Abstract
Tidig försvar mot slemhinnor patogener består av både en epitelial barriär och medfödda immunceller. Den immunocompetency av båda, och deras inbördes kommunikation, är av största vikt för att skydda mot infektioner. Samspelet mellan epiteliala och medfödda immunceller med en patogen bäst undersökts in vivo, där komplext beteende utspelar över tid och rum. Men befintliga modeller inte möjliggör enkel spatiotemporala avbildning av slaget med patogener på mucosal nivå.
Modellen utvecklades här skapar en mucosal infektion genom direkt injektion av svamppatogen, Candida albicans, i swimbladder ungdomszebrafisk. Det resulte infektion möjliggör hög upplösning avbildning av epitelial och medfödda immun cellens beteende under utvecklingen av mucosal sjukdom. Mångsidig med denna metod möjliggör förhör hos värden för att söka av detaljerade sekvensen av immun händelser som leder till phagocyte rekrytering och undersöka roller speciella celltyper och molekylära vägar i skyddet. Dessutom kan beteendet hos patogenen som en funktion av immunattack avbildas samtidigt genom att använda fluorescerande protein-uttryck C. albicans. Ökad rumslig upplösning av värd patogen interaktion är också möjligt att använda den beskrivna snabba swimbladder dissektion teknik.
Den mucosal infektionsmodell som beskrivs här är enkel och mycket reproducerbar, vilket gör det till ett värdefullt verktyg för att studera mucosal candidiasis. Detta system kan också vara i stort sett att överföra till andra slemhinnor patogener såsom mykobakterier, bakterie- eller virus mikrober som normalt infekterar genom epitelytor.
Protocol
OBS: Alla zebrafisk vårdprotokoll och experiment utfördes enligt NIH riktlinjer enligt Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) protokoll A2012-11-03.
1. Zebrafish Uppfödning till 4 dagar efter Befruktning
- Samla AB zebrafisk, eller andra transgena linjer, inom de första 3 h efter befruktning, såsom visas i en annan video 34.
- Inkubera 120 ägg i en 15 cm Petri-skålar innehållande 150 ml av E3-media (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl2; 2 mM HEPES; pH 6,8) med metylenblått (0,3 | ig / ml slutlig koncentration) i en 33 ° C inkubator med 12/12 ljus / mörker fotoperiod.
- Byt media efter 6 timmar med E3 + PTU (1-fenyl-2-tiourea, 10 mikrogram / ml slutlig koncentration) och ta bort de döda ägg.
- Inkubera i 4 dagar vid 33 ° C, utbyta media med färsk E3 + PTU efter 2 dagar.
2. Iprojicerings Micro-nål Förberedelse
- Drag borosilikatglas kapillär (OD 1,2 mm, ID 0,69 mm) i en mikro nålen med hjälp av en nål avdragare med följande inställningar (550 Heat, 0 Pull, 130 Velocity, 110 Tid).
Anmärkning: Inställningarna kommer att variera från filament till filament till erhålla liknande sätt formade mikronålar (se figur 1) och kommer att behöva justeras när en ny glödtråd är installerad. - Fyll en mikronål med 3 | il av 0,4 | im-filtrerad fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4; pH 7,4) med användning av en 20 | il micro pipett spets.
- Konfigurera mikronålen på en mikropipett hållaren på en mikromanipulator fäst till en tryckinsprutningssystemet. Ställ insprutningstrycket till 30 PSI och pulsvaraktigheten vid 30 msek.
- Med hjälp av en petriskål med destillerat vatten, sänka mikro nålen tills 1/5 av nålen är i vattnet. Clip mikro nålen with fina pincett strax under vattenytan. Bring mikronålen ur vattnet och tryck ned pedalen flera gånger tills en bolus visas.
- Mät diametern på bolus genom att sänka mikro-nål på en hemocytometer skiktat med en droppe av typ A immersionsolja. Justera pulsvaraktigheten för att erhålla den önskade volymen (se tabell 1).
- Ställ mottrycket för bolus att förbli stabil i olja (sänka trycket om bolus ökar volymen och öka mottrycket om bolusvolymen minskar). Spela pulslängden för varje mikro nål.
- Ta bort PBS från mikro nålen genom att aspirera den med en microloader pipettspetsen och utvisa den överblivna PBS genom att placera den tillbaka på injektorn och vända den kontinuerliga pulsbrytare. Boka varje mikro nål.
3. Candida Framställning
- Streak Candida albicans transformerats med kodonoptimerade dTomato, GFP, BFP, EOS eller FjärranRött från en frusen stock (-80 ° C lager i 25% glycerol) med användning av en steril träpinne på en jäst peptine dextros (YPD) agarplatta (10 g / L jästextrakt, 20 g / L pepton, 20 g / L dextros , 20 g / L agar; autoklaveras och hälldes 25 ml i petriskålar) och inkubera över natten vid 30 ° C.
- Pick en koloni med användning av en steril träpinne och inokulera till 5 ml flytande YPD (10 g / L jästextrakt, 20 g / L pepton, 20 g / L dextros, autoklaveras och aseptiskt alikvoterades i 5 ml i 16 x 150 mm glas kultur rör).
- Inkubera över natten vid 30 ° C i en valstrumma vid 60 rpm.
- Samla 1 ml C. albicans kultur och överföring till en 1,7 ml sterilt centrifugrör.
- Centrifugera vid 5000 xg under ett par sek. Töm supernatanten och tillsätt 1 ml av steril PBS, vortexa grundligt. Upprepa detta två gånger.
- Räkna kolonierna med en hemocytometer genom att späda 1 ml lager 1: 1000 i steril PBS.
4. Injektion Zebrafish iden Swimbladder
- Värm en insprutningsskål (2% agaros) för 30 minuter i en 33 ° C inkubator.
- Vid den önskade tiden, ta bort 100 av de 150 ml E3 + PTU från 15 cm petriskål med fisken att injicera med hjälp av en 25 ml pipett utan att aspirera någon zebrafisk.
- Bedöva 4 dpf zebrafisk genom tillsats 2 ml av en 4 mg / ml buffrad tricaine metansulfonat lager (TR) till de 50 ml medium återstående (slutlig koncentration 200 pg / ml) och vänta 15 min.
- Enligt en dissekera mikroskop väljer fisk med en uppblåst swimbladder. Fisk kan också screenas vid denna tid för homogen fenotyp, såsom neutrofil fördelning i MPO: GFP linje med hjälp av en epifluorescens dissekera mikroskop.
- Späd C. albicans lager från sin ursprungliga koncentration (steg 3,8) till 1,5 x 10 7 kolonibildande enheter per ml (cfu / ml) i PBS.
- Överför 30 zebrafisk på injektions skålen med hjälp av en plastöverföringsledningtte och avlägsna överskottet medier.
- Med hjälp av en fisketråd verktyg (0,012 tum fiske diameter line superlimmad i en borosilikatglas kapillär), gör 3 rader 10 fiskar, genom att hålla injektions skålen vertikalt och orientera fisken vertikalt.
- Avlägsna överflödigt medier.
- Grundligt virvel röret med 1,5 x 10 7 cfu / ml C. albicans.
- Fyll en mikro-nål med 3 pl C. albicans med hjälp av en ny microloader pipettspetsen och ställa pulslängden till lämplig inställning (se steg 2.9).
- Rotera injektions skålen att göra en vinkel på 20 ° mellan mikro nål och chefen för fisken, siktar mot baksidan av swimbladder (Figur 3A).
- Tryck mikro nålen i swimbladder och se hålet i nålen är i lumen, och tryck på pedalen en gång.
- Upprepa för varje fisk och överför till en återhämtning maträtt (25 ml E3 + PTU) genom att översvämma skålen med E3 end tömma den i återhämtningen skålen.
- Överför ytterligare 30 fiskar till injektions skålen.
- Upprepa injektion med en ny mikro nål fylld med noggrant virvlas C. albicans.
- Avsluta genom att injicera PBS kontroll, vid behov med en annan injektion maträtt att undvika föroreningar och överför till en separat återvinnings maträtt (steg 4.10).
5. Screening av fisk för önskad Inoculum
- Bered 40 ml av 0,4% lågsmältande agaros-lösning (LMA) genom att tillsätta 160 mg av låg smälta agarosen till 40 ml E3, kokning genom mikrovågsbehandling tills det är upplöst, och kylning till 37 ° C. Lägg 400 pl av TR (slutlig koncentration 200 pg / ml) en gång kyls.
- Efter 30 min återhämtning, söva fisken som beskrivs (steg 4.3 med endast 1 ml TR i 25 ml E3 + PTU, slutlig koncentration 200 pg / ml).
- Överför 30 fisk (med så lite medium som möjligt) och 2 ml av LMA i ett vikt båt.
- Sug enskilda fiskar med en överföringspipett och platta fisken med en droppar LMA till en 96-väl bildplatta, endast med hjälp av de 10 x 6 centrala brunnar.
- Upprepa tills alla fiskar till skärmen laddas till bildplatta.
- Låt media stelna vid rumstemperatur under 5 min.
- Placera fisken på sin sida, vilket gör att de är i kontakt med glasbotten.
- Använda 20X objektiv på en inverterad epifluorescence / konfokalmikroskop och lämpligt filter, registrera antalet C. albicans jästceller i varje fisk s swimbladder.
- Välj fisk med 15-25 jästceller i swimbladder (eller önskad inokulat), euthanize icke-valda fisk (800 pg / ml TR i E3) och återgå valt fisk till en djup petriskål med 50 ml E3 + PTU från sätta 3 droppar E3 till bildplatt utvalda brunnar och aspire fisken med en plast överföringspipett.
- Inkubera vid 33 ° C under önskad varaktighet.
6. Imaging Fish Post-screening
- Vid den önskade tiden, ta bort 25 av de 50 ml E3 + PTU media från den djupa petriskål med fisken till bilden.
- Söva fisken som beskrivs (steg 4.3 med endast 1 ml TR i 25 ml E3 + PTU kvar, slutlig koncentration 200 pg / ml).
- Plate fisken i en 96-väl bildplatta och position på lämpligt (steg 5,3-5,7).
- Bild genom att skanna konfokalmikroskopi med hjälp av lämpliga lasrar och utsläppsfilter. Första fokus på fisk med hjälp av 4X mål enligt differential interferens kontrast (DIC) och förvärva bilder av regionen av intresse med hjälp av 20X objektiv med konfokala lasrar i skanningsläge med 2 ps / pixelhastighet och 1024 x 600 pixel aspect ratio. Förvärva Z-stackar med 1 um steglängd, applicera Kalman filter läge 3 ramar.
- Återgå till en djup petriskål med 50 ml E3 + PTU eller in individual brunnar (24 brunnar odlingsskål, 3 ml E3 + PTU) och inkubera vid 33 ° C.
7. dissekera Swimbladder
- Fyll en 10 ml spruta med högt vakuum fett.
- Bered en 2% LMA (steg 5,3 med 160 mg låg smält agaros i 8 ml E3).
- Vid önskad tid, söva fisken (steg 5,2).
- Överför 10 fisk till en 1,7 ml centrifugrör med en ml E3 och euthanize genom tillsats 200 pl av 4 mg / ml Tricaine (slutlig koncentration 800 pg / ml) till centrifugröret och inkubering under 15 min vid rumstemperatur.
- Förbered en avbildning glasskiva genom att placera fyra droppar vakuum fett i en fyrkant, 1 cm ifrån varandra på en Micro (75 x 25 mm, figur 2).
- Placera 2 droppar 2% LMA i mitten av torget.
- Placera en fisk på en separat glasskiva under ett dissekera mikroskop och kontrollera att hjärtat har slutat slå, ta bort överflödigt vatten.
- Plocka upp swimbladder av pneumatiska kanalen med vänster pincett, separera den från mag-tarmkanalen, och placera den i mitten av 2% LMA innan den stelnar.
- Placera en cover-slip (18 x 18 mm) ovanpå bild glasskiva och tryck tills den vidrör vakuum fett samt LMA (Figur 2).
- Bild inom 10 min av dissekering som beskrivs i steg 6.4. Upprepa steg från 7,7 till 7,11 med andra fiskar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjektion i den bakre swimbladder
Den experimentella metod som presenteras här beskriver injektion av en konsekvent dos av C. albicans jästceller i swimbladder av 4 dpf zebrafisk. Tidigare arbete med nedsänkning modellen antyder att swimbladder immunsvar mot C. albicans liknar däggdjur mucosal candidiasis 32. Här visar vi en modifierad infektionsmetod som är mer rättfram, reproducerbar och snabb; flera hundra zebrafisk kan injiceras och screenas inom ett par timmar.
Noggrann och reproducerbar infektion i swimbladder åstadkommes genom att rikta den bakre delen av orgeln genom mikroinjektion. Injektion i swimbladder är lättare att lära sig än de flesta andra mikroinjektion vägar för larver eller embryonala zebrafisk (t.ex. intravenös eller bakhjäman ventrikeln). Beredningen av fisken före injektion är similar som för andra injektionsställen, med undantag för att swimbladder behöver blåsas så fisken är äldre. Cirka 75% av de fiskar som togs upp vid 33 ° C har en uppblåst swimbladder med 4 dpf (data visas ej). Den swimbladder sitter under en epidermal samt tunt muskelskikt och mikro nål används för att injicera fisken måste avfasade. Den vinkel i vilken fisken injiceras (figur 3A) också kraftigt förbättrar hastigheten och lätthet av förfarandet. Injektion av bolus vid baksidan av swimbladder är viktigt eftersom det tillåter visualisering av alla jästceller vid screening och undviker närvaron av jästceller på vardera sidan av swimbladder, vilket kommer att skeva markeringen intervall. Injektion mot baksidan av swimbladder också undviker en eventuell förlust av inokulatet genom den pneumatiska kanalen och sedan ner i matsmältningskanalen. Verifiera som fisken har injicerats är relativt lätt som bolus förskjuter luftbubblan ochbaksida swimbladder fylls därefter med medium (figur 3C). Det är även möjligt att använda fenolrött vid injektion, vilket kommer att göra visualiseringen lättare. På grund av storleken på C. albicans jästceller (3-4 pm), är ympen dosen begränsad till koncentrationer under 5 x 10 7 cfu / ml på grund av igensättning av mikro nålen. Detta gör att injektionen av mellan en och 250 jästceller inom en 5 nl bolus. I våra händer, injicera 4 nl vid 1-1,5 x 10 7 cfu / ml gav de mest konsekventa resultat. Detta resulterade i ett intervall av 10-50 jästceller per fisk. Förträngning ympen till 15-25 jästceller (Figur 3B) ger en tätare fenotyp och svar. Med användning av dessa betingelser, approximativt 50% av fisk injicerade har lämplig inokulum intervall med över 95% överlevnad 24 h efter injektion (data ej visade). Det är också möjligt att hålla fisk med en lägre / högre inokulat för att undersöka effekten av patogen bördasjukdomsutvecklingen.
Den swimbladder är cirka 100 nl totala volymen (400 x 200 x 200 um, med hjälp av formeln för volymen av en ellipsoid L x H x B) så injektion av högre volymer är också möjligt (upp till 3 pulser av 4 nl varit används utan någon signifikant effekt på överlevnaden av fisken, data visas inte).
Längsgående intravital avbildning av enskilda fiskar att följa både värd och patogen beteende
Beteendet hos både värd och patogen kan följas icke-invasivt i flera dagar med hjälp av denna modell. Möjligheten att bilden utvecklingen av infektion vid hög upplösning in vivo kan och har använts för att undersöka patogenesen av mucosal candidiasis. Neutrofiler spelar en nyckelroll i motståndet mot candidiasis hos möss och människor 35-38. Använda MPO: GFP zebrafisk 39 (neutrofiler uttrycker grönt fluorescerande protein), och C. albicans uttrycker DTOMato röd fluorescerande protein 32, har vi observerat neutrophil- Candida dynamik under tidig infektion (Figur 4).
Neutrofiler är de första medfödda celltyp som ska rekryteras till platsen för mucosal infektion, och infektionen av swimbladder med levande C. albicans leder till en snabb och kontinuerlig rekrytering av neutrofiler (fig 4A, B). Intressant är neutrofiler inte väsentligen rekryteras till swimbladder när värmedödade jästceller injicerades (figur 4A, B).
Filament utvecklas snabbt efter injektion av jästceller och C. albicans fortsätter att gro för första 48 timmar efter injektion (HPI). Men efter denna punkt antalet filament minskar (Figur 4D) och andelen av jäst ökar (ej visad). Förmågan att följa enskilda fiskar möjliggör icke-invasivt dessa longitudinella studier (24-brunnarvävnadsodlingsskålar) och belyser de individuella skillnaderna i sjukdomsprogression och värdsvar (Figur 4C). Sådana detaljerade studier räkna svamp och immunceller vid infektionsstället under flera dagar kvar opraktiskt i musen.
En snabb swimbladder dissektion teknik för att förbättra avbildning
Imaging interaktionen av immun- eller epitelceller med C. albicans är relativt lätt i modellen presenteras här. Emellertid, under vissa omständigheter, närvaron av luftbubblan och tjockleken hos vävnaden som omger swimbladder, hud och muskler, äventyrar detaljerad rumslig upplösning. För att förbättra bildkvaliteten har vi utvecklat en metod för att dissekera swimbladder ur zebrafisk och bilden den snabbt (inom 10 min) genom konfokal mikroskopi (Figur 5A). Detta är särskilt användbart när bildåtergivning transgena fiskar linjer där fluorescens ubiquitously uttrycksoch det finns ovidkommande fluorescens i den omgivande vävnaden, såsom NF-kB: GFP 40 eller α-catenin: citrin linjer 41,42 (Figur 5B, C). Tekniken kräver skicklighet och praxis för att utföra snabbt, men det är möjligt att helt image 95% av all fisk försökt.
Figur 1: Micro-nål form för swimbladder injektion. (A) Översikt av mikro nålen form och mätning. (B) Förstoring av mikro nålspetsen från A. Varje större vertikal linje i B är 0.2 mm från varandra.
Figur 2: Bildåtergivning slide. En 2% LMA droppe placeras i mitten av fyra punkter av vakuum fett, en cm från varandra på en glasskiva. Den dissected swimbladder är placerad i mitten av LMA och ett täckglas sänkes ovanpå tills den kommer i kontakt med LMA och vakuum fett.
Figur 3: Injektion av C. albicans i swimbladder förblir lokaliserad till platsen för injektionen. (A) Schematisk bild av orientering och position av mikro-nål för att injicera C. albicans i baksidan av swimbladder i 4 dpf zebrafisk larver. (B) representant inokulat efter valet för injektion bolus av 15-25 jästceller genom epifluorescensmikroskopi för 3 olika grupper av fisk. Medelvärde och standard medelvärdets representeras, n = 17, 17, och 20 för grupper A, B och C respektive. (C) Representativa bilder av C. albicans (CaF2-DTOM, röd fluorescens uttrycker Candida) infektion i AB juvenil zebrafisk omedelbart efter InjeInsatser. Bilder förvärvades med 10X och 20X mål (vänster och höger paneler, respektive) och är kompositer av maximala prognoser i den röda kanalen (12 och 19 skivor, respektive) med en enda skiva i DIC-kanalen. Disposition av luftbubblan (gul) och epitelbeklädnaden (vit) är representerade på den vänstra panelen. Skala barer representerar 250 och 50 pm, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Swimbladder injektion möjliggör spatiotemporala dissektion av värd patogen dynamik. (A) Representativa bilder av MPO: GFP fisk linje injicerade med levande eller värme dödade (HK) CaF2-DTOM i swimbladder vid 4 dpf och avbildas 48 HPI. Bilder är kompositer av maximal projektion på den gröna and röda kanaler (20 skivor) och en enda skiva i DIC-kanalen. Skala barer representerar 100 nm. (B, C). Värd svar till C. albicans-infektion. Neutrofiler rekryteras till platsen för infektion (SOI) så tidigt som 6 HPI och hålla på att öka i antal under 48 timmar. Möjligheten att bilden och hålla enskilda fiskar separerade (24-brunnar) möjliggör detaljerade immun dynamik som ska visualiseras. (D) patogenreduktion svar. C. albicans jästceller gror för första 24 HPI men återgå till jästceller från 24 HPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Dissektion av swimbladder möjliggör finare detaljer som skall avbildas. (A) Schematisk representation av than kliver involverad i dissektion av swimbladder i 4-5 dpf zebrafisk. Blå pilar indikerar riktningen drar med pincett (L för vänster och R för höger). (B, C). Representativa bilder av dissekerade swimbladder från α-catenin: citrin fisk linje 41,42 (grön tight junctions) injiceras vid 4 dpf med C. albicans (CaF2-DTOM) och avbildas av konfokalmikroskopi 2 HPI. Paneler är kompositer av maximala projektioner i de röda och gröna kanaler (25 skivor för B och 3 skivor för C) och en enda skiva för DIC i panelen B. Skala barer 100 nm i B och 100 nm och 10 nm i C. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Volym (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Diameter (mm) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Tabell 1: Bolusvolymen till relationen diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förskott och begränsningar i swimbladder mikroinjektion sjukdomsmodell
Modellen som presenteras här är en förlängning av mucosal candidiasis nedsänkning modell som beskrivs i Gratacap et al (2013). det tillför fördelarna med en kontrollerad infektions tid, en mycket reproducerbar infektion dosen och därför förbättrad effektivitet. Vi visar här nya metoder som tillåter icke-invasiv tids dokumentation av infektionsdynamik i detalj, liksom högre upplösning ex vivo avbildning av swimbladder. Dessa förfaranden bör underlätta studier av C. albicans -innate immunsystemet interaktionsdynamik vid slemhinnan. Ett begränsat antal slemhinnor infektionsmodeller har beskrivits i zebrafisk, allt begränsat till tarmkanalen störningar / infektioner 24,43. Modellen swimbladder presenteras här sträcker platserna för infektion till ett organ som delar vissa likheter med lungan och erbjuder en begränsad platsav infektion, med mindre möjlighet för patogenen som skall tvättas bort.
Det finns flera viktiga faktorer som måste beaktas vid maste dessa tekniker. Den viktigaste punkten är kravet på en uppblåst swimbladder. Detta kräver att fisken ska åldras med 5 dpf när uppfödda vid 28 ° C eller 4 dpf vid 33 ° C. Denna högre temperatur används för att påskynda utvecklingen av fisken och bättre approximera det fysiologiska området av däggdjurs epiteliala temperaturer (mus hudtemperatur är 33,1 ° C 44). Behöver dock begränsningen av denna modell till just denna temperaturområde hållas i åtanke och observerade fenotyper bör kontrolleras i ett däggdjurssystem för mer komplett tolkning. Injektionsstället (den bakre swimbladder) är också kritisk, eftersom den pneumatiska kanalen förblir öppen i physostomous fisk (vilket inkluderar zebrafisk) och högtrycks injektion någon annanstans i det organ kan driva patogenen förbi swimbladder och in i mag-tarmkanalen. Kvantifiering av inokulatet är också mindre exakt om jästcellerna är inte alla på baksidan av swimbladder, eftersom tjockleken hos fisken i stammen gör det svårt att visualisera båda sidor av swimbladder. Dissektion av swimbladder kräver skicklighet och bildbehandling måste ske omedelbart efter att undvika artefakter på grund av fysiskt trauma av förfarandet.
De begränsningar av tekniken är främst relaterad till utvecklingsstadiet av fisken. Detta begränsar användningen av morpholino teknik för ett par dagar av studien, och knockdown effekt måste noggrant testade för att diskriminera mellan fullständig eller partiell effekt. Morfolino aktivitet här sent i utvecklingen har tidigare rapporterats, och vi har även framgångsrikt använts morpholinos i denna modell, med validerade skarv-blockering som fortfarande var effektivt vid 5 dpf. Användningen av pharmacological läkemedel kan vara ett bra alternativ i denna modell eftersom det inte finns någon begränsning för åldern på fisken. Användningen av fisk förbi 72 timmar efter befruktning kräver ibland mer tillsyn än att arbeta med larver zebrafisk, beroende på de institutionella Animal Care och användning kommittéer. Längden på studien också begränsad, eftersom zebrafisk inte överlever på höga priser för mer än 10 dagar i statiska laboratorieförhållanden 45. Å andra sidan, med hjälp av ungfisk av 5 dpf utveckling istället för yngre embryon eller larver möjliggör studier där alla organ såsom njurar, lever eller bukspottkörtel är fullt funktionell 46-49. Jämfört med cellodling in vitro eller in vivo musmodeller, antalet reagenser tillgängliga (antikroppar och kemiska antagonister-agonister) är begränsad i zebrafisk; emellertid, är möjligheten att tillsätta kemikalier direkt till medierna en fördel. Antalet knockout och knock-in zebrafisk är fortfarande begränsad, men rise riktad genomet redigering öppnar spännande möjligheter för generering av mutanter. Kombinationen av den relativa lätthet att konstruera fluorescerande reporter linjer (celltyp specifika eller signalväg specifika) med insyn i ungdomszebrafisk fortfarande en av de primära och unika fördelarna med detta system.
Ser fram emot
Den zebrafisk swimbladder infektionsmodell utökar frågor som kan ställas om värd patogen interaktion på ryggradsdjur slemhinneepitelet, som erbjuder en ny smittväg för andra patogener som invaderar genom epitel och lyfta fram nyttan av detta organ för sondering ryggradsdjur sjukdom .
Zebrafisk modeller av epitelial infektion vid mucosal nivå har publicerats som sond effekterna av tarmkanalen störningar av droger eller patogen 24,43. Emellertid är den första att utnyttja swimb denna mukös candidiasis modellstege och därmed utökar platserna för infektion som kan undersökas i zebrafisk utanför matsmältningskanalen. Skillnader mellan swimbladder slemhinnan och däggdjurs lungan är inte helt klarlagd och tolkning / översättning av data från denna modell till högre ryggradsdjur bör göras med försiktighet.
Den swimbladder infektion fyller en aktuell lucka i ryggradsdjur infektionsmodeller och öppnar ett fönster för att avbilda samspelet mellan medfödda immun / epitelceller med en patogen. Nu ett varierat utbud av frågor, som tidigare off-limits, är möjligt att utforska. Vi kan bestämma de interaktioner av olika medfödda immunceller med varandra och med epitelceller, deras spatiotemporala rekrytering, och arten av C. albicans spridning och morfologisk omkoppling i relation till immunangrepp och sjukdomsprogression i ett icke-immunsupprimerade värd. Möjligheten att avbilda en intakt värd under flera timmar till dagar i grevid detalj representerar en uppenbar och stor fördel med detta system.
Slutligen de ontologiska och genuttryck likheter mellan swimbladder och däggdjurslung tyder vidare att rikta detta organ med gen knockdown eller kemiska droger kan avslöja konserverade mekanismer mikrobiell-lung interaktion och immunologi 50-52.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Le Trinh och Dr Tobin för generöst att ge α-catenin: citrin fisklinje och Bill Jackman för att tillåta oss att göra inspelningen i sitt labb. Författarna erkänner de finansieringskällor National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 och R15AI094406) och USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Detta manuskript publiceras som huvud Jord- och skogsbruks Experiment Station publikationsnummer 3371.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
- Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
- Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
- Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
- Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
- Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
- Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
- Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
- Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
- Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
- Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
- Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
- Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
- Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
- Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
- Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
- Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
- Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
- Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
- Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
- Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
- Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
- Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
- Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
- Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
- Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
- Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
- Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).
