Abstract
Defesa precoce contra patógenos da mucosa consiste de uma barreira epitelial e células imunitárias inatas. A imunocompetência de ambos, e sua intercomunicação, são de extrema importância para a proteção contra infecções. As interações de células imunitárias inatas epiteliais e com um patógeno são melhor investigada in vivo, onde o comportamento complexo se desenrola ao longo do tempo e do espaço. No entanto, os modelos existentes não permitem fácil imaging espaço-temporal da batalha com patógenos ao nível da mucosa.
O modelo desenvolvido aqui cria uma infecção das mucosas por injecção directa do agente patogénico fúngico, Candida albicans, em swimbladder de peixe-zebra juvenil. A infecção resultante permite imagens de alta resolução do comportamento das células epiteliais e imune inata ao longo do desenvolvimento da doença mucosa. A versatilidade deste método permite interrogatório do hospedeiro para sondar a seqüência detalhada de eventos imunológicos que levam a phrecrutamento agocyte e examinar os papéis de determinados tipos de células e vias moleculares na proteção. Além disso, o comportamento do agente patogénico como uma função do ataque do sistema imunológico pode ser iluminados simultaneamente por fluorescência utilizando-expressando proteína C. albicans. O aumento da resolução espacial da interação patógeno-hospedeiro também é possível através da técnica de dissecção da bexiga natatória rápida descrito.
O modelo de infecção da mucosa descrito aqui é simples e altamente reprodutível, tornando-se uma ferramenta valiosa para o estudo da mucosa candidíase. Este sistema pode também ser amplamente traduzível a outros agentes patogénicos das mucosas, tais como micróbios micobacterianas, bacterianas ou virais que normalmente infectam através de superfícies epiteliais.
Protocol
NOTA: Todos os protocolos de cuidados de peixe-zebra e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH sob Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) A2012-11-03 protocolo.
1. Zebrafish Elevando a 4 dias após a fertilização
- Recolhe AB peixe-zebra, ou quaisquer outras linhas transgénicas, dentro da primeira hora após a fertilização 3, como mostrado em outro vídeo 34.
- Incubar 120 ovos em um 15 centímetros placas de Petri contendo 150 ml de mídia E3 (mM NaCl 5; KCl 0,17; 0,33 mM CaCl 2; 0,33 mM MgCl2; HEPES 2 mM; pH 6,8) com azul de metileno (0,3 ug / ml definitiva concentração) em um 33 ° C incubadora com 12/12 luz / fotoperíodo escuro.
- Substituir o material após 6 h com E3 + PTU (1-fenil-2-tioureia, 10 ug / ml de concentração final) e remover os ovos mortos.
- Incubar durante 4 dias a 33 ° C, trocando a mídia com nova E3 + PTU após 2 dias.
2. Eminjeção Micro-agulha Preparação
- Puxe capilar borosilicato (OD 1,2 milímetros; ID 0,69 milímetros) em um micro-agulha usando um extrator agulha com as seguintes configurações (550 Calor; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
NOTA: As configurações irão variar de filamento para filamento para se obter micro-agulhas em forma semelhante (ver Figura 1) e necessitam de ser reajustados sempre que um novo filamento está instalado. - Encha uma micro-agulha com 3 ul de 0,4 um filtrou-tampão salino de fosfato (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM de Na 2 HPO 4; 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma pipeta de 20 uL microloader ponta.
- Defina-se a micro-agulha num suporte de micropipeta em um micromanipulador ligado a um sistema de injecção de pressão. Ajuste a pressão de injeção para 30 PSI e a duração do pulso de 30 ms.
- Usando uma placa de Petri com água destilada, inferior a micro-agulha até 1/5 da agulha está na água. Clipe da wi micro-agulhath uma pinça fina logo abaixo do nível da água. Traga a micro-agulha para fora da água e empurrar o pedal várias vezes até um bolus aparece.
- Medir o diâmetro do bolo baixando a micro-agulha em um hemocitómetro em camadas com uma gota de óleo de tipo A imersão. Ajustar a duração do impulso para obter o volume desejado (ver Tabela 1).
- Ajuste da contrapressão para o bólus se mantenha estável em óleo (diminuir a pressão, se aumenta o volume do bolo e aumentar a pressão de retorno se o volume de bolus diminui). Grave a duração do pulso para cada micro-agulha.
- Retire a PBS da micro-agulha, aspirando-lo usando uma ponteira microloader e expulsar a esquerda-over PBS, colocando-o de volta no injector e apertar o interruptor de pulso contínua. Reserve cada micro-agulha.
3. Preparação Candida
- Streak Candida albicans transformada com otimizado-códon dTomato, GFP, BFP, EOS ou FarVermelho de um lote congelado (-80 ° C estoque em glicerol a 25%) usando um passador de madeira estéril para uma levedura dextrose peptine (YPD) placa de agar (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 20 g / L de dextrose , 20 g / L de agar; autoclavado e verteu-se 25 ml em placas de Petri) e incubar durante a noite a 30 ° C.
- Escolha uma colónia utilizando um pino de madeira e estéril para inocular 5 ml de meio YPD líquido (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 20 g / L de dextrose, autoclavado e assepticamente em alíquotas de 5 ml em 16 x 150 milímetros de cultura de vidro tubos).
- Incubar durante a noite a 30 ° C num tambor de rolos a 60 rpm.
- Colete 1 ml de C. albicans cultura e transferência para um tubo de centrífuga de 1,7 ml estéril.
- Centrifugar a 5000 xg por um par de segundos. Esvazie o sobrenadante e adicionar 1 ml de PBS estéril, vortex completamente. Repita isso duas vezes.
- Contar as colónias utilizando um hemocitómetro por diluição do stock 1 mL de 1: 1000 em PBS estéril.
4. Injetar Zebrafish ema bexiga natatória
- Aquecer um prato de injecção (2% de agarose) durante 30 min em uma incubadora de 33 ° C.
- No momento desejado, remover 100 dos 150 ml de E3 + UTP a partir do prato de 15 centímetros de Petri contendo o peixe para injectar, utilizando uma pipeta de 25 ml sem aspirar qualquer peixe-zebra.
- Anestesiar 4 dpf peixe-zebra por adição de 2 ml de uma mistura 4 mg / ml tamponado tricaina metano sulfonato estoque (TR) para os restantes 50 ml de meio (concentração final de 200 ug / ml) e aguardar durante 15 minutos.
- Sob um microscópio de dissecação, selecione peixe com uma bexiga natatória inflado. Os peixes também podem ser rastreados na época para fenótipo mais homogêneo, como a distribuição de neutrófilos em mpo: linha GFP utilizando um microscópio de epifluorescência dissecando.
- Dilui-se a C. albicans de estoque a sua concentração original (passo 3.8) e 1,5 x 10 7 unidades formadoras de colónias por ml (cfu / ml) em PBS.
- Transferir 30 peixes-zebra para o prato de injecção usando um tubo de transferência de plásticotte e remover o excesso de mídia.
- Usando uma ferramenta de fio de pesca (0,012 polegadas de diâmetro linha de pesca super-colado em um capilar de borosilicato), fazer 3 linhas de 10 peixes, segurando o prato injeção vertical e orientar o peixe verticalmente.
- Retire o excesso de mídia.
- Absolutamente vortex do tubo com 1,5 x 10 7 ufc / mL C. albicans.
- Encha um micro-agulha com 3 l de C. albicans utilizando uma nova ponta microloader pipeta e definir a duração do pulso para a definição apropriada (veja o passo 2.9).
- Rode o prato de injeção para fazer um ângulo de 20 ° entre o micro-agulha ea cabeça do peixe, que aponta para a parte de trás da bexiga natatória (Figura 3A).
- Empurrar o micro-agulha para dentro da bexiga natatória, certificando-se o furo da agulha está no lúmen, e uma vez que pressiona o pedal.
- Repita o procedimento para cada peixe e transfira para um prato de recuperação (25 ml E3 + PTU) inundando o prato com um E3d esvaziando-a no prato de recuperação.
- Transferir mais 30 peixes para o prato de injecção.
- Repita injeção com um novo micro-agulha cheia com cuidadosamente agitadas C. albicans.
- Concluir através da injecção do controlo de PBS, se necessário, utilizando um prato de injecção diferente, para evitar a contaminação e transferir para uma cápsula de recuperação separada (passo 4.10).
5. Triagem do Peixe para o inóculo desejado
- Preparar 40 ml de 0,4% de baixo ponto de fusão solução de agarose (LMA) através da adição de 160 mg de agarose de baixo ponto de fusão a 40 ml de E3, fervendo por microondas até à dissolução, e de se arrefecer para 37 ° C. Adicionar 400 ul de TR (concentração final de 200 ug / ml) uma vez arrefecida.
- Depois de 30 minutos de recuperação, anestesiar os peixes como descrito (passo 4.3 utilizando apenas 1 ml de TR em 25 mL E3 + PTU, concentração final de 200 ug / ml).
- 30 Transferência de peixe (com um mínimo de meios quanto possível) a 2 ml de LMA em peso de um barco.
- Aspirar peixes individuais com uma pipeta de transferência e a placa de peixe com um LMA em gotas de uma placa de imagiologia de 96 poços, utilizando-se apenas os 10 x 6 poços centrais.
- Repita até que todos os peixes para a tela são carregados para a placa de imagem.
- Deixar os meios solidificar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Coloque o peixe do seu lado, certificando-se que eles estão em contato com o fundo de vidro.
- Usando o objetivo 20X em um epifluorescência / microscópio confocal invertido e o filtro apropriado, registrar o número de C. células de levedura albicans na bexiga natatória de cada peixe.
- Selecione o peixe com 15-25 células de levedura na bexiga natatória (ou inóculo desejado), eutanásia peixe não selecionados (800 ug / ml de TR na E3) e retornar peixe selecionado para um prato fundo Petri com 50 ml de E3 + PTU por adicionar 3 gotas de E3 para a chapa de imagem poços selecionados e aspirar o peixe com uma pipeta de plástico.
- Incubar a 33 ° C durante o tempo desejado.
6. Imaging o Peixe Pós-screening
- No momento desejado, remover 25 dos 50 ml de meio E3 + PTU do prato fundo Petri contendo o peixe para a imagem.
- Anestesiar os peixes como descrito (passo 4.3 utilizando apenas 1 ml de TR em 25 ml E3 + PTU remanescente, concentração final de 200 ug / ml).
- Placa o peixe para uma placa de imagiologia de 96 poços e posição apropriadamente (passos 5,3-5,7).
- Imagem por microscopia confocal utilizando os lasers adequados e filtros de emissão. Primeiro foco nos peixes usando o objetivo 4X sob contraste de interferência diferencial (DIC) e adquirir imagens da região de interesse, utilizando o objetivo 20X com os lasers confocal em modo de digitalização com 2 velocidade ms / pixel e 1024 x 600 pixel proporção. Adquirir Z-stacks com 1 mm tamanho do passo, aplicando-se o modo de filtro de Kalman de 3 frames.
- Retornar para um prato fundo de Petri com 50 ml E3 + PTU ou em individual (poços de 24 poços do prato de cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubar a 33 ° C.
7. Dissecando a bexiga natatória
- Encher uma seringa de 10 ml com graxa alto vácuo.
- Prepara-se uma LMA 2% (passo 5.3 com 160 mg de agarose a baixo ponto de fusão em 8 ml de E3).
- No momento desejado, anestesiar o peixe (passo 5.2).
- Transferir 10 de peixe para um tubo de centrífuga de 1,7 mL com 1 ml de E3 e eutanásia por adição de 200 ul de 4 mg / ml tricaina (concentração final de 800 ug / ml) para o tubo de centrifugação e incubação durante 15 min à temperatura ambiente.
- Prepare uma lâmina de vidro de imagem, colocando 4 gotas de graxa de vácuo em uma praça, com 1 cm de diferença em um microlâmina (75 x 25 mm, Figura 2).
- Coloque 2 gotas de 2% LMA no meio da praça.
- Coloque um peixe em uma lâmina de vidro separada sob um microscópio de dissecação e verificar que o coração parou de bater, retire o excesso de água.
- Pegue o swimbladder pelo duto pneumático com a pinça esquerda, separando-o do aparelho digestivo, e colocá-lo no centro da LMA 2% antes de ela se solidifica.
- Colocar uma tampa de deslizamento (18 x 18 mm) na parte superior da lâmina de vidro de imagem e empurrá-lo até que ela toque a graxa vácuo, bem como o LMA (Figura 2).
- Imagem dentro de 10 min de esvaziamento, tal como descrito na etapa 6.4. Repita o passo 7,7-7,11 com os outros peixes.
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Representative Results
Microinjection na bexiga natatória posterior
O método experimental aqui apresentado descreve a injecção de uma dose consistente de C. células de levedura albicans na bexiga natatória de 4 dpf peixe-zebra. Trabalhos anteriores com o modelo de imersão sugere que a resposta imune a bexiga natatória C. albicans é semelhante à da mucosa de mamífero candidíase 32. Aqui demonstramos um método de infecção modificado que é mais simples, mais rápida e reprodutível; várias centenas de peixe-zebra pode ser injectado e rastreados dentro de um par de horas.
Infecção exacto e reprodutível da bexiga natatória é realizada por direccionamento a área posterior do órgão por microinjecção. Injeção na bexiga natatória é mais fácil de aprender do que a maioria das outras rotas de microinjeção para o peixe-zebra larval ou embrionárias (eg, ventrículo intravenosa ou hindbrain). A preparação do peixe antes da injeção é similhante ao que para outros locais de injecção, com a excepção de que a bexiga natatória necessita de ser insuflado de modo que os peixes são mais velhos. Aproximadamente 75% dos peixes de criação a 33 ° C tem uma bexiga natatória inflado por 4 dpf (dados não mostrados). A bexiga natatória está localizado sob uma epiderme, bem como a camada fina de músculo e a micro-agulha utilizada para injectar o peixe deve ser chanfrada. O ângulo em que os peixes são injectados (Figura 3A) também melhora grandemente a velocidade ea facilidade de execução. A injecção do bólus na parte de trás da bexiga natatória é importante, uma vez que permite a visualização de todas as células de levedura quando rastreio e evita a presença de células de levedura em cada lado da bexiga natatória, que vai inclinar o intervalo de selecção. Injecção para a parte traseira do swimbladder também evita uma possível perda do inoculo através da conduta de pneumático e, em seguida, para baixo no tracto digestivo. Verificando que o peixe foi injetado é relativamente fácil como o bolus desloca a bolha de ar e ovolta da bexiga natatória é subsequentemente cheio com os meios (Figura 3C). É também possível a utilização de fenol vermelho, aquando da injecção, o que tornará mais fácil a visualização. Devido ao tamanho de C. células de levedura albicans (3-4 um), a dose de inoculo é limitado a concentrações inferiores a 5 x 10 7 ufc / ml, devido ao entupimento da micro-agulha. Isto permite que a injecção de entre um e 250 células de levedura a 5 nl de bolus. Em nossas mãos, injetando 4 nl a 1-1,5 x 10 7 ufc / ml deu os resultados mais consistentes. Isto resultou em uma gama de 10-50 células de levedura por peixe. Estreitando o inoculo para 15-25 células de levedura (Figura 3B) dá uma resposta mais apertado e fenótipo. Usando estas condições, aproximadamente 50% dos peixes injectados têm a gama de inóculo apropriado com mais de 95% de sobrevivência 24 h pós injecção (dados não mostrados). É também possível para manter os peixes com uma / maior do inoculo inferior, a fim de investigar o efeito da carga de patogénio noo desenvolvimento da doença.
A bexiga natatória é aproximadamente volume total de 100 nl (400 x 200 x 200 mm, L x W x H, utilizando a fórmula para o volume de um elipsóide) para injecção de volumes mais elevados também é possível (até 3 pulsos de 4 nl tenham sido usado sem qualquer efeito significativo sobre a sobrevivência dos peixes; dados não mostrados).
Imagiologia intravital Longitudinal de indivíduos para seguir tanto acolhimento e comportamento patógeno
O comportamento de ambos hospedeiro e agente patogénico pode ser seguida de forma não invasiva durante vários dias, usando este modelo. A capacidade de imagem o desenvolvimento da infecção, a alta resolução in vivo e pode ter sido usado para examinar a patogénese da candidíase da mucosa. Os neutrófilos desempenham um papel essencial na resistência à infecção fúngica em ratos e seres humanos 35-38. Usando mpo: peixe-zebra GFP 39 (neutrófilos expressar a proteína fluorescente verde), e C. albicans expressando o dtomato fluorescente proteína vermelha 32, temos observado dinâmica Candida neutrophil- durante a infecção precoce (Figura 4).
Os neutrófilos são a primeira tipo de célula inata para ser recrutadas para o local de infecção da mucosa, e a infecção da bexiga natatória com vivo C. albicans leva a um rápido e contínuo recrutamento de neutrófilos (Figura 4A, B). Curiosamente, os neutrófilos não são substancialmente recrutados para swimbladder quando as células de levedura foram mortas por calor injectada (Figura 4A, B).
Filamentos desenvolver rapidamente após a injecção de células de levedura e C. albicans continua a germinar nas primeiras 48 horas após a injeção (IPH). No entanto, após este ponto, o número de filamentos diminui (Figura 4D) e a proporção de aumento de levedura (não mostrado). A capacidade de seguir cada peixe permite que não-invasiva esses estudos longitudinais (placa de 24 poçospratos de cultura de tecidos) e destaca as diferenças individuais na progressão da doença e resposta do hospedeiro (Figura 4C). Tais estudos detalhados enumerando as células fúngicas e imunitárias no local de infecção ao longo de vários dias se prestem no rato.
Uma técnica de dissecção da bexiga natatória rápida para melhorar a imagiologia
Imagiologia da interacção de células imunitárias ou epiteliais com C. albicans é relativamente fácil no modelo aqui apresentado. No entanto, em certas circunstâncias, a presença de bolhas de ar e da espessura do tecido em volta da bexiga natatória, a pele e os músculos, compromete a resolução espacial detalhada. Para melhorar a qualidade da imagem, temos desenvolvido um método para dissecar swimbladder fora do peixe-zebra e imagem que rapidamente (dentro de 10 min) por microscopia confocal (Figura 5A). Isto é particularmente útil na obtenção de imagens de linhas de peixes transgénicos, onde a fluorescência é expressa ubiquamentee existe fluorescência estranho no tecido circundante, tais como NF-kB: 40 GFP ou α-catenina: linhas de citrino 41,42 (Figura 5B, C). A técnica requer habilidade e prática de executar rapidamente, mas é viável a imagem completamente 95% de todo o peixe tentada.
Figura 1: forma Micro-agulha para injecção bexiga natatória. (A) Visão de forma micro-agulha e medição. (B) Ampliação da ponta micro-agulha de A. Cada grande linha vertical em B são 0,2 milímetros de distância.
Figura 2: Imagem por slide. Uma gota LMA 2% é colocado no meio de quatro pontos de graxa de vácuo, com 1 cm para além de uma lâmina de vidro. O DisseCTED swimbladder é colocado no meio da LMA e uma lamela é reduzida em cima até que fique em contato com a LMA e a graxa de vácuo.
Figura 3: A injecção de C. albicans em swimbladder permanece localizado a um local de injecção. (A) Esquema da orientação e da posição do micro-agulha para injectar C. albicans na parte de trás da bexiga natatória em 4 dpf larvas de peixes-zebra. (B) após o inoculo representativas selecção para injecção bolus de 15-25 células de levedura por microscopia de epifluorescência para 3 grupos diferentes de peixes. A média eo erro padrão da média é representado, n = 17, 17, e 20 para os grupos A, B, e C, respectivamente. (C) Imagens representativas de C. albicans (CaF2-dtom, fluorescência vermelha expressar Candida) infecção em AB zebrafish juvenil imediatamente após injecção. As imagens foram adquiridas com 10x e 20x objetivos (painéis esquerdo e direito, respectivamente) e são compostos de projeções máximas no canal vermelho (12 e 19 fatias, respectivamente) com uma única fatia no canal DIC. Esboço da bolha de ar (amarelo) e o revestimento epitelial (branco) são representadas no painel esquerdo. Barras de escala representam 250 e 50 mm, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Injecção swimbladder permite dissecção espaço-temporal dos agentes patogénicos dinâmica hospedeiro. (A) Imagens representativas de mpo: linha de peixes injetados com GFP ao vivo ou morto de calor (HK) CaF2-dtom na bexiga natatória a 4 dpf e fotografada 48 hpi. As imagens são compósitos de projeção máxima no um verdecanais nd vermelhos (20 fatias) e uma única fatia no canal DIC. As barras de escala representam 100 um. (B, C). Hospedar resposta a C. infecção albicans. Os neutrófilos são recrutadas para o local da infecção (SOI) tão cedo como 6 hpi e continuar a aumentar em número, mais de 48 h. A possibilidade de imagem e manter os peixes indivíduo separado (placa de 24 poços) permite uma dinâmica imunes detalhados para ser visualizado. (D) resposta patógeno. C. células de levedura albicans estão germinando pela primeira 24 hpi mas reverter para células de levedura de 24 hpi. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A dissecção da bexiga natatória permite a pequenos detalhes a ser trabalhada. (A) Representação esquemática de tele etapas envolvidas na dissecção da bexiga natatória em 4-5 dpf peixe-zebra. As setas azuis indicam a direcção de puxar com as pinças (L para a esquerda e para a direita), R. (B, C). Imagens representativas de swimbladder dissecado de α-catenina: linha peixe citrino 41,42 (junções apertadas verde) injetado em 4 dpf com C. albicans (CaF2-dtom) e fotografada por microscopia confocal 2 hpi. Painéis compósitos de projecções são máximas nos canais vermelho e verde (25 fatias para B e 3 fatias para C) e uma única fatia para a DIC em barras painel B. Escala de 100 um de B e 100 um e 10 um em C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Diâmetro (mm) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Tabela 1: volume de Bolus a relação diâmetro.
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Discussion
Os avanços e as limitações do modelo de doença microinjeção swimbladder
O modelo apresentado aqui é uma extensão do modelo de imersão mucosa candidíase descrito no Gratacap et al (2013).; acrescenta as vantagens de um tempo de infecção controlada, uma dose de infecção altamente reprodutível, e, por conseguinte, uma maior eficiência. Nós demonstramos aqui novos métodos que permitem a documentação temporais não-invasivo de dinâmica de infecção em grande detalhe, bem como maior resolução ex vivo de imagens da bexiga natatória. Estes procedimentos devem facilitar o estudo de C. albicans -innate dinâmica de interação sistema imunológico na mucosa. Um número limitado de modelos de infecção da mucosa foram descritas no peixe-zebra, tudo limitado a perturbação do aparelho digestivo / infecções 24,43. O modelo aqui apresentado swimbladder estende os locais de infecção a um órgão que compartilha algumas semelhanças com o pulmão e oferece um local confinadode infecção, com menos possibilidade para o patogénio a ser lavados.
Há vários fatores críticos que devem ser levados em conta quando se dominar essas técnicas. O ponto mais importante é a exigência de uma bexiga natatória inflado. Isto exige que o peixe para ser envelhecido a 5 dpf quando criadas a 28 ° C ou 4 dpf a 33 ° C. Esta temperatura mais elevada é utilizada para acelerar o desenvolvimento do peixe e aproximar melhor a gama de temperaturas fisiológicas epiteliais de mamífero (a temperatura da pele do rato é de 33,1 ° C 44). No entanto, a restrição deste modelo para essa faixa de temperatura especial precisa ser mantido em mente e fenótipos observados deverá ser verificada em um sistema de mamífero para a interpretação mais completa. O local de injecção (swimbladder posterior) é também crítico, como a conduta de pneumático mantém aberta em peixes physostomous (que inclui peixe-zebra) e alta pressão-injexão em outras partes do órgão pode empurrar o patógeno passado swimbladder e no tracto digestivo. Quantificação do inóculo também é menos precisa se as células de levedura não são tudo na parte de trás da bexiga natatória, porque a espessura do peixe no tronco torna difícil visualizar ambos os lados da bexiga natatória. A dissecção da bexiga natatória requer destreza e de imagem tem de ter lugar imediatamente após a evitar artefatos devido ao trauma físico do procedimento.
As limitações da técnica estão principalmente relacionados com o estágio de desenvolvimento dos peixes. Isto limita a utilização da tecnologia de morfolino a alguns dias de estudo, e tem eficácia knockdown ser cuidadosamente analisado para discriminar entre a eficácia completa ou parcial. Morpholino atividade desta tarde no desenvolvimento tem sido relatado anteriormente, e nós também têm utilizado com sucesso morpholinos neste modelo, com validado emenda-blocking que ainda era eficaz em 5 dpf. O uso de pharmacological drogas pode ser uma boa alternativa neste modelo em particular, pois não há restrição para a idade do peixe. O uso de peixes passado 72 horas após a fertilização, por vezes, exige mais fiscalização do que trabalhar com peixe-zebra larval, dependendo dos cuidados de animais e utilização comitês institucionais. A duração do estudo é também limitado, como peixe-zebra não sobrevivem a taxas elevadas por mais de 10 dias em condições de laboratório estáticos 45. Por outro lado, usando juvenis de 5 dpf desenvolvimento de embriões em vez mais jovens ou larvas permite estudos em que todos os órgãos tais como rins, fígado e pâncreas estão totalmente funcionais 46-49. Em comparação com o cultivo in vitro de células ou em modelos murinos in vivo, o número de reagentes disponíveis (anticorpos e químicas antagonistas-agonistas) é limitada no peixe-zebra; no entanto, a possibilidade de adicionar produtos químicos directamente sobre o suporte é uma vantagem. O número de nocaute e knock-no peixe-zebra ainda é limitada, mas o rise de edição genoma segmentado abre possibilidades excitantes para a geração de mutantes. A combinação da relativa facilidade para construir linhas repórter fluorescentes com a transparência do peixe-zebra (juvenil ou de sinalização específicos da via específica de tipo de célula) continua a ser uma das principais vantagens e únicas deste sistema.
Olhando para a frente
O modelo de infecção da bexiga natatória do peixe-zebra amplia a gama de questões que podem ser perguntado sobre interação patógeno-hospedeiro no epitélio mucoso vertebrado, oferecendo uma nova rota de infecção para outros patógenos que invadem através do epitélio e destacando a utilidade deste órgão para sondar doença vertebrado .
Zebrafish modelos de infecção epitelial ao nível da mucosa foram publicados que sondar os efeitos da perturbação do tracto intestinal por medicamentos ou agente patogénico 24,43. No entanto, este modelo de candidíase da mucosa é o primeiro a utilizar o swimbescada e, assim, amplia a gama de locais de infecção que podem ser investigados no peixe-zebra para além do trato digestivo. As diferenças entre a superfície da mucosa da bexiga natatória e do pulmão de mamíferos não estão completamente esclarecidos e interpretação / tradução de dados deste modelo para maior vertebrado deve ser feita com cautela.
A infecção da bexiga natatória preenche uma lacuna atual em modelos de infecção vertebrados e abre uma janela para a imagem latente as interações de células epiteliais / imune inata com um patógeno. Agora, uma variada gama de questões, anteriormente fora dos limites, é viável para explorar. Nós podemos determinar as interacções de células imunitárias inatas diferentes uns com os outros e com células epiteliais, o seu recrutamento espaço-temporal, e a natureza da C. proliferação albicans e comutação morfológica em relação ao ataque do sistema imunológico e progressão da doença em um hospedeiro não-imunossuprimidos. A possibilidade de imagem de um hospedeiro intacto durante várias horas a dias em greno detalhe representa uma vantagem óbvia e importante deste sistema.
Finalmente, as semelhanças de expressão de genes e ontológicas entre a bexiga natatória e do pulmão de mamíferos sugerem ainda que a segmentação deste órgão com knockdown gene ou drogas químicas pode revelar mecanismos conservadas da interação microbiana-lung e imunologia 50-52.
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Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Le Trinh e Dr. Tobin para generosamente fornecer a α-catenina: linha citrino peixes e Bill Jackman por nos permitir fazer a filmagem em seu laboratório. Os autores reconhecem as fontes de financiamento Institutos Nacionais de Saúde (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Projeto nº ME0-H-1-00517-13). Este manuscrito é publicado como principal Agricultura e Florestas Experiment Station número de publicação 3371.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
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