Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Swimbladder इंजेक्शन द्वारा लार्वा zebrafish में mucosal कैंडिडिआसिस मॉडलिंग

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52182
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

Abstract

श्लैष्मिक रोगजनकों के खिलाफ प्रारंभिक रक्षा एक उपकला बाधा और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं दोनों के होते हैं। दोनों की immunocompetency, और उनकी ख़बर, संक्रमण से बचाव के लिए सर्वोपरि हैं। एक रोगज़नक़ के साथ उपकला और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत सबसे अच्छा जटिल व्यवहार के समय और स्थान पर करेंगी जहां विवो में जांच कर रहे हैं। हालांकि, मौजूदा मॉडलों श्लैष्मिक स्तर पर रोगजनकों के साथ लड़ाई के लिए आसान spatio- लौकिक इमेजिंग के लिए अनुमति नहीं है।

यहाँ विकसित मॉडल किशोर zebrafish के swimbladder में फंगल रोगज़नक़, कैंडिडा सफेद, के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा एक mucosal संक्रमण पैदा करता है। जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण म्यूकोसल रोग के विकास के दौरान उपकला और सहज प्रतिरक्षा सेल व्यवहार के उच्च संकल्प इमेजिंग सक्षम बनाता है। इस विधि की चंचलता पीएच के लिए अग्रणी प्रतिरक्षा घटनाओं की विस्तृत अनुक्रम की जांच के लिए मेजबान की पूछताछ के लिए अनुमति देता हैagocyte भर्ती विशेष प्रकार की कोशिकाओं और संरक्षण में आणविक रास्ते की भूमिका की जांच करने के लिए और। इसके अलावा, प्रतिरक्षा हमले के एक समारोह के रूप में रोगज़नक़ के व्यवहार फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त सी का उपयोग करके एक साथ imaged किया जा सकता है श्वेत। मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का बढ़ता स्थानिक संकल्प वर्णित तेजी swimbladder विच्छेदन तकनीक का उपयोग भी संभव है।

यहाँ वर्णित श्लैष्मिक संक्रमण मॉडल यह श्लैष्मिक कैंडिडिआसिस के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रही है, सीधा और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इस प्रणाली को भी इस तरह के सामान्य रूप से उपकला सतहों के माध्यम से संक्रमित है, कि माइक्रोबैक्टीरियल बैक्टीरियल या वायरल रोगाणुओं के रूप में अन्य श्लैष्मिक रोगजनकों के लिए मोटे तौर पर अनुवाद हो सकता है।

Protocol

नोट: सभी zebrafish देखभाल प्रोटोकॉल और प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल A2012-11-03 तहत एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

चार दिनों के बाद निषेचन के लिए 1. Zebrafish पालन

  1. एक और वीडियो 34 में दिखाया गया है, पहले 3 घंटा बाद निषेचन के भीतर, अटल बिहारी zebrafish, या किसी भी अन्य ट्रांसजेनिक लाइनों ले लीजिए।
  2. (; 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी HEPES, पीएच 6.8 से 5 मिमी NaCl) methylene नीले रंग के साथ (0.3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / अंतिम E3 के मीडिया की 150 मिलीग्राम से युक्त एक 15 सेमी पेट्री डिश में 120 अंडे सेते 12/12 / प्रकाश अंधेरे photoperiod के साथ एक 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एकाग्रता)।
  3. E3 + पी टी यू (1-फिनाइल-2-Thiourea, 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल अंतिम एकाग्रता) के साथ 6 घंटे के बाद मीडिया को बदलें और मृत अंडे को हटा दें।
  4. दो दिनों के बाद नए सिरे से E3 + पी टी यू के साथ मीडिया का आदान प्रदान, 33 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए सेते हैं।

2. मेंjection सूक्ष्म सुई तैयारी

  1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक सुई खींचने का उपयोग कर एक माइक्रो सुई में; borosilicate केशिका (आईडी 0.69 मिमी आयुध डिपो 1.2 मिमी) खींचो (550 हीट; 0 खींच; 130 वेग; 110 बार)।
    नोट: सेटिंग्स फिलामेंट से भिन्न होगी (चित्रा 1 देखें) इसी तरह के आकार का सूक्ष्म सुई प्राप्त करने के लिए रेशा करने के लिए और एक नया रेशा स्थापित किया गया है, जब भी पुनः समायोजन करने की आवश्यकता होगी।
  2. 0.4 माइक्रोन फ़िल्टर फॉस्फेट बफर खारा के 3 μl के साथ एक सूक्ष्म सुई भरें (; 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, पीबीएस 10 मिमी ना 2 HPO 4; 1.8 मिमी के.एच. 2 पीओ 4; 7.4 पीएच) एक 20 μl microloader पिपेट का उपयोग टिप।
  3. एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली से जुड़ी एक micromanipulator पर एक micropipette धारक पर सूक्ष्म सुई सेट करें। 30 साई को इंजेक्शन के दबाव और 30 मिसे में पल्स अवधि निर्धारित करें।
  4. सुई का 1/5 पानी में है जब तक आसुत जल के साथ एक पेट्री डिश का उपयोग करना, सूक्ष्म सुई कम है। सूक्ष्म सुई वाई क्लिपसिर्फ पानी के स्तर से नीचे ठीक चिमटी वें। पानी से बाहर सूक्ष्म सुई लाने और एक सांस में प्रकट होता है जब तक पेडल कई बार धक्का।
  5. प्रकार की एक बूंद एक विसर्जन के तेल के साथ स्तरित एक hemocytometer पर सूक्ष्म सुई को कम से सांस की व्यास उपाय। वांछित मात्रा प्राप्त करने के लिए पल्स अवधि को समायोजित (1 टेबल देखें)।
  6. तेल में स्थिर रहेगा (सांस की मात्रा बढ़ जाती है अगर दबाव कम है और सांस की मात्रा कम हो जाती है अगर backpressure वृद्धि) को सांस के लिए backpressure सेट करें। प्रत्येक सूक्ष्म सुई के लिए पल्स अवधि रिकार्ड।
  7. एक microloader विंदुक टिप का उपयोग कर यह aspirating द्वारा सूक्ष्म सुई से पीबीएस निकालें और इंजेक्टर पर इसे वापस रखने और निरंतर नाड़ी स्विच flipping द्वारा बाएं से अधिक पीबीएस निष्कासित। प्रत्येक सूक्ष्म सुई सुरक्षित रखते हैं।

3. कैंडिडा तैयारी

  1. स्ट्रीक कैंडिडा सफेद कोडोन अनुकूलित dTomato, GFP, BFP, EOS या सुदूर साथ तब्दीलएक खमीर peptine डेक्सट्रोज (YPD) अगर प्लेट (10 जी / एल खमीर निकालने, 20 ग्राम / एल peptone पर एक बाँझ लकड़ी dowel का उपयोग कर एक जमे हुए स्टॉक से (-80 डिग्री सेल्सियस के शेयर 25% ग्लिसरॉल में) लाल, 20 ग्राम / एल डेक्सट्रोज 20 जी / एल अगर; autoclaved और पेट्री डिश में 25 मिलीलीटर डाला) और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. एक बाँझ लकड़ी dowel का उपयोग कर एक कॉलोनी उठाओ और YPD तरल (10 जी / एल खमीर निकालने, 20 ग्राम / एल peptone, 20 ग्राम / एल डेक्सट्रोज 5 एमएल को टीका लगाना, autoclaved और aseptically 16 एक्स 150 मिमी कांच संस्कृति में 5 मिलीलीटर में aliquotted ट्यूब)।
  3. 60 rpm पर एक रोलर ड्रम में 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  4. सी के 1 मिलीलीटर लीजिए एक 1.7 मिलीलीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में श्वेत संस्कृति और हस्तांतरण।
  5. सेकंड के एक जोड़े के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला खाली है और अच्छी तरह से बाँझ पीबीएस, भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। दो बार दोहराएँ।
  6. बाँझ पीबीएस में 1,000: 1 मिलीलीटर शेयर एक गिराए द्वारा एक hemocytometer का उपयोग कालोनियों गणना।

4. में zebrafish इंजेक्शनSwimbladder

  1. एक 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक इंजेक्शन पकवान (2% agarose) गर्म।
  2. वांछित समय, किसी भी zebrafish aspirating के बिना एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग इंजेक्षन करने के लिए मछली युक्त 15 सेमी पेट्री डिश से E3 + पी टी यू की 150 मिलीलीटर की 100 हटा दें।
  3. शेष 50 मिलीलीटर मीडिया (अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के लिए एक 4 मिलीग्राम / एमएल Buffered tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट शेयर (टीआर) के 2 मिलीलीटर जोड़कर zebrafish DPF 4 anesthetize और 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक फुलाया swimbladder साथ मछली का चयन करें। मछली भी ऐसे MPO में न्युट्रोफिल वितरण के रूप में, समरूप phenotype के लिए उस समय की जांच की जा सकती है: GFP लाइन खुर्दबीन विदारक एक epifluorescence का उपयोग कर।
  5. सी पतला अपने मूल एकाग्रता से श्वेत शेयर 1.5 10 x 7 कॉलोनी पीबीएस में मिलीलीटर (CFU / एमएल) के प्रति इकाइयों के गठन के लिए (कदम 3.8)।
  6. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पाइप का उपयोग इंजेक्शन पकवान पर 30 zebrafish स्थानांतरणटीटीई और अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।
  7. एक मछली पकड़ने-तार उपकरण (0.012 इंच व्यास मछली पकड़ने की रेखा एक borosilicate केशिका में सुपर चिपके) का उपयोग करना, खड़ी इंजेक्शन पकवान धारण करके 10 मछली, के 3 लाइनों बनाने और खड़ी मछली मालूम।
  8. अतिरिक्त मीडिया निकालें।
  9. अच्छी तरह से 1.5 10 x 7 CFU के साथ ट्यूब भंवर / एमएल सी श्वेत।
  10. सी के 3 μl के साथ एक सूक्ष्म सुई भरें श्वेत एक नया microloader विंदुक टिप का उपयोग और उपयुक्त सेटिंग को पल्स अवधि निर्धारित (कदम 2.9 देखें)।
  11. Swimbladder (चित्रा 3 ए) के पीछे की ओर लक्ष्य, सूक्ष्म सुई और मछली के सिर के बीच 20 डिग्री के कोण बनाने के लिए इंजेक्शन पकवान घुमाएँ।
  12. , Swimbladder में सूक्ष्म सुई धक्का सुई के बोर लुमेन में है यकीन कर रही है, और एक बार पेडल दबाएँ।
  13. प्रत्येक मछली के लिए दोहराएँ और E3 एक साथ पकवान बाढ़ से एक वसूली पकवान (25 मिलीलीटर E3 + पी टी यू) के लिए स्थानांतरणडी वसूली डिश में यह खाली।
  14. इंजेक्शन डिश के लिए एक और 30 मछली स्थानांतरण।
  15. अच्छी तरह से भरा एक नया सूक्ष्म सुई के साथ दोहराएँ इंजेक्शन सी vortexed श्वेत।
  16. यदि आवश्यक हो तो संक्रमण से बचने और एक अलग वसूली पकवान (कदम 4.10) को स्थानांतरित करने के लिए एक अलग इंजेक्शन पकवान का उपयोग करते हुए, पीबीएस नियंत्रण इंजेक्शन लगाने के द्वारा समाप्त करें।

5. वांछित inoculum के लिए मछली स्क्रीनिंग

  1. जब तक भंग microwaving, और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा करके उबलते, E3 के 40 मिलीलीटर 0.4% agarose समाधान (LMA) कम पिघल के 160 मिलीग्राम जोड़कर कम पिघल agarose के लिए 40 एमएल तैयार करें। एक बार ठंडा टी.आर. (अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के 400 μl जोड़ें।
  2. (25 एमएल में E3 + पी.टी.यू., अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में टी.आर. का केवल 1 मिलीलीटर का उपयोग कर कदम 4.3) के रूप में वर्णित 30 मिनट वसूली के बाद, मछली चतनाशून्य।
  3. एक वजन नाव में LMA के 2 मिलीलीटर (जितना संभव हो कम मीडिया के साथ) स्थानांतरण 30 मछली।
  4. महाप्राण व्यक्ति एक हस्तांतरण विंदुक के साथ मछली और केवल 10 एक्स 6 केंद्रीय कुओं का उपयोग करते हुए, एक 96 अच्छी तरह से इमेजिंग थाली में LMA की एक बूंदों के साथ मछली थाली।
  5. स्क्रीन करने के लिए सभी मछली इमेजिंग थाली करने के लिए लोड कर रहे हैं जब तक दोहराएँ।
  6. मीडिया 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमना।
  7. वे कांच नीचे के साथ संपर्क में हैं सुनिश्चित करते हुए उनके पक्ष में मछली स्थिति।
  8. एक औंधा epifluorescence / confocal खुर्दबीन और उपयुक्त फिल्टर पर 20x उद्देश्य का उपयोग, सी की संख्या रिकॉर्ड प्रत्येक मछली के swimbladder में श्वेत खमीर कोशिकाओं।
  9. , Swimbladder में 15-25 खमीर कोशिकाओं के साथ मछली (या वांछित inoculum) का चयन करें euthanize गैर चयनित मछली (E3 में टी.आर. के 800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और द्वारा E3 + पी टी यू के 50 मिलीलीटर के साथ एक गहरी पेट्री डिश के लिए चयनित मछली लौटने इमेजिंग थाली चयनित वेल्स को E3 के तीन बूँदें जोड़ने और एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ मछली aspirating।
  10. वांछित अवधि के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

6. मछली पोस्ट-स्क्रीनिंग इमेजिंग

  1. वांछित समय, छवि के लिए मछली युक्त गहरी पेट्री डिश से E3 + पी टी यू मीडिया के 50 मिलीलीटर की 25 को हटा दें।
  2. (25 मिलीलीटर E3 + पी टी यू शेष, अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में टी.आर. का केवल 1 मिलीलीटर का उपयोग कर कदम 4.3) के रूप में वर्णित मछली चतनाशून्य।
  3. उचित रूप से एक 96 अच्छी तरह से इमेजिंग प्लेट और स्थिति में मछली प्लेट (5.3-5.7 कदम)।
  4. उपयुक्त लेज़रों और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा छवि। प्रथम अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के तहत 4X उद्देश्य का उपयोग मछली पर ध्यान केंद्रित करने और दो μsec / पिक्सेल गति और 1024 x 600 पिक्सेल पहलू अनुपात के साथ स्कैनिंग मोड में confocal लेज़रों के साथ 20x उद्देश्य का उपयोग हित के क्षेत्र की छवियों के अधिग्रहण। 3 तख्ते की Kalman फिल्टर मोड लागू करने, एक माइक्रोन कदम आकार के साथ जेड ढेर मोल।
  5. 50 मिलीलीटर E3 + पी टी यू के साथ या individua में एक गहरी पेट्री डिश के लिए लौटेंएल कुओं (24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश, 3 मिलीग्राम E3 + पी टी यू) और 33 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

7. Swimbladder विदारक

  1. उच्च वैक्यूम तेल के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें।
  2. एक 2% LMA (agarose E3 के 8 मिलीलीटर में कम पिघलने की 160 मिलीग्राम के साथ कदम 5.3) तैयार करें।
  3. वांछित समय, मछली (कदम 5.2) चतनाशून्य।
  4. स्थानांतरण 10 E3 के 1 मिलीलीटर के साथ एक 1.7 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब मछली और अपकेंद्रित्र ट्यूब 4 मिलीग्राम / एमएल Tricaine (अंतिम एकाग्रता 800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के 200 μl जोड़ने और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए incubating द्वारा euthanize।
  5. एक microslide (75 x 25 मिमी, चित्रा 2) पर 1 सेमी के अलावा, एक वर्ग में वैक्यूम तेल की चार बूंदें रखकर एक इमेजिंग गिलास स्लाइड तैयार करें।
  6. वर्ग के बीच में 2% LMA की दो बूंदें रखें।
  7. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक अलग गिलास स्लाइड पर एक मछली प्लेस और दिल की धड़कन बंद कर दिया है, सत्यापित करें कि अतिरिक्त पानी निकाल दें।
    8. (चित्रा -4 ए) के साथ पूर्वकाल पेट नीचे खींच कर swimbladder काटना।
  8. पाचन तंत्र से अलग, छोड़ा चिमटी के साथ वायवीय वाहिनी द्वारा swimbladder उठाओ, और यह solidifies से पहले 2% LMA के केंद्र में जगह है।
  9. इमेजिंग गिलास स्लाइड के शीर्ष पर एक कवर पर्ची (18 x 18 मिमी) प्लेस और यह वैक्यूम तेल के साथ-साथ LMA (चित्रा 2) को छूता है, जब तक इसे धक्का।
  10. विच्छेदन के 10 मिनट के भीतर छवि कदम 6.4 में वर्णित है। दोहराएँ कदम 7.7-7.11 अन्य मछली के साथ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पीछे swimbladder में microinjection

यहाँ प्रस्तुत प्रयोगात्मक विधि सी के अनुरूप एक खुराक के इंजेक्शन का वर्णन zebrafish DPF 4 की swimbladder में श्वेत खमीर कोशिकाओं। विसर्जन के मॉडल के साथ पिछले काम से पता चलता है कि सी को swimbladder प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया श्वेत स्तनधारी श्लैष्मिक कैंडिडिआसिस 32 के समान है। यहाँ हम और अधिक, सीधा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और तेजी से है कि एक संशोधित संक्रमण विधि का प्रदर्शन; zebrafish के कई सैकड़ों इंजेक्शन और कुछ घंटों के भीतर जांच की जा सकती है।

Swimbladder का सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण microinjection के द्वारा अंग के पीछे क्षेत्र को लक्षित करके पूरा किया है। Swimbladder में इंजेक्शन लार्वा या भ्रूण zebrafish (जैसे, नसों में या hindbrain निलय) के लिए सबसे अन्य microinjection के मार्गों से सीखना आसान है। इंजेक्शन से पहले मछली की तैयारी सिमी हैमछली पुराने हैं इसलिए swimbladder की जरूरत है कि अपवाद के साथ अन्य इंजेक्शन साइटों के लिए है कि करने के लिए LAR, फुलाया किया जाना है। 33 डिग्री सेल्सियस पर उठाया मछली का लगभग 75% 4 DPF द्वारा एक फुलाया swimbladder है (डेटा) नहीं दिखाया। swimbladder मछली इंजेक्शन लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है एक एपिडर्मल के रूप में अच्छी तरह के रूप में पतली मांसपेशियों परत और सूक्ष्म सुई के नीचे स्थित है beveled की जरूरत है। मछली इंजेक्ट कर रहे हैं, जिस पर कोण (चित्रा 3A) भी बहुत प्रक्रिया की गति और आसानी सुधार। यह स्क्रीनिंग जब सब खमीर कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है और चयन रेंज तिरछा जाएगा जो swimbladder के प्रत्येक पक्ष पर खमीर कोशिकाओं की उपस्थिति, बचा जाता है के रूप में swimbladder की पीठ पर सांस में इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है। Swimbladder के पीछे की ओर इंजेक्शन लगाने के भी वायवीय नली के माध्यम से और फिर पाचन तंत्र नीचे inoculum के एक संभावित नुकसान से बचा जाता है। सांस में हवा बुलबुला और विस्थापित के रूप में इंजेक्ट किया गया है जो मछली पुष्टि करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हैवापस swimbladder के बाद में मीडिया (चित्रा -3 सी) के साथ भरा है। यह इंजेक्शन लगाने जब दृश्य को आसान बना देगा, जो फिनोल लाल उपयोग करने के लिए भी संभव है। क्योंकि सी के आकार का श्वेत खमीर कोशिकाओं (3-4 माइक्रोन), inoculum खुराक की वजह से सूक्ष्म सुई के clogging मिलीलीटर 5 10 x 7 CFU / नीचे सांद्रता तक सीमित है। यह एक 5 nl सांस भीतर एक और 250 के बीच खमीर कोशिकाओं के इंजेक्शन की अनुमति देता है। हमारे हाथ में, 1-1.5 10 x 7 CFU में 4 nl इंजेक्शन लगाने / एमएल सबसे अनुरूप परिणाम दे दी है। इस मछली के अनुसार 10-50 खमीर कोशिकाओं की एक सीमा में हुई। 15-25 खमीर कोशिकाओं (3B चित्रा) के लिए inoculum संकुचन एक तंग फेनोटाइप और प्रतिक्रिया देता है। इन शर्तों का उपयोग, इंजेक्ट मछली का लगभग 50% (नहीं दिखाया डेटा) 95% से अधिक जीवित रहने की 24 घंटे बाद इंजेक्शन के साथ उचित inoculum श्रृंखला है। यह पर रोगज़नक़ बोझ के प्रभाव की जांच के क्रम में एक कम / उच्च inoculum के साथ मछली रखने के लिए भी संभव हैरोग विकास।

swimbladder (400 X 200 X 200 माइक्रोन, एल एक्स एच एक्स डब्ल्यू, एक दीर्घवृत्ताभ की मात्रा के लिए सूत्र का उपयोग कर) तो अधिक मात्रा के इंजेक्शन भी संभव है लगभग 100 nl कुल मात्रा है (4 NL के तीन दालों अप करने के लिए किया गया है मछली के अस्तित्व पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना इस्तेमाल किया, डेटा) नहीं दिखाया गया है।

व्यक्तिगत मछली के अनुदैर्ध्य intravital इमेजिंग मेजबान और रोगज़नक़ व्यवहार दोनों का पालन करने के लिए

मेजबान और रोगज़नक़ दोनों के व्यवहार में इस मॉडल का उपयोग कर कई दिनों के लिए गैर invasively पीछा किया जा सकता है। छवि करने की क्षमता vivo में उच्च संकल्प में संक्रमण के विकास और mucosal कैंडिडिआसिस के रोगजनन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है सकते हैं। न्यूट्रोफिल चूहों और इंसानों 35-38 में कैंडिडिआसिस के लिए प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। का प्रयोग MPO: GFP के लिए zebrafish 39 (न्यूट्रोफिल हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त), और सी श्वेत dTom व्यक्तलाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 32 एटीओ, हम जल्दी संक्रमण (चित्रा 4) के दौरान neutrophil- कैंडिडा गतिशीलता मनाया है।

न्यूट्रोफिल श्लैष्मिक संक्रमण की साइट के लिए भर्ती होने वाली पहली जन्मजात सेल प्रकार, और जीने सी के साथ swimbladder के संक्रमण कर रहे हैं श्वेत न्यूट्रोफिल (चित्रा -4 ए, बी) की एक तेजी से और निरंतर भर्ती के लिए जाता है। गर्मी की मौत हो खमीर कोशिकाओं (चित्रा -4 ए, बी) इंजेक्शन थे जब दिलचस्प है, न्यूट्रोफिल काफी swimbladder के लिए भर्ती नहीं कर रहे हैं।

फिलामेंट्स खमीर कोशिकाओं और सी के इंजेक्शन के बाद तेजी से विकसित श्वेत पहले 48 घंटे बाद इंजेक्शन (HPI) के लिए अंकुरित होना जारी है। हालांकि, तंतु की संख्या कम हो जाती है इस बिंदु (चित्रा 4D) और खमीर बढ़ जाती है के अनुपात के बाद () नहीं दिखाया। क्षमता अलग-अलग मछली गैर invasively इन अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए सक्षम बनाता पालन करने के लिए (24 अच्छी तरह से थालीटिशू कल्चर व्यंजन) और रोग प्रगति और मेजबान प्रतिक्रियाओं (चित्रा 4C) में व्यक्तिगत मतभेदों पर प्रकाश डाला गया। कई दिनों में संक्रमण के स्थल पर फंगल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गणना इस तरह के विस्तृत अध्ययन माउस में अव्यावहारिक रहते हैं।

एक तेजी से swimbladder विच्छेदन तकनीक इमेजिंग में सुधार करने के लिए

सी के साथ प्रतिरक्षा या उपकला कोशिकाओं की बातचीत इमेजिंग श्वेत यहाँ प्रस्तुत मॉडल में अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, कुछ निश्चित परिस्थितियों में, हवा के बुलबुले की उपस्थिति और swimbladder, त्वचा और मांसपेशियों को आसपास के ऊतकों की मोटाई, विस्तृत स्थानिक संकल्प समझौता। छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए हम confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5A) से (10 मिनट के भीतर) zebrafish और तेजी से छवि को इससे बाहर swimbladder काटना करने के लिए एक विधि विकसित किया है। प्रतिदीप्ति सर्वत्र व्यक्त की है जहां ट्रांसजेनिक मछली लाइनों इमेजिंग जब यह विशेष रूप से उपयोगी हैGFP के 40 या α-catenin: सिट्रीन लाइनों 41,42 (चित्रा 5 ब, सी) और ऐसे एनएफ-κB के रूप में आसपास के ऊतकों में बाहरी प्रतिदीप्ति, वहाँ है। तकनीक तेजी से प्रदर्शन करने के लिए कौशल और अभ्यास की आवश्यकता है, लेकिन यह प्रयास किया सभी मछली की पूरी तरह से छवि 95% करने के लिए संभव है।

चित्रा 1
चित्रा 1: swimbladder इंजेक्शन के लिए सूक्ष्म सुई आकार। सूक्ष्म सुई आकार और माप की (ए) अवलोकन। ए से सूक्ष्म सुई टिप (बी) बढ़ाई बी में प्रत्येक प्रमुख खड़ी रेखा के अलावा 0.2 मिमी हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2: स्लाइड इमेजिंग। एक 2% LMA बूंद एक गिलास स्लाइड पर 1 सेमी अलग वैक्यूम तेल के चार डॉट्स के बीच में रखा गया है। dissected swimbladder LMA के बीच में रखा जाता है और यह LMA और वैक्यूम तेल के साथ संपर्क में आता है, जब तक एक कवर पर्ची शीर्ष पर उतारा है।

चित्रा 3
चित्रा 3: swimbladder में सी albicans के इंजेक्शन इंजेक्शन की साइट के लिए स्थानीय बनी हुई है। (ए) zebrafish लार्वा DPF 4 में swimbladder के पीछे में सी श्वेत इंजेक्षन करने के लिए सूक्ष्म सुई के उन्मुखीकरण और स्थिति के योजनाबद्ध। (बी) epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा 15-25 खमीर कोशिकाओं के इंजेक्शन सांस के लिए चयन के बाद प्रतिनिधि inoculum मछली के 3 अलग अलग समूहों के लिए। सी एन = समूहों ए, बी, और क्रमशः सी के लिए 17, 17, और 20। (सी) प्रतिनिधि छवियों, मतलब है और मतलब की मानक त्रुटि प्रतिनिधित्व किया है श्वेत inje के तुरंत बाद अटल बिहारी किशोर zebrafish में संक्रमण (Caf2-dTom, लाल प्रतिदीप्ति कैंडिडा व्यक्त)ction है। छवियाँ (क्रमशः छोड़ दिया और सही पैनल) 10X और 20x उद्देश्यों के साथ हासिल कर लिया और डीआईसी चैनल में एक भी टुकड़ा के साथ लाल चैनल (12 और 19 स्लाइस, क्रमशः) में अधिकतम अनुमानों के कंपोजिट रहे थे। हवा बुलबुला (पीला) और उपकला परत (सफेद) की रूपरेखा बाएं पैनल पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। स्केल सलाखों 250 और 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Swimbladder इंजेक्शन मेजबान रोगज़नक़ गतिशीलता के spatio- लौकिक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है। (ए) MPO की छवियों प्रतिनिधि: 4 DPF पर swimbladder में रहते हैं या गर्मी को मार डाला (एच) Caf2-dTom के साथ इंजेक्शन और GFP मछली लाइन 48 HPI imaged। छवियाँ हरी एक पर अधिकतम प्रक्षेपण के कंपोजिट कर रहे हैंएन डी लाल चैनल (20 स्लाइस) और डीआईसी चैनल में एक भी टुकड़ा। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी, सी)। सी के जवाब की मेजबानी श्वेत संक्रमण। न्यूट्रोफिल के रूप में जल्दी 6 HPI के रूप में संक्रमण (सोइ) की साइट के लिए भर्ती किया और 48 घंटे से अधिक संख्या में वृद्धि हो रही पर रखने के लिए कर रहे हैं। छवि के लिए संभावना है और (24 अच्छी तरह से थाली) को अलग कर अलग-अलग मछली रखने विस्तृत प्रतिरक्षा गतिशीलता देखे जा करने के लिए अनुमति देता है। (डी) पैथोजन प्रतिक्रिया। सी श्वेत खमीर कोशिकाओं पहले 24 HPI के लिए germinating लेकिन 24 HPI से खमीर कोशिकाओं पर वापस लौटने कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: बेहतर जानकारी imaged किया जा करने के लिए swimbladder के विच्छेदन की अनुमति देता है। T (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्ववह 4-5 DPF zebrafish में swimbladder के विच्छेदन में शामिल कदम। नीले तीर चिमटी (राइट के लिए वाम दलों के लिए एल और आर) के साथ खींच की दिशा का संकेत मिलता है। (बी, सी)। Α-catenin से विच्छेदित swimbladder की छवियों प्रतिनिधि: सिट्रीन मछली लाइन 41,42 (हरी तंग जंक्शनों) सी albicans के साथ 4 DPF (Caf2-dTom) में इंजेक्शन और confocal माइक्रोस्कोपी दो HPI ने उतारी। पैनलों लाल और हरे रंग चैनलों में अधिकतम अनुमानों के कंपोजिट (b के लिए 25 स्लाइस और सी के लिए तीन स्लाइस) और पैनल बी स्केल सलाखों में डीआईसी के लिए एक भी टुकड़ा कर रहे हैं बी में 100 माइक्रोन और 100 माइक्रोन और सी में 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वॉल्यूम (NL) 1 2 3 4 5
व्यास (मिमी) 0.124 0.156 0.179 0.197 0.212

तालिका 1: व्यास रिश्ते को सांस मात्रा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Swimbladder microinjection के रोग मॉडल की अग्रिम और सीमाएं

यहाँ प्रस्तुत मॉडल Gratacap एट अल में वर्णित श्लैष्मिक कैंडिडिआसिस विसर्जन मॉडल का एक विस्तार है (2013)। यह एक नियंत्रित संक्रमण समय के फायदे, एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण खुराक, और इसलिए बेहतर दक्षता कहते हैं। हम यहाँ गैर इनवेसिव महान विस्तार में संक्रमण की गतिशीलता के अस्थायी प्रलेखन के साथ ही swimbladder के उच्च संकल्प पूर्व vivo इमेजिंग की अनुमति है कि नए तरीकों का प्रदर्शन। इन प्रक्रियाओं सी के अध्ययन की सुविधा चाहिए श्वेत म्यूकोसा में प्रतिरक्षा प्रणाली को बातचीत की गतिशीलता -innate। श्लैष्मिक संक्रमण मॉडल की एक सीमित संख्या zebrafish में वर्णित किया गया है, सभी पाचन तंत्र अशांति / संक्रमण 24,43 करने के लिए सीमित। यहाँ प्रस्तुत swimbladder मॉडल फेफड़ों के लिए कुछ समानताएं शेयरों और एक सीमित साइट प्रदान करता है कि एक अंग को संक्रमण की साइटों फैलीरोगज़नक़ के लिए कम संभावना के साथ संक्रमण की धुल जाए।

इन तकनीकों mastering जब ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण कारक हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात यह एक फुलाया swimbladder के लिए आवश्यकता है। यह 33 डिग्री सेल्सियस पर 28 डिग्री सेल्सियस या 4 DPF पर पाला जब 5 DPF आयु वर्ग के होने के लिए मछली की आवश्यकता है इस उच्च तापमान मछली के विकास में तेजी लाने और बेहतर स्तनधारी उपकला तापमान (माउस त्वचा तापमान सी 44 33.1 डिग्री है) की शारीरिक सीमा के लगभग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, इस विशेष तापमान रेंज के लिए इस मॉडल के प्रतिबंध को ध्यान में रखा जाना और मनाया phenotypes अधिक पूर्ण व्याख्या के लिए एक स्तनधारी प्रणाली में सत्यापित किया जाना चाहिए की जरूरत है। वायवीय वाहिनी physostomous मछली में खुला रहता है (zebrafish भी शामिल है) के रूप में और इंजेक्शन साइट (पीछे swimbladder), भी महत्वपूर्ण है उच्च दबाव injswimbladder अतीत और पाचन तंत्र में रोगज़नक़ धक्का कर सकते हैं अंग में कहीं ection। ट्रंक में मछली की मोटाई यह मुश्किल swimbladder के दोनों पक्षों कल्पना करने के लिए बनाता है क्योंकि खमीर कोशिकाओं, swimbladder की पीठ पर नहीं सब कर रहे हैं अगर inoculum की मात्रा का ठहराव भी कम सटीक है। Swimbladder के विच्छेदन निपुणता की आवश्यकता है और इमेजिंग के कारण प्रक्रिया के शारीरिक आघात करने के लिए कलाकृतियों से बचने के लिए तुरंत बाद जगह लेने की जरूरत है।

तकनीक की सीमाओं मछली का विकास मंच के लिए मुख्य रूप से संबंधित हैं। इस अध्ययन के कुछ ही दिनों के लिए morpholino प्रौद्योगिकी के उपयोग को सीमित करता है, और पछाड़ना प्रभावकारिता ध्यान से पूर्ण या आंशिक प्रभावकारिता के बीच विभेद करने के लिए परीक्षण किया जाना है। Morpholino गतिविधि के विकास में देर पहले बताया जा चुका है, और हम भी सफलतापूर्वक 5 DPF पर अभी भी प्रभावी था कि पुष्टि ब्याह-रोकने के साथ, इस मॉडल में morpholinos का इस्तेमाल किया है। फार्म का उपयोगमछली की उम्र के लिए कोई प्रतिबंध नहीं है के रूप में acological दवाओं इस विशेष मॉडल में एक अच्छा विकल्प हो सकता है। 72 घंटा बाद निषेचन अतीत मछली का उपयोग कभी कभी, लार्वा zebrafish के साथ काम संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों पर निर्भर करता है की तुलना में अधिक निरीक्षण की आवश्यकता है। zebrafish स्थिर प्रयोगशाला परिस्थितियों में 45 में 10 से अधिक दिनों के लिए उच्च दरों पर जीवित नहीं है के रूप में अध्ययन की लंबाई भी, विवश है। दूसरी ओर, बजाय छोटी भ्रूण या लार्वा के विकास DPF 5 किशोर मछली का उपयोग करते हुए इस तरह के गुर्दे, जिगर या अग्न्याशय के रूप में सभी अंगों 46-49 पूरी तरह से कार्य कर रहे हैं, जहां पढ़ाई के लिए अनुमति देता है। इन विट्रो सेल संस्कृति के लिए या विवो murine मॉडल की तुलना में, (एंटीबॉडी और रासायनिक विरोधी एगोनिस्ट) उपलब्ध अभिकर्मकों की संख्या zebrafish में सीमित है; हालांकि, मीडिया के लिए सीधे रसायन जोड़ने की संभावना एक फायदा है। पीटा और दस्तक में zebrafish की संख्या अभी भी सीमित है लेकिन आरआईएस हैलक्षित जीनोम संपादन के ई म्यूटेंट की पीढ़ी के लिए रोमांचक संभावनाओं को खोलता है। रिश्तेदार आसानी के संयोजन फ्लोरोसेंट संवाददाता लाइनों (सेल प्रकार विशिष्ट या मार्ग-विशिष्ट संकेत) किशोर zebrafish के पारदर्शिता के साथ इस प्रणाली के प्राथमिक और अद्वितीय फायदे में से एक है का निर्माण करने के लिए।

आशा करना

zebrafish swimbladder संक्रमण मॉडल उपकला के माध्यम से आक्रमण कि अन्य रोगज़नक़ों के लिए संक्रमण का एक नया मार्ग की पेशकश की और कशेरुकी रोग की जांच के लिए इस अंग की उपयोगिता पर प्रकाश डाला, कशेरुकी म्यूकोसल उपकला में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के बारे में पूछा जा सकता है कि सवालों की सीमा का विस्तार ।

श्लैष्मिक स्तर पर उपकला संक्रमण के zebrafish मॉडल दवाओं या रोगज़नक़ 24,43 से आंत्र पथ अशांति के प्रभाव की जांच कि प्रकाशित किया गया है। हालांकि, इस श्लैष्मिक कैंडिडिआसिस मॉडल swimb का उपयोग करने के लिए सबसे पहले हैसीढ़ी और इस प्रकार पाचन तंत्र से परे zebrafish में जांच की जा सकता है कि संक्रमण की साइटों की सीमा फैली हुई है। Swimbladder mucosal सतह और स्तनधारी फेफड़ों के बीच मतभेदों को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं और उच्च हड्डीवाला करने के लिए इस मॉडल से डेटा की व्याख्या / अनुवाद सावधानी से किया जाना चाहिए।

swimbladder संक्रमण कशेरुकी संक्रमण मॉडल में एक मौजूदा अंतराल भरता है और एक रोगज़नक़ के साथ सहज प्रतिरक्षा / उपकला कोशिकाओं की बातचीत इमेजिंग के लिए एक खिड़की खुल जाता है। अब पहले से बंद सीमा के सवाल, की एक विविध रेंज, पता लगाने के लिए संभव है। हम एक दूसरे के साथ और उपकला कोशिकाओं, उनके spatio- लौकिक भर्ती के साथ अलग अलग सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत का निर्धारण, और सी की प्रकृति कर सकते हैं श्वेत प्रसार और एक गैर-immunosuppressed मेजबानी में प्रतिरक्षा हमले और रोग प्रगति के संबंध में रूपात्मक स्विचिंग। छवि के लिए संभावना जीआरई में दिनों के लिए कई घंटे के लिए एक अक्षुण्ण मेजबानविस्तार में इस प्रणाली का एक स्पष्ट और प्रमुख लाभ का प्रतिनिधित्व करता है।

अंत में, swimbladder और स्तनधारी फेफड़ों के बीच सात्विक और जीन अभिव्यक्ति समानताएं आगे जीन पछाड़ना या रासायनिक दवाओं के साथ इस अंग को लक्षित माइक्रोबियल-फेफड़ों के संपर्क और इम्यूनोलॉजी 50-52 से संरक्षित तंत्र प्रकट हो सकता है कि सलाह देते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

लेखकों उदारता α-catenin उपलब्ध कराने के लिए डॉ ले Trinh और डॉ टोबिन धन्यवाद: सिट्रीन मछली लाइन और बिल जैकमैन हमें अपनी प्रयोगशाला में फिल्माने ऐसा करने की इजाजत देने के लिए। लेखकों धन स्रोतों राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान 5P20RR016463, 8P20GM103423 और R15AI094406) और यूएसडीए स्वीकार करते हैं (परियोजना # ME0-एच-1-00517-13)। इस पांडुलिपि मुख्य कृषि और वानिकी प्रयोग स्टेशन प्रकाशन संख्या 3371 के रूप में प्रकाशित हुआ है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml tubes Axygen MCT-175-C
Deep Petri dishes Fisher Scientific 89107-632
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) Fine Science Tools 11251-30
Wooden dowels VWR Scientific 10805-018
Low melt agarose VWR Scientific 12001-722
Flaming Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate capillary Sutter Instruments BF120-69-10
MPPI-3 injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting microscope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
20X microscope objective Olympus UPlanSApo 20x/0.75
Roller drum New Brunswick Scientific TC-7
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Glass culture tubes (16 x 150 mm) VWR Scientific 60825-435
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
HEPES (Corning) VWR Scientific BDH4520-500GP
Children clay (Play-Doh) Hasbro
CaCl2 Fisher Scientific C69-500
Methylene blue VWR Scientific VW6276-0
PTU Sigma P7629-10G
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712
Hemocytometer (Hausser scientific) VWR Scientific 15170-172
Type A immersion oil Blue Marble Products 51935
Centrifuge Eppendorf 5424
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
Agarose (Lonza) VWR Scientific 12001-870
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Fishing wire Stren
96 well imaging plate (Sensoplate) Greiner Bio-One 655892
High vacuum grease (Dow Corning) VWR Scientific 59344-055
Microslide (25 x 75 mm) VWR Scientific 48300-025
Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 VWR Scientific 48366-045
15 cm Petri dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 32-106
Glycerol (EMD chemicals) VWR Scientific EMGX0185-5
24-well culture dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 25-107
Weight boats (8.9 cm) VWR Scientific 89106-766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 93 zebrafish श्लैष्मिक कैंडिडिआसिस श्लैष्मिक संक्रमण उपकला बाधा उपकला कोशिकाओं सहज प्रतिरक्षा swimbladder,
Swimbladder इंजेक्शन द्वारा लार्वा zebrafish में mucosal कैंडिडिआसिस मॉडलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C.,… More

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection. J. Vis. Exp. (93), e52182, doi:10.3791/52182 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter