Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52182
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

Abstract

הגנה מוקדמת מפני פתוגנים רירית מורכבת משני מחסום האפיתל ותאי חיסון מולדים. Immunocompetency של שניהם, ואינטרקום, הם בעל חשיבות עליונה להגנה מפני זיהומים. האינטראקציות של תאי מערכת חיסון המולדים אפיתל ועם הפתוגן נחקרות הטובות ביותר in vivo, שבו התנהגות מורכבת נפרש על פני זמן ובמרחב. עם זאת, מודלים קיימים אינם מאפשרים הדמיה מרחב ובזמן קלה של הקרב עם פתוגנים ברמה הרירית.

המודל שפותח כאן יוצר זיהום ברירית על ידי הזרקה ישירה של הפתוגן פטרייתי, קנדידה אלביקנס, לswimbladder של דג הזברה לנוער. הזיהום כתוצאה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אפיתל והמולד התנהגות תא חיסונית לאורך התפתחות מחלת רירית. הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת לחקירה של המארח כדי לחקור את הרצף המפורט של אירועים חיסוניים המובילים לphגיוס agocyte ולבחון את תפקידם של סוגי תאים מסוימים ומסלולים מולקולריים בהגנה. בנוסף, ההתנהגות של הפתוגן כפונקציה של התקפה חיסונית ניתן הדמיה בו זמנית על ידי שימוש בג-להביע חלבון פלואורסצנטי אלביקנס. רזולוציה מרחבית מוגברת של האינטראקציה מארח הפתוגן ניתן גם להשתמש בטכניקה לנתיחה swimbladder המהירה תיארה.

מודל הזיהום ברירית שתואר כאן הוא פשוט ושחזור מאוד, מה שהופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פטרת ברירית. מערכת זו יכולה להיות גם באופן רחב הניתנות לתרגום לפתוגנים ריריים אחרים כגון חיידקים mycobacterial, חיידקים או ויראלי, כי בדרך כלל להדביק באמצעות משטחי אפיתל.

Protocol

הערה: כל פרוטוקולי טיפול דג הזברה והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות NIH תחת מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) A2012-11-03 פרוטוקול.

1. דג הזברה גידול עד 4 ימי הפריה הודעה

  1. לאסוף דג הזברה AB, או כל קווים מהונדסים אחרים, תוך שלאחר ההפריה 3 שעות הראשונות, כפי שמוצג בסרטון אחר 34.
  2. דגירה 120 ביצים ב-15 סנטימטרים צלחות פטרי המכילות 150 מיליליטר של תקשורת E3 (5 mM NaCl; 0.17 מ"מ KCl; 0.33 מ"מ CaCl 2; 0.33 מ"מ MgCl 2; 2 מ"מ HEPES; pH 6.8) עם מתילן הכחול (מיקרוגרם 0.3 סופי / ml ריכוז) בחממה C ° 33 עם 12/12 האור / photoperiod כהה.
  3. החלף את התקשורת לאחר שעה 6 עם E3 + PTU (1-פניל-2-thiourea, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) ולהסיר את הביצים מתות.
  4. דגירה של 4 ימים על 33 מעלות צלזיוס, החלפת מדיה עם E3 הטרי + PTU לאחר 2 ימים.

2. בjection מיקרו-מחט הכנה

  1. משוך נימי בורוסיליקט (1.2 מ"מ OD, מ"מ ID 0.69) למייקרו-מחט באמצעות חולץ מחט עם ההגדרות הבאות (550 חום; 0 Pull; 130 Velocity; 110 זמן).
    הערה: ההגדרות תשתנה מחוט הלהט לחוט להט להשיג מיקרו-מחטים בצורה דומה (ראה איור 1) ויהיה צורך בכל פעם שסדרה את נימה חדשה מותקנת.
  2. מלא מיקרו-מחט עם 3 μl של 0.4 מיקרומטר מלוח מסונן-חיץ פוספט (PBS; 137 מ"מ NaCl; 2.7 מ"מ KCl; 10 מ"מ Na 2 HPO 4; 1.8 מ"מ KH 2 PO 4; pH 7.4) בעזרת פיפטה microloader 20 μl טיפ.
  3. הגדרת מיקרו-המחט על בעל micropipette על micromanipulator המחובר למערכת הזרקה בלחץ. הגדר את לחץ ההזרקה עד 30 PSI ומשך הדופק ליום 30 באלפיות שניים.
  4. שימוש בצלחת פטרי עם מים מזוקקים, להוריד את מיקרו-המחט עד 1/5 של המחט הוא במים. קליפ wi מיקרו-המחטth פינצטה בסדר, ממש מתחת למפלס המים. להביא מיקרו-המחט מחוץ למים וללחוץ על הדוושה מספר פעמים עד בולוס מופיע.
  5. מדוד את הקוטר של בולוס ידי הורדת מיקרו-המחט על hemocytometer שכבתי עם ירידה של סוג אחד שמן טבילה. התאם את משך הדופק כדי לקבל את העצמה הרצויה (ראה טבלה 1).
  6. הגדר את backpressure לבולוס להישאר יציב בשמן (להוריד את הלחץ אם בולוס מגביר את עוצמת השמע ולהגדיל את backpressure אם בולוס הנפח קטן). רשום את משך הדופק לכל מיקרו-מחט.
  7. הסר את PBS ממייקרו-המחט על ידי aspirating אותו באמצעות קצה פיפטה microloader ולגרש את השמאל על PBS על ידי הצבת אותו בחזרה על המזרק ומדליק את הדופק הרציף. שומר כל מיקרו-מחט.

3. הכנת קנדידה

  1. קנדידה אלביקנס Streak הפך עם אופטימיזציה קודון dTomato, GFP, BFP, EOS או רחוקאדום ממניות קפוא (-80 ° C המניה ב -25% גליצרול) באמצעות מסמרת עץ סטרילי על דקסטרוז שמרי peptine (YPD) צלחת אגר (10 גר 'שמרי L / תמצית, 20 גר' / peptone L, 20 גר '/ דקסטרוז L , אגר L / 20 g; autoclaved ושפכתי 25 מיליליטר בצלחות פטרי) ודגירת הלילה בשעה 30 ° C.
  2. פיק מושבה אחת באמצעות מסמרת עץ סטרילי ולחסן 5 מיליליטר של נוזל YPD (10 גר 'שמרי L / תמצית, 20 גר' / peptone L, 20 גר '/ דקסטרוז L, autoclaved וaliquotted סביבה נקי מחיידקים ב5 מיליליטר בתרבות זכוכית 16 x 150 מ"מ צינורות).
  3. דגירה הלילה בשעה 30 ° C בתוף רולר ב 60 סל"ד.
  4. לאסוף 1 מיליליטר של ג תרבות אלביקנס והעברה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 1.7 מיליליטר.
  5. צנטריפוגה בXG 5000 במשך כמה שניות. רוקן את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של סטרילית PBS, מערבולת ביסודיות. חזור פעמיים זה.
  6. ספירת המושבות באמצעות hemocytometer על ידי דילול מניות 1 מיליליטר 1: 1,000 בPBS סטרילי.

4. הזרקת דג הזברה בSwimbladder

  1. לחמם צלחת הזרקה (agarose 2%) למשך 30 דקות בחממה C ° 33.
  2. בזמן הרצוי, להסיר 100 של 150 מיליליטר של E3 + PTU מ -15 סנטימטרים צלחת פטרי המכילה דגים להזריק בעזרת פיפטה 25 מיליליטר ללא aspirating כל דג הזברה.
  3. הרדימי 4 DPF דג הזברה על ידי הוספת 2 מיליליטר של 4 מ"ג / מיליליטר שנאגרו tricaine מניות מתאן sulfonate (TR) לנותרה 50 מיליליטר התקשורת (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) ולהמתין במשך 15 דקות.
  4. תחת מיקרוסקופ לנתח, בחר דגים עם swimbladder מנופח. דגים גם יכולים להיות מוקרנים באותו הזמן לפנוטיפ הומוגנית, כגון הפצת נויטרופילים בMPO: קו GFP באמצעות epifluorescence לנתח מיקרוסקופ.
  5. לדלל את ג מניית אלביקנס מריכוזו המקורי (שלב 3.8) 1.5 x 10 7 מושבה להרכיב יחידות למ"ל (CFU / ml) בPBS.
  6. העבר את 30 דג הזברה על צלחת ההזרקה באמצעות צינור העברת פלסטיקטטי ולהסיר את המדיה העודפת.
  7. שימוש בכלי דיג-חוט (חוט דיג קוטר 0.012 אינץ 'סופר-דבוק לנימי ורוסיליקט), לעשות 3 שורות של 10 דגים, על ידי הלחיצה על צלחת ההזרקה אנכית ולהתמצא הדגים אנכי.
  8. הסר את המדיה העודפת.
  9. ביסודיות מערבולת הצינור עם 1.5 x 10 7 CFU / ml ג אלביקנס.
  10. מלא מיקרו-מחט אחת עם 3 μl של ג אלביקנס באמצעות קצה פיפטה microloader חדש ולהגדיר את משך הדופק להגדרה המתאימה (ראה שלב 2.9).
  11. סובב את צלחת ההזרקה לעשות זווית של 20 מעלות בין מיקרו-המחט והראש של הדג, מכוון לכיוון חלק האחורי של swimbladder (איור 3 א).
  12. לדחוף את מיקרו-המחט לתוך swimbladder, כדי לוודא שנשאת של המחט הוא בלומן, ולחץ על הדוושה פעם.
  13. חזור על פעולה עבור כל דגים ולהעביר לצלחת התאוששות (25 מיליליטר E3 + PTU) על ידי הצפת המנה עם E3ד לרוקן אותה לתוך צלחת ההתאוששות.
  14. העבר את 30 דגים אחר לצלחת ההזרקה.
  15. הזרקה חוזרת עם מיקרו-מחט חדשה מלאה ביסודיות vortexed ג אלביקנס.
  16. סיום על ידי הזרקת שליטת PBS, במידת צורך, באמצעות צלחת הזרקה שונה, כדי למנוע זיהום ולהעביר לצלחת נפרדת התאוששות (שלב 4.10).

5. הקרנת הדגים לבידוד רצוי

  1. הכן 40 מיליליטר של 0.4% נמוכים להמיס פתרון agarose (אה"ע) על ידי הוספת 160 מ"ג של נמוך להמיס agarose 40 מיליליטר של E3, רותח על ידי במיקרוגל עד שהיא נמסה, וקירור עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 400 μl של TR (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) מקורר פעם.
  2. לאחר 30 דקות התאוששות, לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מ"ל E3 + PTU, 200 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי).
  3. העברת 30 דגים (עם תקשורת קטנה ככל האפשר) עד 2 מיליליטר של LMA בסירה במשקל.
  4. דגים לשאוב בודדים עם טפטפת העברה וצלחת הדגים עם טיפות 1 של LMA לתוך צלחת הדמיה 96-היטב, רק באמצעות 10 x 6 הבארות מרכזיות.
  5. חזור על פעולה עד שכל הדגים למסך נטענים לצלחת ההדמיה.
  6. בואו התקשורת לגבש בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  7. מקם את הדגים בצד שלהם, כדי לוודא שהם נמצאים בקשר עם תחתית הזכוכית.
  8. באמצעות מטרת 20X על epifluorescence / מיקרוסקופ confocal הפוך והמסנן המתאים, לרשום את המספר של ג תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של כל דגים.
  9. בחר את הדג עם 15-25 תאי שמרים בswimbladder (או הבידוד רצוי), להרדים לא נבחרו-דגים (800 / מיליליטר מיקרוגרם של TR בE3) ולחזור דגים נבחרו לצלחת פטרי עמוקה 50 מיליליטר של E3 + PTU עם על ידי הוספת 3 טיפות של E3 לבארות שנבחרו צלחת ההדמיה וaspirating הדגים עם טפטפת העברת פלסטיק.
  10. לדגור על 33 מעלות צלזיוס למשך הרצוי.

6. הדמיה הדגים Post-ההקרנה

  1. בזמן הרצוי, להסיר 25 של 50 מיליליטר של תקשורת E3 + PTU מהצלחת העמוקה פטרי המכילה דגים לתמונה.
  2. לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מיליליטר E3 + PTU שנותר, מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי).
  3. צלחת הדגים לצלחת 96-היטב הדמיה ומיקום הולם (שלבים 5.3-5.7).
  4. תמונה על ידי סריקה מיקרוסקופית confocal באמצעות הלייזרים המתאימים ומסנני פליטה. מוקד ראשון על הדגים באמצעות מטרת 4X תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ולרכוש תמונות של האזור של עניין באמצעות מטרת 20X עם לייזרי confocal במצב סריקה עם 2 מהירות μsec / פיקסל ו1024 x 600 פיקסל יחס ממדים. לרכוש Z- ערימות עם גודל צעד מיקרומטר 1, החלת מצב מסנן קלמן של 3 מסגרות.
  5. חזור אל צלחת פטרי עמוקה עם 50 מיליליטר E3 + PTU או לindividuaבארות l (צלחת 24 גם תרבות, 3 מיליליטר E3 + PTU) ולדגור על 33 מעלות צלזיוס.

7. ביתור Swimbladder

  1. ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה.
  2. הכן LMA 2% (שלב 5.3 עם 160 מ"ג של התכה נמוכה agarose ב 8 מיליליטר של E3).
  3. בזמן הרצוי, לטשטש את הדגים (שלב 5.2).
  4. העברה 10 דגים לצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות עם 1 מיליליטר של E3 ולהרדים על ידי הוספת 200 μl של 4 מ"ג / מיליליטר Tricaine (מיקרוגרם / מיליליטר סופי ריכוז 800) לצינור צנטריפוגות ודוגר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. הכן שקופיות זכוכית הדמיה על ידי הצבת 4 טיפות של שומן ואקום בכיכר, מלבד 1 סנטימטר על microslide (75 x 25 מ"מ, איור 2).
  6. מקום 2 טיפות של 2% LMA באמצע הכיכר.
  7. הנח דג אחד בשקופית זכוכית נפרדת תחת מיקרוסקופ לנתח ולוודא שהלב הפסיק מכות, להסיר את עודפי המים.
    8. (איור 4 א).
  8. להרים את swimbladder על ידי צינור פנאומטי עם פינצטה השמאל, מפריד אותה ממערכת העיכול, ולמקם אותו במרכזה של LMA 2% לפני שהוא מבצרת.
  9. מניחים כיסוי להחליק (18 x 18 מ"מ) על גבי שקופית זכוכית הדמיה ולדחוף אותו עד שהוא נוגע גריז הוואקום, כמו גם את אה"ע (איור 2).
  10. תמונה בתוך 10 דקות של נתיחה כמתואר בשלב 6.4. חזור על שלב 7.7-7.11 עם הדגים האחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microinjection בswimbladder האחורי

השיטה הניסיונית שהוצגה כאן מתארת ​​את ההזרקה של מינון של ג עקבי תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של 4 DPF דג הזברה. עבודה קודמת עם מודל הטבילה עולה כי התגובה החיסונית swimbladder לג אלביקנס דומה לפטרת ברירית יונקים 32. כאן אנו מדגימים שיטת זיהום שונה שהיא יותר פשוט, לשחזור ומהיר; כמה מאות דג הזברה יכולות להיות מוזרקים והוקרנו בתוך כמה שעות.

זיהום מדויק ושחזור של swimbladder מושגת על ידי מיקוד באזור האחורי של האיבר על ידי microinjection. ההזרקה לswimbladder קלה יותר ללמוד מאשר רוב מסלולי microinjection האחרים לדג הזברה זחל או עוברי (למשל חדר, תוך ורידי או למוח האחורי). ההכנה של הדג לפני הזריקה היא סימיlar לזה של אתרי הזרקה אחרים, עם החריג שswimbladder צריך להיות מנופח, כדי שהדג מבוגר יותר. כ -75% מהדגים שהועלו על 33 ° C יש לי swimbladder מנופח על ידי 4 DPF (מידע לא מוצג). Swimbladder נמצא מתחת אפידרמיס, כמו גם שכבת שריר דקה ומייקרו-המחט המשמש להזרקת הדגים צריכה להיות משופע. הזווית שבה הדגים מוזרקים (איור 3 א) גם משפרת באופן משמעותי את המהירות והקלות של ההליך. הזרקה של בולוס בחלק האחורי של swimbladder חשובה כמו זה מאפשר הדמיה של כל תאי השמרים כאשר המיון וימנע את הנוכחות של תאי שמרים בכל צד של swimbladder, אשר להטות את טווח הבחירה. הזרקה לכיוון חלק האחורי של swimbladder גם תמנע אובדן אפשרי של הבידוד דרך צינור פנאומטי ולאחר מכן את מערכת העיכול. אימות שדגים כבר הזריק קלה יחסית כמו בולוס מחליף את הבועה והאווירגב swimbladder מלא לאחר מכן עם תקשורת (איור 3 ג). אפשר גם להשתמש בפנול אדום כאשר הזרקה, אשר יהפוך את ההדמיה קלה יותר. בגלל הגודל של ג תאי שמרי אלביקנס (3 - 4 מיקרומטר), מנת הבידוד מוגבלת לריכוזים נמוכים 5 x 10 7 CFU / ml כתוצאה מסתימת מיקרו-המחט. זה מאפשר ההזרקה של בין אחד ו -250 תאי שמרים בתוך 5 בולוס nl. בידיים שלנו, הזרקת 4 nl ב1-1.5 x 10 7 CFU / ml נתן תוצאות עקביות ביותר. זה הביא מגוון של 10-50 תאי שמרים לדגים. צמצום הבידוד לתאי שמרים 15-25 (איור 3) נותן פנוטיפ ותגובה חזק יותר. שימוש בתנאים אלה, יש לי כ -50% מהדגים שהוחדרו מגוון הבידוד המתאים עם מעל 95% הישרדות לאחר 24 שעות הזרקה (מידע לא מוצג). אפשר גם לשמור על דגים עם הבידוד נמוך / גבוה יותר על מנת לחקור את ההשפעה של נטל הפתוגן בהתפתחות מחלה.

Swimbladder הוא כ 100 נפח כולל NL (400 x 200 x 200 מיקרומטר, W x H x L, באמצעות הנוסחא עבור הנפח של אליפסואיד) כך ההזרקה של כמויות גבוהות יותר הוא גם אפשרי (עד 3 פולסים של 4 nl היה שימוש ללא כל השפעה משמעותית על ההישרדות של הדגים; מידע לא מוצג).

ההדמיה intravital אורך של דגים בודדים לעקוב גם מארח והפתוגן התנהגות

ההתנהגות של שניהם מארח והפתוגן ניתן בעקבות הלא פולשני במשך כמה ימים באמצעות מודל זה. יכולת תמונת הפיתוח של הזיהום ברזולוציה גבוהה in vivo יכולה ונעשתה שימוש כדי לבחון את הפתוגנזה של פטרת ברירית. נויטרופילים לשחק תפקיד מפתח בהתנגדות לפטרת בעכברים ובבני אדם 35-38. MPO שימוש: דג הזברה GFP 39 (נויטרופילים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק), ו- C. אלביקנס להביע dTomATO חלבון ניאון אדום 32, שראינו דינמיקת קנדידה neutrophil- במהלך הזיהום מוקדם (איור 4).

נויטרופילים הם הסוג הראשון מולדת התא שיגויס לאתר של זיהום ברירית, והזיהום של swimbladder עם ג החי אלביקנס מוביל לגיוס מהיר ומתמשך של נויטרופילים (איור 4 א ', ב'). מעניין, נויטרופילים לא יגויסו באופן משמעותי לswimbladder כאשר תאי שמרים-נהרג חום הוזרקו (איור 4 א ', ב').

חוטים לפתח במהירות לאחר ההזרקה של תאי שמרים וג אלביקנס ממשיך לנבוט לתפקיד הזריקה הראשונה 48 שעות (HPI). עם זאת, לאחר שלב זה מספר החוטים יורד (איור 4D) וחלקם של שמרי עליות (לא מוצג). (צלחת 24 גם היכולת לעקוב אחר דגים בודדים הלא פולשני מאפשרים מחקרים ארוכי טווח אלהמנות בתרבית רקמה) ומדגישה את ההבדלים בין-האישיים בהתקדמות מחלה ותגובות מארח (איור 4C). בחינה מדוקדקת כזו, ספירת תאי פטרייה וחיסוניים באתר של זיהום על פני כמה ימים להישאר מעשית בעכבר.

טכניקה לנתיחה swimbladder מהירה כדי לשפר את ההדמיה

הדמיה האינטראקציה של תאי מערכת חיסון או אפיתל עם ג אלביקנס הוא קל יחסית במודל שהוצג כאן. עם זאת, בנסיבות מסוימות, הנוכחות של בועת האוויר ואת העובי של הרקמה הסובבת swimbladder, העור ושרירים, פוגעים ברזולוציה מרחבית מפורטת. כדי לשפר את איכות תמונה שפיתחנו שיטה לנתח את swimbladder מתוך דג הזברה ותמונתו במהירות (תוך 10 דקות) על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 5 א). התכונה זו שימושית במיוחד כאשר הדמיה קווי דג מהונדסים שבו באו לידי ביטוי בכל מקום הקרינהויש הקרינה מיותרת ברקמה הסובבת, כגון NF-κB: GFP 40 או α-קטנין: קווי 41,42 סיטרין (איור 5 ב, ג). הטכניקה דורשת מיומנות ותרגול כדי לבצע במהירות, אבל זה אפשרי לחלוטין תמונה 95% מכל הדגים ניסו.

איור 1
איור 1: צורת מיקרו-מחט להזרקת swimbladder. סקירה כללית (א) לצורת מיקרו-המחט והמדידה. הגדלה (B) של קצה מיקרו-מחט מא כל קו אנכי המרכזי בB הוא 0.2 מ"מ זה מזה.

איור 2
איור 2: הדמיה שקופיות. ירידת LMA 2% ממוקמת באמצע 4 נקודות של שומן ואקום, מלבד 1 סנטימטר בשקופית זכוכית. Disseswimbladder cted ממוקם באמצע LMA ולהחליק את מכסה הוא הוריד בראש עד שהוא יוצר קשר עם LMA וגריז הוואקום.

איור 3
איור 3: הזרקה של אלביקנס ג בswimbladder נשאר מקומי לאתר של הזרקה. () סכמטי של ההתמצאות ומיקום של מיקרו-המחט להזריק אלביקנס ג לחלק האחורי של swimbladder ב 4 DPF זחלי דג הזברה. הבידוד נציג לאחר הבחירה לבולוס הזרקה של תאי שמרים 15-25 על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (B) במשך 3 קבוצות שונות של דגים. אומר וסטיית התקן של הממוצע מיוצג, n = 17, 17, ו -20 לקבוצות A, B, ו- C, בהתאמה. (ג) נציג תמונות של ג אלביקנס (CaF2-dTom, הקרינה אדומה מביעה קנדידה) זיהום בדג זברה לנוער AB מייד לאחר Injection. תמונות נרכשו עם 10X 20X ויעדים (פנלי ימין ועל שמאל, בהתאמה), והם מרוכבים של תחזיות המרביות במסלול האדום (12 ו -19 פרוסות, בהתאמה) עם פרוסה אחת בערוץ דסק"ש. קווי המתאר של בועות האוויר (הצהוב) ואפיתל קרונית (לבן) מיוצגים בפנל השמאלי. ברים סולם מייצגים 250 ו 50 מיקרומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הזרקת Swimbladder מאפשרת לנתיחה מרחב ובזמן של דינמיקת הפתוגן המארח. (א) נציג תמונות של MPO: קו דגי GFP מוזרקים עם נהרג (HK) CaF2-dTom חי או חום בswimbladder ב 4 DPF וצלמו 48 HPI. תמונות הן מרוכבים של הקרנה מקסימלי בירוקערוצי nd אדומים (20 פרוסות) ופרוסה אחת בערוץ דסק"ש. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. (B, C). לארח תגובה לג זיהום אלביקנס. נויטרופילים מגויסים לאתר של זיהום (SOI) כבר בגיל 6 HPI ולשמור על הגדלת במספר מעל 48 שעות. האפשרות לתמונה ולשמור דגים בודדים המופרדים (24 גם צלחת) מאפשרת לדינמיקה חיסונית מפורטת להיות דמיין. תגובה (D) פתוגן. ג תאי שמרי אלביקנס הם נובטים לHPI 24 הראשון אבל יחזרו לתאי שמרים מ -24 HPI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: Dissection של swimbladder מאפשר לפרטים עדינים להיות צילמו. (א) ייצוג סכמטי של tהוא דורך מעורב בנתיחה של swimbladder בדג הזברה 4-5 DPF. חיצים כחולים מצביעים על הכיוון של משיכת עם פינצטה (L לשמאל וR לימין). (B, C). נציג תמונות של swimbladder גזור מα-קטנין: קו סיטרין דגים 41,42 (צמתים הדוקים ירוקים) מוזרקים בDPF 4 עם אלביקנס ג (CaF2-dTom) וצלמו על ידי מיקרוסקופ 2 HPI confocal. פנלים הם מרוכבים של תחזיות המרביות בערוצים האדומים וירוקים (25 פרוסות לB ו -3 פרוסות לC) ופרוסה אחת לדסק"ש בברים בקנה מידת B. פנל 100 מיקרומטר בB ו- 100 מיקרומטר ו -10 מיקרומטר ג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נפח (NL) 1 2 3 4 5
קוטר (מ"מ) 0.124 0.156 .179 0.197 0.212

טבלה 1: בולוס נפח למערכת יחסים בקוטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התקדמות ומגבלות מודל המחלה microinjection swimbladder

המודל שהוצג כאן הוא הרחבה של מודל טבילת פטרת הרירי המתואר בGratacap et al (2013).; זה מוסיף את היתרונות של זמן זיהום בשליטה, במינון מאוד לשחזור זיהום, ושיפור יעילות ולכן. אנו מדגימים כאן שיטות חדשות המאפשרות תיעוד לא פולשנית זמני של דינמיקת זיהום בפירוט רב, כמו גם הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר vivo לשעבר של swimbladder. נהלים אלה צריכים להקל על המחקר של ג אלביקנס -innate דינמיקת אינטראקציה מערכת חיסונית ברירית. מספר מצומצם של דגמי זיהום ברירית תוארו בדג הזברה, כל מוגבל להפרעה / זיהומים בדרכי עיכול 24,43. מודל swimbladder מוצג כאן מרחיב את האתרים של זיהום לאיבר שמחולק כמה קווי דמיון לריאות ומציע אתר מוגבלשל זיהום, עם פחות אפשרות לפתוגן שנשטף.

ישנם מספר גורמים קריטיים שחייבות להילקח בחשבון בעת ​​השליטה בטכניקות אלה. הנקודה החשובה ביותר היא הדרישה לswimbladder מנופח. זה מחייב את הדגים לגילי 5 DPF כאשר גודלו על 28 מעלות צלזיוס או 4 DPF על 33 מעלות צלסיוס טמפרטורה גבוהה זו משמשת כדי להאיץ את הפיתוח של הדגים וטובים יותר להתקרב לטווח הפיזיולוגי של טמפרטורות אפיתל יונקים (טמפרטורת עור עכבר היא 33.1 מעלות צלזיוס 44). עם זאת, ההגבלה של מודל זה לטווח טמפרטורה מסוים זה צריך להיות כל הזמן בראש ופנוטיפים שנצפו צריכים להיות מאומתים במערכת יונקים לפרשנות מלאה יותר. אתר ההזרקה (swimbladder האחורי) הוא גם קריטי, כמו הצינור פנאומטי נשאר פתוח בדגי physostomous (הכולל דג הזברה) וinj בלחץ גבוהection במקומות אחר באיבר יכול לדחוף את הפתוגן העבר swimbladder ולמערכת העיכול. כימות של הבידוד היא גם מדויקת פחות, אם תאי השמרים הם לא כל בחלק האחורי של swimbladder, כי העובי של הדגים בתא המטען עושה את זה קשה לדמיין את שני הצדדים של swimbladder. Dissection של swimbladder דורש מיומנות והדמיה צריכה לקחת מקום מייד לאחר להימנע חפצים בשל הטראומה הפיסית של ההליך.

המגבלות של הטכניקה הן בעיקר קשורות לשלב ההתפתחותי של הדגים. זה מגביל את השימוש בטכנולוגית morpholino לכמה ימים של מחקר, ויעילות מציאה יש להיבדק בקפידה כדי להפלות בין יעילות מלאה או חלקית. Morpholino פעילות זו בשלב מאוחר בהתפתחות כבר דווח בעבר, וגם השתמשנו בהצלחה morpholinos במודל זה, עם תוקף אחוי חסימה שעדיין הייתה יעיל ב 5 DPF. השימוש בפארםתרופות acological עשויות להיות חלופה טובה בדגם מיוחד זה שכן אין הגבלה לגיל של הדג. השימוש בדגי העבר 72 שעות לאחר ההפריה לפעמים דורש יותר פיקוח מאשר לעבוד עם דג הזברה זחל, בהתאם לועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדיים. אורכו של המחקר הוא גם מוגבל, כדג זברה אינה שורד בשיעורים גבוהים יותר מ- 10 ימים בתנאי מעבדה סטטי 45. מצד השני, שימוש בדגים לנוער של 5 DPF פיתוח במקום עוברים או זחלים צעירים מאפשר ללימודים שבו כל האיברים כמו כליות, כבד או לבלב הם פונקציונליים 46-49 באופן מלא. בהשוואה לתרבות תאים במבחנה או במודלים עכבריים vivo, המספר של חומרים כימיים זמינים (נוגדנים ואת יריבים-אגוניסטים כימיים) מוגבל בדג הזברה; עם זאת, האפשרות להוסיף כימיקלים ישירות לתקשורת היא יתרון. מספר נוקאאוט ודג הזברה לדפוק בהוא עדיין מוגבל אך RISדואר של עריכת הגנום ממוקדת פותח אפשרויות מרגשות עבור הדור של מוטציות. השילוב של הקלות יחסית לבניית קווי כתב ניאון (סוג תא מסוים או מסלול איתות ספציפי) עם השקיפות של דג הזברה לנוער נשאר אחד היתרונות העיקריים וייחודיים של מערכת זו.

במבט קדימה

מודל זיהום swimbladder דג הזברה מרחיב את הטווח של שאלות שיכולים להישאל על אינטראקציה מארח הפתוגן באפיתל הרירי חוליות, המציע מסלול חדש של זיהום לפתוגנים אחרים שלפלוש דרך האפיתל ומדגיש את התועלת של איבר זה לחיטוט מחלה חוליות .

מודלים דג הזברה של זיהום אפיתל ברמה הרירית פורסמו כי לחקור את ההשפעות של הפרעת מעיים על ידי תרופות או פתוגן 24,43. עם זאת, מודל פטרת רירית זו הוא ראשון לנצל את swimbסולם וכך מרחיב את הטווח של אתרים של זיהום שיכול להיחקר בדג הזברה מעבר למערכת העיכול. הבדלים בין המשטח הרירי swimbladder והריאות של יונקים לא הובהרו במלואו ופרשנות / תרגום של נתונים ממודל זה לחוליות גבוהות יותר צריך להיעשות בזהירות.

זיהום swimbladder ממלא פער נוכחי בדגמי זיהום חוליות ופותח חלון להדמית האינטראקציות של תאי אפיתל / חיסון מולדים עם הפתוגן. עכשיו מגוון רחב של שאלות, בעבר מחוץ לתחום, אינו ריאלי לחקור. אנחנו יכולים לקבוע את יחסי הגומלין של תאים חיסוניים מולדת שונים אחד עם השני ועם תאי אפיתל, גיוס מרחב ובזמן שלהם, ואת האופי של ג התפשטות אלביקנס ומיתוג מורפולוגיים ביחס להתקפה חיסונית והתקדמות מחלה במארח שאינה immunosuppressed. האפשרות לתמונת מארח שלם במשך כמה שעות עד ימים בGREבפירוט מייצג יתרון ברור וגדול של מערכת זו.

לבסוף, דמיון הביטוי אונטולוגית וגנים בין swimbladder והריאות של היונקים מציע עוד כי מיקוד איבר זה במציאת גן או תרופות כימיות עלול לחשוף את המנגנונים שמורים של אינטראקציה של חיידקים-ריאה ואימונולוגיה 50-52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר Le טרין וד"ר טובין לנדיבות מתן α-קטנין: קו דגי סיטרין וביל ג'קמן על שאפשר לנו לעשות את הצילומים במעבדה שלו. המחברים מודים מקורות מימון המכון הלאומי לבריאות (המענקים 5P20RR016463, 8P20GM103423 וR15AI094406) ומשרד חקלאות אמריקאי (פרויקט # ME0-H-1-00517-13). כתב יד זה מתפרסם כחקלאות וראשי ניסוי יערנות מספר פרסום התחנה 3371.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml tubes Axygen MCT-175-C
Deep Petri dishes Fisher Scientific 89107-632
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) Fine Science Tools 11251-30
Wooden dowels VWR Scientific 10805-018
Low melt agarose VWR Scientific 12001-722
Flaming Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate capillary Sutter Instruments BF120-69-10
MPPI-3 injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting microscope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
20X microscope objective Olympus UPlanSApo 20x/0.75
Roller drum New Brunswick Scientific TC-7
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Glass culture tubes (16 x 150 mm) VWR Scientific 60825-435
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
HEPES (Corning) VWR Scientific BDH4520-500GP
Children clay (Play-Doh) Hasbro
CaCl2 Fisher Scientific C69-500
Methylene blue VWR Scientific VW6276-0
PTU Sigma P7629-10G
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712
Hemocytometer (Hausser scientific) VWR Scientific 15170-172
Type A immersion oil Blue Marble Products 51935
Centrifuge Eppendorf 5424
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
Agarose (Lonza) VWR Scientific 12001-870
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Fishing wire Stren
96 well imaging plate (Sensoplate) Greiner Bio-One 655892
High vacuum grease (Dow Corning) VWR Scientific 59344-055
Microslide (25 x 75 mm) VWR Scientific 48300-025
Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 VWR Scientific 48366-045
15 cm Petri dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 32-106
Glycerol (EMD chemicals) VWR Scientific EMGX0185-5
24-well culture dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 25-107
Weight boats (8.9 cm) VWR Scientific 89106-766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 93 דג הזברה פטרת הרירי זיהום ברירית מחסום האפיתל תאי אפיתל חסינות מולדת swimbladder,
דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C.,… More

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection. J. Vis. Exp. (93), e52182, doi:10.3791/52182 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter