الإخصاب

  1. جمع AB الزرد، أو أي خطوط المعدلة وراثيا أخرى، في أول الإخصاب آخر 3 ساعة، كما هو مبين في فيديو آخر 34.
  2. احتضان البيض 120 في 15 سم أطباق بتري تحتوي على 150 مل من وسائل الاعلام E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgCl 2، 2 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.8) مع الميثيلين الأزرق (0.3 ميكروغرام / مل النهائي تركيز) في 33 ° C حاضنة مع 12/12 ضوء / الإضاءة المظلمة.
  3. استبدال وسائل الاعلام بعد 6 ساعات مع E3 + PTU (1-فينيل-2-ثيوريا، 10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) وإزالة البيض الميت.
  4. احتضان لمدة 4 أيام في 33 ° C، وتبادل وسائل الإعلام مع E3 الطازجة + PTU بعد 2 أيام.

2. فيjection مايكرو إبرة إعداد

  1. سحب الشعرية البورسليكات (OD 1.2 مم؛ ID 0.69 مم) في إبرة الجزئي باستخدام إبرة مجتذب مع الإعدادات التالية (550 الحرارة، 0 سحب، سرعة 130، 110 مرة).
    ملاحظة: تختلف الإعدادات من خيوط لخيوط للحصول على شكل وبالمثل الإبر الصغيرة (انظر الشكل 1)، وسوف تحتاج إلى إعادة تعديل كلما تم تثبيت خيوط جديدة.
  2. ملء إبرة الجزئي مع 3 ميكرولتر من 0.4 ميكرون تصفية المياه المالحة عازلة الفوسفات (PBS، 137 مم كلوريد الصوديوم؛ 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4؛ 1.8 ملي KH 2 PO 4؛ ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام 20 ميكرولتر microloader ماصة معلومات سرية.
  3. إعداد إبرة صغيرة على حامل ممص مكروى على micromanipulator تعلق على نظام حقن الضغط. ضبط ضغط الحقن إلى 30 PSI ومدة النبضة في 30 ميللي ثانية.
  4. استخدام طبق بتري مع الماء المقطر، وانخفاض الإبرة الدقيقة حتى 1/5 من الإبرة هو في الماء. مقطع واي الدقيقة إبرةث ملاقط غرامة أقل بقليل من مستوى المياه. جلب الإبرة الصغيرة من الماء، ودفع دواسة عدة مرات حتى تظهر بلعة.
  5. قياس قطر البلعة عن طريق خفض إبرة صغيرة على عدادة الكريات الطبقات مع قطرة واحدة من نوع الزيت الغمر. ضبط مدة النبضة للحصول على حجم المطلوب (انظر الجدول 1).
  6. تعيين احداهما لالبلعة أن تبقى مستقرة في الزيت (خفض ضغط إذا كان البلعة يزيد حجم وزيادة الضغط الخلفي إذا يقلل من حجم البلعة). تسجيل مدة النبضة لكل الإبرة الدقيقة.
  7. إزالة PBS من الإبرة الدقيقة بواسطة الشفط باستخدام ماصة طرف microloader وطرد اليسار الإفراط في برنامج تلفزيوني عن طريق وضعها مرة أخرى على حاقن والتقليب التحول النبض المستمر. حجز كل إبرة صغيرة.

3. إعداد المبيضات

  1. خط المبيضات البيض تحولت مع الأمثل كودون dTomato، GFP، BFP، EOS أو الأقصىالأحمر من الأسهم المجمدة (-80 ° C الأسهم في 25٪ الجلسرين) باستخدام وتد خشبي عقيمة في الصعود إلى سكر العنب الخميرة peptine (YPD) لوحة أجار (10 ز / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب ، 20 ز / L أجار، تعقيمها وسكب 25 مل في أطباق بتري) واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  2. اختيار مستعمرة واحدة باستخدام وتد خشبي معقمة وتلقيح إلى 5 مل من YPD السائل (10 غ / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب، تعقيمها وaliquotted جو معقم و مطهر في 5 مل في 16 × 150 مم الثقافة الزجاج أنابيب).
  3. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في طبل الأسطوانة على 60 دورة في الدقيقة.
  4. جمع 1 مل من C. ثقافة البيض ونقل إلى 1.7 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة بضع ثوان. إفراغ طاف وإضافة 1 مل من العقيمة PBS، دوامة بدقة. كرر ذلك مرتين.
  6. عدد المستعمرات باستخدام عدادة الكريات عن طريق تمييع 1 مل الأسهم 1: 1،000 في برنامج تلفزيوني العقيمة.

4. عن طريق الحقن اسماك الزرد فيوSwimbladder

  1. تدفئة طبق الحقن (2٪ الاغاروز) لمدة 30 دقيقة في 33 ° C الحاضنة.
  2. في الوقت المطلوب، وإزالة 100 من 150 مل من E3 + PTU من 15 سم طبق بتري تحتوي على الأسماك لحقن باستخدام ماصة 25 مل من دون أي الشفط الزرد.
  3. تخدير 4 DPF الزرد بإضافة 2 مل من 4 ملغ / مل التخزين المؤقت تريكين الميثان سلفونات الأسهم (TR) إلى 50 مل سائل الإعلام المتبقية (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) والانتظار لمدة 15 دقيقة.
  4. تحت المجهر تشريح، حدد السمك مع swimbladder تضخم. كما يمكن فحص الأسماك في ذلك الوقت عن النمط الظاهري متجانسة، مثل توزيع العدلات في الخطة الرئيسية للعمليات: خط GFP تستخدم لتشريح epifluorescence المجهر.
  5. تمييع C. الأسهم البيض من التركيز الأصلي (الخطوة 3.8) إلى 1.5 × 10 7 مستعمرة لكل مل (وت م / مل) في برنامج تلفزيوني.
  6. نقل 30 الزرد على طبق الحقن باستخدام أنابيب نقل البلاستيكTTE وإزالة وسائل الإعلام الزائد.
  7. باستخدام أداة الصيد سلك (لصقها فائقة 0.012 بوصة خط الصيد قطرها إلى الشعرية البورسليكات)، وجعل 3 خطوط من 10 الأسماك، من خلال عقد طبق حقن عموديا وتوجيه الأسماك عموديا.
  8. إزالة وسائل الإعلام الزائد.
  9. تماما دوامة أنبوب مع 1.5 × 10 7 وت م / مل C. البيض.
  10. ملء واحدة إبرة الصغيرة مع 3 ميكرولتر من C. البيض باستخدام microloader ماصة جديدة طرف وتعيين مدة النبضة إلى الإعداد المناسب (راجع الخطوة 2.9).
  11. وتناوب على طبق حقن لجعل بزاوية 20 درجة بين الإبرة الدقيقة ورئيس الأسماك، وتهدف نحو الجزء الخلفي من swimbladder (الشكل 3A).
  12. دفع الإبرة الدقيقة في swimbladder، والتأكد من تحمل الإبرة في التجويف، ثم اضغط على دواسة مرة واحدة.
  13. كرر لكل الأسماك ونقل إلى طبق الاسترداد (25 مل E3 + PTU) من الفيضانات الطبق مع E3 لد تفريغها في طبق الانتعاش.
  14. نقل 30 سمكة أخرى إلى الطبق الحقن.
  15. كرر حقن بإبرة صغيرة جديدة مليئة تماما vortexed C. البيض.
  16. النهاية عن طريق حقن السيطرة PBS، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام طبق حقن مختلفة لتجنب التلوث ونقل إلى طبق الانتعاش منفصل (الخطوة 4.10).

5. فحص الأسماك للالمرغوب اللقاح

  1. إعداد 40 مل من 0.4٪ المنخفضة للذوبان الحل الاغاروز (LMA) وذلك بإضافة 160 ملغ من انخفاض ذوبان الاغاروز إلى 40 مل من E3، عن طريق الميكروويف حتى يذوب، والتبريد إلى 37 درجة مئوية المغلي. إضافة 400 ميكرولتر من TR (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) مرة واحدة تبرد.
  2. بعد 30 دقيقة الانتعاش، وتخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU، وتركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل).
  3. نقل 30 السمك (مع وسائل الإعلام أقل قدر ممكن) إلى 2 مل من LMA في قارب وزنه.
  4. نضح الأسماك الفردية مع ماصة نقل وصفيحة السمك مع 1 قطرات من LMA في لوحة التصوير 96-جيدا، فقط باستخدام الآبار المركزية 10 × 6.
  5. كرر حتى يتم تحميل جميع الأسماك إلى الشاشة على لوحة التصوير.
  6. دع وسائل الإعلام يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  7. ضع السمك في صفهم، والتأكد من أنها على اتصال مع الجزء السفلي من الزجاج.
  8. باستخدام الهدف 20X على epifluorescence مقلوب / المجهر متحد البؤر والمرشح المناسب، تسجيل عدد من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder كل السمكة.
  9. حدد السمك مع 15-25 خلايا الخميرة في swimbladder (أو اللقاح المطلوب)، الموت ببطء الأسماك غير المحدد (800 ميكروغرام / مل من TR في E3) والعودة الأسماك المحدد إلى طبق بتري العميق مع 50 مل من E3 + PTU من قبل مضيفا 3 قطرات من E3 إلى لوحة التصوير آبار مختارة والشفط السمك مع ماصة نقل البلاستيكية.
  10. احتضان عند 33 ° C لمدة المرجوة.

6. التصوير الأسماك بعد الفحص

  1. في الوقت المطلوب، وإزالة 25 من 50 مل من وسائل الاعلام E3 + PTU من طبق بتري العميق التي تحتوي على الأسماك إلى الصورة.
  2. تخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU المتبقية، نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل).
  3. لوحة السمك في لوحة التصوير 96-جيدا والموقف بشكل مناسب (الخطوات 5،3-5،7).
  4. الصورة عن طريق المجهر متحد البؤر باستخدام أشعة الليزر المناسبة والمرشحات الانبعاثات. التركيز الأول على الأسماك باستخدام الهدف 4X تحت تدخل الفرق النقيض (DIC) والحصول على صور من المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف 20X مع الليزر مبائر في وضع المسح الضوئي مع 2 سرعة μsec / بكسل و 1024 × 600 بكسل نسبة الجانب. اكتساب Z-مداخن مع 1 ميكرومتر خطوة حجم، وتطبيق وضع مرشح كالمان من 3 الإطارات.
  5. العودة إلى طبق بتري العميق مع 50 مل E3 + PTU أو إلى individuaآبار ل (طبق 24-جيدا الثقافة، 3 مل E3 + PTU)، واحتضان عند 33 ° C.

7. تشريح Swimbladder

  1. ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ.
  2. إعداد LMA 2٪ (الخطوة 5.3 مع 160 ملغ من انصهار منخفضة الاغاروز في 8 مل من E3).
  3. وفي الوقت المطلوب، تخدير الأسماك (الخطوة 5.2).
  4. نقل 10 سمكة إلى أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي مع 1 مل من E3 والموت ببطء من خلال إضافة 200 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين (نهائي تركيز 800 ميكروغرام / مل) إلى أنبوب الطرد المركزي واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد شريحة زجاجية التصوير عن طريق وضع 4 قطرات من الشحوم فراغ في الساحة، 1 سم بعيدا على شريحة مجهرية (75 × 25 مم، الشكل 2).
  6. وضعت 2 قطرات من 2٪ LMA في وسط الساحة.
  7. ضع السمك واحد على شريحة زجاجية منفصلة تحت مجهر تشريح والتحقق من أن القلب قد توقف الضرب، وإزالة المياه الزائدة.
    8. (الشكل 4A).
  8. التقاط swimbladder من قبل القناة الهوائية مع ملاقط اليسار، فصله من الجهاز الهضمي، ووضعه في وسط LMA 2٪ قبل أن يتصلب.
  9. ضع غطاء الانزلاق (18 × 18 ملم) على أعلى من شريحة زجاجية التصوير ودفعها حتى يلمس الشحوم فراغ فضلا عن LMA (الشكل 2).
  10. صورة في غضون 10 دقيقة من تشريح كما هو موضح في الخطوة 6.4. كرر الخطوة 7،7-7،11 مع الأسماك الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حقن مكروي في swimbladder الخلفي

المنهج التجريبي المعروضة هنا يصف حقن جرعة ثابتة من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder من 4 DPF الزرد. العمل السابق مع نموذج الغمر تشير إلى أن الاستجابة المناعية للswimbladder C. البيض هو مماثل لالثدييات المخاطية المبيضات 32. نحن هنا لشرح طريقة العدوى المحورة التي هي أكثر وضوحا، استنساخه وسريعة. عدة مئات من الزرد يمكن حقن وفحص في غضون بضع ساعات.

ويتم إنجاز الإصابة دقيقة وقابلة للتكرار من swimbladder من خلال استهداف المنطقة الخلفية من الجهاز عن طريق حقن مكروي. الحقن في swimbladder هو أسهل للتعلم من معظم المسارات الأخرى لحقن مكروي الزرد اليرقات أو الجنينية (على سبيل المثال، البطين في الوريد أو الدماغ المؤخر). إعداد الأسماك قبل الحقن سيميلار إلى أن لمواقع الحقن الأخرى، باستثناء أن swimbladder يحتاج إلى تضخم حتى الأسماك القديمة. ما يقرب من 75٪ من الأسماك التي أثيرت في 33 ° C لها swimbladder تضخم بنسبة 4 DPF (لا تظهر البيانات). يقع swimbladder تحت البشرة وكذلك طبقة رقيقة العضلات والإبرة المجهرية المستخدمة لحقن الأسماك يحتاج إلى مشطوف. الزاوية التي تحقن الأسماك (الشكل 3A) كما يحسن كثيرا من سرعة وسهولة الإجراء. حقن البلعة في الجزء الخلفي من swimbladder مهم لأنه يسمح التصور من جميع خلايا الخميرة عند فحص ويتجنب وجود خلايا الخميرة على كل جانب من swimbladder، والتي سوف تحرف نطاق الاختيار. ضخ نحو الجزء الخلفي من swimbladder أيضا يتجنب خسارة ممكنة من اللقاح من خلال القناة الهوائية ثم إلى أسفل الجهاز الهضمي. التحقق من الأسماك التي تم حقنه من السهل نسبيا باسم بلعة إزاحة فقاعة الهواء والخلفي من swimbladder شغل في وقت لاحق مع وسائل الإعلام (الشكل 3C). ومن الممكن أيضا استخدام أحمر الفينول عند حقن، الأمر الذي سيجعل من التصور أسهل. بسبب حجم C. خلايا البيض الخميرة (3-4 ميكرون)، والجرعة اللقاح يقتصر على تركيزات أقل من 5 × 10 7 وت م / مل بسبب انسداد إبرة الصغرى. وهذا يسمح للحقن من بين واحد و 250 خلايا الخميرة داخل بلعة نيكولا لانغ 5. في أيدينا، حقن 4 NL في 1-1.5 × 10 7 وت م / مل أعطت نتائج أكثر اتساقا. وأدى ذلك إلى مجموعة من 10-50 خلايا الخميرة في الأسماك. تضييق اللقاح إلى 15-25 خلايا الخميرة (الشكل 3B) يعطي النمط الظاهري أكثر إحكاما والاستجابة لها. باستخدام هذه الظروف، ما يقرب من 50٪ من الأسماك حقن لديها مجموعة اللقاح المناسب مع حقن أكثر من 95٪ البقاء على قيد الحياة 24 آخر ساعة (لا تظهر البيانات). ومن الممكن أيضا للحفاظ على الأسماك مع انخفاض / ارتفاع اللقاح من أجل دراسة تأثير العبء على الممرضتطور المرض.

وswimbladder حوالي 100 الحجم الكلي نيكولا لانغ (400 × 200 × 200 ميكرون، W L خ ح خ، وذلك باستخدام صيغة لحجم الاهليلجي) حتى حقن كميات أكبر من الممكن أيضا (ما يصل إلى 3 نبضات من 4 NL كانت استخدامها دون أي تأثير كبير على بقاء الأسماك، لا تظهر البيانات).

التصوير حيوي داخلي طولي من الأسماك الفردية لمتابعة كل من المضيف والسلوك الممرض

ويمكن اتباع سلوك كل من المضيف والممرض غير جراحية لعدة أيام باستخدام هذا النموذج. القدرة على صورة تطور الإصابة بدقة عالية في الجسم الحي يمكن واستخدمت لدراسة التسبب في داء المبيضات المخاطية. العدلات تلعب دورا رئيسيا في مقاومة داء المبيضات في الفئران والبشر 35-38. باستخدام الخطة الرئيسية للعمليات: الزرد GFP 39 (العدلات تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء)، وC. البيض معربا عن dTomأتو أحمر فلوري بروتين 32، لاحظنا ديناميات المبيضات neutrophil- خلال العدوى في وقت مبكر (الشكل 4).

العدلات هي أول نوع من الخلايا الفطرية ليتم تجنيدهم للموقع الإصابة المخاطية، والتهاب swimbladder مع live C. البيض يؤدي إلى توظيف سريع ومتواصل من العدلات (الشكل 4A، B). ومن المثير للاهتمام، لا يتم تجنيد العدلات إلى حد كبير في swimbladder عندما تم حقن خلايا الخميرة قتلت الحرارة (الشكل 4A، B).

خيوط تتطور بسرعة بعد حقن خلايا الخميرة وC. تواصل البيض على الإنبات لأول 48 ساعة بعد الحقن (HPI). ومع ذلك، وبعد هذه المرحلة عدد من خيوط النقصان (الشكل 4D) ونسبة الزيادة الخميرة (لا يظهر). القدرة على متابعة الأسماك الفردية يتيح غير جراحية هذه الدراسات الطولية (لوحة 24-جيداأطباق زراعة الأنسجة)، وتسلط الضوء على الفروق الفردية في تطور المرض والاستجابات المضيفة (الشكل 4C). لا تزال هذه الدراسات التفصيلية تعداد خلايا الفطرية والمناعة في موقع الإصابة على مدى عدة أيام عملي في الماوس.

وهناك تقنية swimbladder تشريح السريعة لتحسين التصوير

التصوير تفاعل الخلايا المناعية أو الظهارية مع C. البيض من السهل نسبيا في النموذج المقدم هنا. ومع ذلك، في ظروف معينة، فإن وجود فقاعة الهواء وسمك الأنسجة المحيطة swimbladder والجلد والعضلات، ويهدد القرار المكانية تفصيلا. لتحسين جودة الصورة وضعنا طريقة لتشريح swimbladder من الزرد وصورة ذلك بسرعة (في غضون 10 دقيقة) بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 5A). وهذا مفيد خصوصا عندما التصوير خطوط الأسماك المعدلة وراثيا حيث يتم التعبير عن مضان بتواجد مطلقوهناك مضان دخيلة في الأنسجة المحيطة بها، مثل NF كيلوبايت: GFP 40 أو α-كاتينين: خطوط السترين 41،42 (الشكل 5B، C). هذه التقنية تتطلب مهارة والممارسة لأداء بسرعة، ولكن من الممكن تماما صورة 95٪ من جميع الأسماك محاولة.

الشكل (1)
الشكل 1: شكل مايكرو إبرة لحقن swimbladder. (A) نظرة عامة على الشكل الصغير إبرة والقياس. (ب) التكبير من طرف الدقيقة إبرة من A. كل خط عمودي رئيسيا في B هم 0.2 ملم على حدة.

الشكل 2
الشكل 2: التصوير الشريحة. يتم وضع قطرة LMA 2٪ في منتصف 4 نقاط من الشحوم فراغ، 1 سم بعيدا على شريحة زجاجية. وديسيتم وضع المديرية التنفيذية swimbladder في منتصف LMA وخفض زلة غطاء على رأس حتى أنه يجعل الاتصال مع LMA والشحوم فراغ.

الشكل (3)
يبقى حقن C. البيض في swimbladder المترجمة إلى موقع الحقن: الرقم 3. (A) تخطيطي للتوجه وموقف إبرة الصغرى لحقن C. البيض في الجزء الخلفي من swimbladder في 4 DPF اليرقات الزرد. (B) اللقاح الممثل بعد اختيار لحقن البلعة من 15-25 خلايا الخميرة التي كتبها المجهر epifluorescence لمدة 3 مجموعات مختلفة من الأسماك. يعني ويتمثل الخطأ المعياري للمتوسط، ن = 17، 17، و 20 للجماعات A، B، C وعلى التوالي. (C) صور الممثل C. البيض (Caf2-dTom، مضان أحمر يعبرون عن المبيضات) العدوى في AB الأحداث الزرد مباشرة بعد injection. تم الحصول على الصور مع 10X 20X والأهداف (لوحات اليسار واليمين، على التوالي) وتكون المركبة من أقصى التوقعات في القناة الحمراء (12 و 19 شرائح، على التوالي) مع شريحة واحدة في قناة DIC. الخطوط العريضة للفقاعة الهواء (الأصفر) والطلائية المبطنة (أبيض) الممثلة في اللوحة اليمنى. الحانات النطاق تمثل 250 و 50 ميكرون، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: حقن Swimbladder يسمح للتشريح المكانية والزمانية للديناميات الممرض المضيف. (A) صور الممثل من الخطة الرئيسية للعمليات: خط الأسماك GFP حقنه مع الهواء مباشرة أو الحرارة قتل (HK) Caf2-dTom في swimbladder في 4 DPF والتقط 48 HPI. الصور هي المركبة من أقصى الإسقاط على أخضرقنوات ND الحمراء (20 شرائح) وشريحة واحدة في قناة DIC. الحانات النطاق تمثل 100 ميكرون. (B، C). استضافة ردا على C. عدوى البيض. يتم تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة (أبناء العراق) في وقت مبكر من 6 HPI والحفاظ على زيادة في عدد أكثر من 48 ساعة. إمكانية الصورة والحفاظ على الأسماك الفردية فصل (لوحة 24-جيدا) تسمح للديناميات المناعة التفصيلية التي تصور. (D) استجابة مسببات الأمراض. C. خلايا الخميرة البيض والإنبات لHPI 24 الأول ولكن تعود إلى خلايا الخميرة من 24 HPI. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
يسمح تشريح للswimbladder للحصول على التفاصيل الدقيقة ليمكن تصوير: الرقم 5. (A) تمثيل تخطيطي للرانه الخطوات المتبعة في تشريح swimbladder في 4-5 DPF الزرد. الأسهم الزرقاء تشير إلى اتجاه سحب مع ملاقط (L للاليسار وR لليمين). (B، C). صور الممثل swimbladder تشريح من α-كاتينين: السترين خط الأسماك 41،42 (منعطفات ضيقة الخضراء) ضخت في 4 DPF مع C. المبيضة البيضاء (Caf2-dTom) والتقط بواسطة متحد البؤر المجهري 2 HPI. لوحات هي المركبة من أقصى التوقعات في القنوات الأحمر والأخضر (25 شرائح ل B و 3 شرائح لC) وشريحة واحدة لمدينة دبي للإنترنت في لوحة B. الحانات مقياس 100 ميكرومتر في B و 100 ميكرون و 10 ميكرون في C. من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

حجم (NL) 1 2 3 4 5
القطر (مم) 0.124 0.156 0،179 0.197 0.212

الجدول 1: حجم بولس إلى العلاقة القطر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

السلف والقيود المفروضة على swimbladder حقن مكروي نموذج المرض

والنموذج المقدم هنا هو امتداد للنموذج الغمر المخاطية المبيضات وصفها في Gratacap وآخرون (2013)؛ وتضيف مزايا وقت الإصابة التي تسيطر عليها، وجرعة العدوى استنساخه للغاية، وبالتالي تحسين الكفاءة. علينا أن نظهر هنا أساليب جديدة تسمح الوثائق الزمنية غير الغازية للديناميات العدوى بقدر كبير من التفصيل، وكذلك دقة أعلى فيفو السابقين التصوير من swimbladder. وينبغي لهذه الإجراءات تسهيل دراسة C. البيض -innate المناعة ديناميات التفاعل النظام في الغشاء المخاطي. وقد وصفت عدد محدود من نماذج العدوى المخاطية في الزرد، وكلها تقتصر على الجهاز الهضمي اضطراب / التهابات 24،43. نموذج swimbladder المقدمة هنا يمتد مواقع العدوى إلى الجهاز الذي تشترك في بعض أوجه التشابه مع رئة، ويقدم موقع تقتصرالعدوى، مع إمكانية أقل لمسببات المرض التي يجب غسلها بعيدا.

هناك العديد من العوامل الحاسمة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند اتقان هذه التقنيات. أهم نقطة هي شرط لswimbladder تضخم. وهذا يتطلب الأسماك إلى أن الذين تتراوح أعمارهم بين 5 إلى إدارة الشرطة الاتحادية عندما تربى عند 28 ° C أو 4 DPF في 33 درجة مئوية. وتستخدم هذه درجة حرارة أعلى لتسريع عملية تطوير للأسماك وتقريب أفضل مجموعة الفسيولوجية من درجات الحرارة الظهارية الثدييات (درجة حرارة الجلد الماوس هي 33.1 ° C 44). ومع ذلك، فإن تقييد هذا النموذج على هذا النطاق درجة حرارة معينة يحتاج إلى أن يوضع في الاعتبار، ويجب التأكد من صحتها الظواهر الملحوظة في نظام الثدييات لتفسير أكثر اكتمالا. موقع الحقن (وswimbladder الخلفي) أمر بالغ الأهمية أيضا، إذ لا يزال القناة الهوائية مفتوحة في الأسماك physostomous (والذي يتضمن الزرد) وارتفاع ضغط ينجection في أماكن أخرى من الجهاز يمكن دفع الممرض الماضي swimbladder وإلى الجهاز الهضمي. الكمي لقيحة هو أيضا أقل دقة إذا كانت الخلايا الخميرة ليست كلها في الجزء الخلفي من swimbladder، لأن سمك الأسماك في الجذع يجعل من الصعب تصور جانبي swimbladder. تشريح swimbladder يتطلب مهارة ويحتاج التصوير عقده مباشرة بعد لتجنب القطع الأثرية بسبب الصدمات الجسدية من الإجراء.

القيود المفروضة على تقنية هي ذات الصلة أساسا إلى مرحلة التطوير من الأسماك. وهذا يحد من استخدام التكنولوجيا morpholino لبضعة أيام الدراسة، وفعالية ضربة قاضية لابد من اختبارها بعناية للتمييز بين فعالية كاملة أو جزئية. Morpholino النشاط هذا في وقت متأخر في التنمية وقد ذكر سابقا، وأيضا نحن قد استخدمت بنجاح morpholinos في هذا النموذج، مع التحقق من صحة لصق حجب التي كانت لا تزال فعالة في 5 DPF. استخدام فارمالمخدرات acological قد يكون بديلا جيدا في هذا نموذج معين حيث لا يوجد تقييد لعمر الأسماك. استخدام الأسماك الماضي الإخصاب آخر 72 ساعة في بعض الأحيان يتطلب المزيد من الرقابة من العمل مع الزرد اليرقات، اعتمادا على لجان رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية. يتم تقييد مدة الدراسة أيضا، كما الزرد لا البقاء على قيد الحياة بمعدلات عالية لأكثر من 10 يوما في ظروف المختبر ثابتة 45. من ناحية أخرى، وذلك باستخدام صغار الأسماك من 5 DPF تنمية بدلا من الأجنة الأصغر سنا أو يرقات يسمح للدراسات حيث جميع الأجهزة مثل الكلى والكبد أو البنكرياس وظيفية بالكامل 46-49. مقارنة في المختبر ثقافة الخلية أو في نماذج الفئران الجسم الحي، وعدد من الكواشف المتاحة (الأجسام المضادة والكيميائية مضادات مستقبلات) يقتصر في الزرد. ومع ذلك، فإن إمكانية إضافة المواد الكيميائية مباشرة إلى وسائل الإعلام هي ميزة. ما زال عدد من خروج المغلوب واضعا في الزرد محدودة ولكن الريس(ه) من المستهدفين تحرير الجينوم يفتح إمكانيات مثيرة للجيل من المسوخ. مزيج من السهولة النسبية لبناء خطوط مراسل الفلورسنت يبقى (نوع معين الخلية أو يشير مسار محدد) مع شفافية الزرد الأحداث واحدة من المزايا الأساسية وفريدة من نوعها لهذا النظام.

نتطلع

والزرد نموذج عدوى swimbladder يوسع نطاق الأسئلة التي يمكن سؤاله عن التفاعل المضيف الممرض في ظهارة الفقاريات المخاطية، وتقدم طريقا جديدا للعدوى لمسببات الأمراض الأخرى التي تغزو خلال ظهارة وتسليط الضوء على فائدة هذا الجهاز لبحث مرض الفقاريات .

وقد نشرت نماذج الزرد الإصابة الظهارية على مستوى الغشاء المخاطي أن تحقيق آثار الأمعاء المسالك اضطراب بواسطة العقاقير أو الممرض 24،43. ومع ذلك، هذا النموذج المبيضات المخاطية هو أول من الاستفادة من swimbسلما، وبالتالي يمتد مجموعة من المواقع للعدوى التي يمكن أن يتم التحقيق في الزرد خارج الجهاز الهضمي. لم يتم توضيح كامل الفروق بين سطح swimbladder المخاطية والرئة الثدييات وينبغي بذل تفسير / ترجمة البيانات من هذا الطراز إلى ارتفاع الفقاريات بحذر.

العدوى swimbladder يسد الفجوة الحالية في نماذج العدوى الفقارية ويفتح نافذة لتصوير التفاعلات بين الخلايا الظهارية / المناعية الفطرية مع العامل الممرض. الآن مجموعة متنوعة من الأسئلة، سابقا خارج الحدود، هو ممكن لاستكشاف. يمكننا تحديد تفاعلات مختلفة الخلايا المناعية الفطرية مع بعضها البعض ومع الخلايا الظهارية، تجنيدهم المكانية والزمانية، وطبيعة C. البيض انتشار والتبديل الصرفي فيما يتعلق الهجوم المناعي وتطور المرض في مجموعة غير كبت المناعة. إمكانية صورة مضيف سليمة لعدة ساعات لأيام في اليونانفي التفاصيل يمثل ميزة واضحة والرئيسية لهذا النظام.

وأخيرا، فإن التشابه التعبير وجودي والجينات بين swimbladder والرئة الثدييات تشير إلى أن زيادة استهداف هذا الجهاز مع ضربة قاضية الجينات أو الأدوية الكيميائية قد تكشف عن آليات الحفظ التفاعل الميكروبية والرئة والمناعة 50-52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

الكتاب أشكر الدكتور لو ترينه والدكتور توبين لتوفير بسخاء-كاتينين α: خط الأسماك السترين وبيل جاكمان على إتاحة الفرصة لنا للقيام التصوير في مختبره. المؤلفون تقر مصادر التمويل المعاهد الوطنية للصحة (المنح 5P20RR016463، 8P20GM103423 وR15AI094406) ووزارة الزراعة الأميركية (مشروع # ME0-H-1-00517-13). يتم نشر هذه المخطوطة كما الزراعة الرئيسية وتجربة الغابات المنشور محطة رقم 3371.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml tubes Axygen MCT-175-C
Deep Petri dishes Fisher Scientific 89107-632
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) Fine Science Tools 11251-30
Wooden dowels VWR Scientific 10805-018
Low melt agarose VWR Scientific 12001-722
Flaming Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate capillary Sutter Instruments BF120-69-10
MPPI-3 injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting microscope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
20X microscope objective Olympus UPlanSApo 20x/0.75
Roller drum New Brunswick Scientific TC-7
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Glass culture tubes (16 x 150 mm) VWR Scientific 60825-435
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
HEPES (Corning) VWR Scientific BDH4520-500GP
Children clay (Play-Doh) Hasbro
CaCl2 Fisher Scientific C69-500
Methylene blue VWR Scientific VW6276-0
PTU Sigma P7629-10G
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712
Hemocytometer (Hausser scientific) VWR Scientific 15170-172
Type A immersion oil Blue Marble Products 51935
Centrifuge Eppendorf 5424
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
Agarose (Lonza) VWR Scientific 12001-870
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Fishing wire Stren
96 well imaging plate (Sensoplate) Greiner Bio-One 655892
High vacuum grease (Dow Corning) VWR Scientific 59344-055
Microslide (25 x 75 mm) VWR Scientific 48300-025
Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 VWR Scientific 48366-045
15 cm Petri dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 32-106
Glycerol (EMD chemicals) VWR Scientific EMGX0185-5
24-well culture dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 25-107
Weight boats (8.9 cm) VWR Scientific 89106-766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Tags

علم المناعة، العدد 93، الزرد، المبيضات المخاطية، والعدوى المخاطية، حاجز الظهارية، وخلايا الظهارية، والحصانة الفطرية، swimbladder،
نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C.,… More

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection. J. Vis. Exp. (93), e52182, doi:10.3791/52182 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter