Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52182

Abstract

Vroege verdediging tegen mucosale pathogenen bestaat uit zowel een epitheliale barrière en aangeboren immuunsysteem cellen. De immunocompetency van beide, en hun onderlinge communicatie, zijn van het grootste belang voor de bescherming tegen infecties. De interacties van epitheliale en aangeboren immuuncellen met een pathogeen best onderzocht in vivo, waar complexe gedrag ontvouwt in tijd en ruimte. Echter, de bestaande modellen niet zorgen voor een gemakkelijke tijd-ruimtelijke beeldvorming van de strijd met ziekteverwekkers op het mucosale niveau.

Het ontwikkelde model creëert een mucosale infectie door directe injectie van de pathogene schimmel, Candida albicans, in de zwemblaas van jeugdige zebravis. De resulterende infectie maakt hoge-resolutie beeldvorming van epitheliale en aangeboren immuunsysteem cel gedrag gedurende de ontwikkeling van mucosale ziekte. De veelzijdigheid van deze werkwijze maakt ondervraging van de host naar de gedetailleerde opeenvolging van gebeurtenissen die leiden tot immuun ph sondeagocyte werving en naar de rol van specifieke soorten cellen en moleculaire pathways in bescherming te onderzoeken. Bovendien kan het gedrag van de pathogeen als functie van immune aanval gelijktijdig worden afgebeeld door fluorescent eiwit tot expressie C. albicans. Toegenomen ruimtelijke resolutie van de gastheer-pathogeen interactie is ook mogelijk met behulp van de beschreven snelle zwemblaas dissectie techniek.

De mucosale infectiemodel beschreven is eenvoudig en zeer reproduceerbaar, waardoor het een waardevol hulpmiddel voor de studie van mucosale candidiasis. Dit systeem kan ook globaal vertaalbaar andere mucosale pathogenen zoals mycobacteriële, bacteriële of virale microben die normaal infecteren door epitheliale oppervlakken.

Protocol

OPMERKING: Alle zebravis zorg protocollen en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH richtlijnen onder Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocol A2012-11-03.

1. zebravis Het grootbrengen tot 4 dagen na de bevruchting

  1. Verzamel AB zebravis, of andere transgene lijnen binnen de eerste 3 uur na bevruchting, zoals in een video 34.
  2. Incubeer 120 eieren in een 15 cm platen met 150 ml E3 media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl2, 2 mM HEPES, pH 6,8) met methyleenblauw (0,3 ug / ml uiteindelijke concentratie) in een 33 ° C incubator met 12/12 licht / donker fotoperiode.
  3. Vervang de media na 6 uur met E3 + PTU (1-fenyl-2-thioureum, 10 ug / ml uiteindelijke concentratie) en verwijder de dode eieren.
  4. Incubeer gedurende 4 dagen bij 33 ° C, wisselen de media verse E3 + PTU na 2 dagen.

2.projectie Micro-naald Voorbereiding

  1. Trek borosilicaat capillaire (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) in een micro-naald met behulp van een naald trekker met de volgende instellingen (550 Hitte; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
    OPMERKING: De instellingen variëren van gloeidraad tot gloeidraad gelijkvormige micro-naalden te verkrijgen (zie figuur 1) en moeten worden aangepast wanneer een nieuwe draad wordt geïnstalleerd.
  2. Vul een micronaald met 3 ui van 0,4 urn gefiltreerd fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2PO 4, pH 7,4) met 20 ul microloader pipet tip.
  3. Stel de micronaald een micropipet houder op een micromanipulator bevestigd aan een druk injectiesysteem. Stel de injectiedruk 30 PSI en de pulsduur van 30 msec.
  4. Met behulp van een petrischaal met gedestilleerd water, hoe lager de micro-naald tot 1/5 van de naald in het water. Clip de micro-naald with fijne pincet net onder de waterspiegel. Breng de micro-naald uit het water en duw het pedaal een paar keer tot een bolus verschijnt.
  5. Meet de diameter van de bolus door het verlagen van de micronaald een hemocytometer gelaagd met een druppel type A immersie olie. Pas de pulsduur om het gewenste volume te verkrijgen (zie tabel 1).
  6. Stel de tegendruk voor de bolus stabiel in olie te blijven (verlagen van de druk als de bolus verhoogt het volume en het verhogen van de tegendruk als de bolus volume afneemt). Noteer de pulsduur voor elk micro-naald.
  7. Verwijder de PBS uit de micro-naald door het opzuigen van het gebruik van een microloader pipettip en verdrijven de linker-over PBS door het plaatsen van het terug op de injector en flipping de continue puls schakelaar. Reserveer elk micro-naald.

3. Candida Voorbereiding

  1. Streak Candida albicans getransformeerd met-codon-geoptimaliseerde dTomato, GFP, BFP, EOS of FarRed uit een bevroren voorraad (-80 ° C voorraad in 25% glycerol) met een steriele houten deuvel op een gist peptine dextrose (YPD) agarplaat (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 20 g / l dextrose , 20 g / l agar, geautoclaveerd en uitgegoten in 25 ml petrischalen) en incubeer overnacht bij 30 ° C.
  2. Kies een kolonie met een steriele houten deuvel en beënt met 5 ml YPD vloeibaar (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 20 g / l dextrose, geautoclaveerd en aseptisch aliquotted in 5 ml in 16 x 150 mm glascultuur tubes).
  3. Incubeer overnacht bij 30 ° C in een roller trommel bij 60 opm.
  4. Verzamel 1 ml van C. albicans cultuur en overbrengen in een 1,7 ml steriele centrifugebuis.
  5. Centrifugeer bij 5000 xg voor een paar sec. Leeg de supernatant en voeg 1 ml steriel PBS, vortex grondig. Herhaal dit twee keer.
  6. Tel de kolonies met behulp van een hemocytometer door verdunning 1 ml voorraad 1: 1000 in steriele PBS.

4. Het injecteren van zebravis inde zwemblaas

  1. Warm een ​​injectie schaal (2% agarose) gedurende 30 min in een 33 ° C incubator.
  2. Op het gewenste moment, verwijder 100 van de 150 ml E3 + PTU van 15 cm petrischaal met de vis te injecteren met een pipet 25 ml aspireren zonder enige zebravis.
  3. Verdoven 4 dpf zebravis door toevoeging van 2 ml van een 4 mg / ml gebufferde tricaïne methaansulfonaat voorraad (TR) in de 50 ml resterende media (eindconcentratie 200 pg / ml) en wacht 15 minuten.
  4. Onder een microscoop ontleden, selecteer vis met een opgeblazen zwemblaas. Vis kan ook worden gescreend op dat moment voor homogene fenotype, zoals neutrofielen distributie in MPO: GFP lijn met behulp van een epifluorescente dissectiemicroscoop.
  5. Verdun het C. albicans stock van de oorspronkelijke concentratie (stap 3.8) tot 1,5 x 10 7 kolonievormende eenheden per ml (cfu / ml) in PBS.
  6. Transfer 30 zebravis op de injectie gerecht met behulp van een plastic overdracht pijptte en verwijder de overtollige media.
  7. Met behulp van een visserij-wire gereedschap (0,012 inch vissen diameter lijn super-gelijmd in een borosilicaat capillair), maken 3 regels van 10 vis, door het vasthouden van de injectie schotel verticaal en oriënteren de vis verticaal.
  8. Verwijder de overtollige media.
  9. Grondig vortex de buis met 1,5 x 10 7 kve / ml C. albicans.
  10. Vul een micro-naald met 3 ul van C. albicans behulp van een nieuwe microloader pipettip en stel de pulsduur op de betreffende instelling (zie stap 2.9).
  11. Draai de injectie schotel een hoek van 20 ° tussen de micronaald en de kop van de vis te maken, gericht naar de achterkant van de zwemblaas (figuur 3A).
  12. Duw de micro-naald in de zwemblaas, zorg ervoor dat de boring van de naald in het lumen, en druk eenmaal op het pedaal.
  13. Herhaal dit voor elke vis en over te dragen aan een herstel gerecht (25 ml E3 + PTU) door overstromingen van de schotel met E3 eend legen van het in het herstel gerecht.
  14. Breng eens 30 vis aan de injectie schotel.
  15. Herhaal de injectie met een nieuwe micro-naald gevuld met grondig gewerveld C. albicans.
  16. Finish door het injecteren van de PBS-controle, indien nodig, met behulp van een andere injectieplaats gerecht om besmetting te voorkomen en over te dragen aan een aparte herstel gerecht (stap 4.10).

5. Screening van de Vis voor Gewenste Inoculum

  1. Bereid 40 ml 0,4% laag smeltpunt agarose oplossing (LMA) door toevoeging van 160 mg van laag smeltende agarose 40 ml E3, koken met de magnetron tot opgelost en afkoelen tot 37 ° C. Voeg 400 ul van TR (eindconcentratie 200 pg / ml) eenmaal afgekoeld.
  2. Na 30 min herstel verdoven de vissen beschreven (stap 4.3 met slechts 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU, eindconcentratie 200 pg / ml).
  3. Transfer 30 vissen (met zo weinig media mogelijk) 2 ml LMA in een gewichtsverhouding boot.
  4. Zuig exemplaren met een pipet en de plaat de vis met 1 druppels LMA in een 96-well beeldplaat met alleen de 10 x 6 centrale putjes.
  5. Herhaal dit totdat alle vissen om het scherm worden geladen om de beeldvorming plaat.
  6. Laat de media stollen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  7. Plaats de vis op hun kant, zorg ervoor dat ze in contact komen met de glazen bodem.
  8. Met behulp van de 20X objectief op een omgekeerde epifluorescente / confocale microscoop en de juiste filter, registreren het aantal C. albicans gistcellen in ieders vis zwemblaas.
  9. Selecteer de vissen 15-25 gistcellen in de zwemblaas (of gewenst inoculum), inslapen niet geselecteerde vis (800 ug / ml TR in E3) en terug geselecteerde vis een diepe petrischaal met 50 ml E3 + PTU door het toevoegen van 3 druppels E3 om de beeldvorming plaat geselecteerde putten en opzuigen van de vis met een plastic transferpipet.
  10. Incubeer bij 33 ° C gedurende de gewenste tijdsduur.

6. Beeldvorming van de Fish Post-screening

  1. Op het gewenste tijdstip, verwijderen 25 van de 50 ml van de E3 + PTU media uit de diepe petrischaal met de vis op de foto.
  2. Verdoven de vissen beschreven (stap 4.3 met slechts 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU resterende eindconcentratie van 200 ug / ml).
  3. Plate de vis in een 96-well plaat beeldvorming en de positie op de juiste wijze (stappen 5,3-5,7).
  4. Afbeelding door scanning confocale microscopie met de juiste lasers en emissiefilters. Eerst nadruk op de vis met de 4X doelstelling van differentieel interferentie contrast (DIC) en beelden verkrijgen van het gebied van belang met de 20X objectief met confocale scanning mode lasers met 2 psec / pixel snelheid en 1024 x 600 pixels aspect ratio. Verwerven Z-stacks met 1 micrometer stapgrootte, het aanbrengen van Kalman filter modus van 3 frames.
  5. Terug te keren naar een diepe petrischaal met 50 ml E3 + PTU of in individual putjes (24 putjes kweekschaal, 3 ml E3 + PTU) en incubeer bij 33 ° C.

7. Opheldering van de zwemblaas

  1. Vul een 10 ml spuit met een hoog vacuüm vet.
  2. Bereid een 2% LMA (stap 5.3 met 160 mg van laagsmeltende agarose in 8 ml E3).
  3. Op het gewenste moment verdoven de vis (stap 5.2).
  4. Breng 10 vis een 1,7 ml centrifugebuis met 1 ml E3 en euthanize door toevoeging van 200 ul 4 mg / ml tricaïne (eindconcentratie van 800 ug / ml) aan de centrifugebuis en incuberen gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
  5. Bereid een beeldvormende objectglas door het plaatsen 4 druppels vacuüm vet in een vierkant, 1 cm van elkaar op een microscoopglaasje (75 x 25 mm, Figuur 2).
  6. Plaats 2 druppels 2% LMA in het midden van het plein.
  7. Plaats een vis op een aparte glazen dia onder een microscoop ontleden en te controleren of het hart is gestopt met kloppen, verwijder het overtollige water.
  8. (Figuur 4A).
  9. Pak de zwemblaas de pneumatische leiding met de linker pincet, scheidt van het spijsverteringskanaal, en plaats deze in het midden van de 2% LMA voordat het stolt.
  10. Plaats een cover-slip (18 x 18 mm) op de top van de beeldvorming glasplaatje en duw hem tot tegen de vacuüm vet evenals de LMA (figuur 2).
  11. Afbeelding binnen 10 min van dissectie zoals beschreven in stap 6.4. Herhaal stap 7,7-7,11 met de andere vissen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro-injectie in de achterste zwemblaas

De experimentele methode hier gepresenteerde beschrijft de injectie van een consistente dosis C. albicans gistcellen in de zwemblaas van 4 dpf zebravis. Vorige werk met de onderdompeling model suggereert dat de zwemblaas immuunrespons op C. albicans is vergelijkbaar zoogdier mucosale candidiasis 32. Hier laten we zien een aangepaste infectie methode die is eenvoudiger, reproduceerbare en snelle; enkele honderden zebravis worden geïnjecteerd en gescreend binnen een paar uur.

Nauwkeurige en reproduceerbare infectie van de zwemblaas wordt bewerkstelligd door richten het achterste gebied van het orgaan door micro-injectie. Injectie in de zwemblaas is gemakkelijker te leren dan de meeste andere micro-injectie routes voor larvale of embryonale zebravis (bijvoorbeeld intraveneus of achterhersenen ventrikel). De voorbereiding van de vis vóór de injectie is simiLAR die andere injectieplaatsen, behalve dat de zwemblaas moet worden opgeblazen, zodat de vis ouder. Ongeveer 75% van de vis verhoogd bij 33 ° C een opgeblazen zwemblaas van 4 dpf (gegevens niet getoond). De zwemblaas ligt onder een epidermale en dunne spierlaag en de micro-naald voor het injecteren van de vis te worden afgeschuind. De hoek waarin de vissen worden geïnjecteerd (Figuur 3A) ook verbetert de snelheid en het gemak van de procedure. Injectie van de bolus aan de achterkant van de zwemblaas is belangrijk omdat het maakt visualisatie van de gistcellen bij het screenen en vermijdt de aanwezigheid van gistcellen aan weerszijden van de zwemblaas, die de selectie bereik scheef. Injecteren naar de achterkant van de zwemblaas vermijdt ook een mogelijk verlies van het inoculum door de pneumatische buis en vervolgens in het spijsverteringskanaal. Het verifiëren van welke vis is geïnjecteerd is relatief eenvoudig als de bolus verdringt de luchtbel en deachterzijde van de zwemblaas wordt vervolgens gevuld met media (figuur 3C). Het is ook mogelijk fenolrood gebruik bij het injecteren, waarbij de visualisatie makkelijker maken. Vanwege de omvang van C. albicans gistcellen (3-4 urn), wordt het inoculum dosis beperkt tot concentraties van minder dan 5 x 10 7 cfu / ml door verstopping van de micronaald. Dit maakt de injectie van één tot 250 gistcellen binnen 5 nl bolus. In onze handen, injecteren 4 nl op 1-1,5 x 10 7 cfu / ml gaf de meest consistente resultaten. Dit resulteerde in een bereik van 10-50 gistcellen per vis. Het verkleinen van de entstof tot 15-25 gistcellen (figuur 3B) geeft een strakkere fenotype en reactie. Met deze omstandigheden ongeveer 50% van de geïnjecteerde vis de juiste inoculum bereik met meer dan 95% overleving 24 uur na injectie (gegevens niet getoond). Het is ook mogelijk om vissen om het effect van pathogeen last onderzoeken te houden met een lagere / hogere inoculumziekteontwikkeling.

De zwemblaas is ongeveer 100 nl totaal volume (400 x 200 x 200 urn, L x H x B, met de formule voor het volume van een ellipsoïde) zodat injectie van grotere volumes mogelijk (tot 3 pulsen van 4 nl geweest gebruikt zonder enig significant effect op de overleving van de vis, gegevens niet getoond).

Longitudinale intravitale beeldvorming van individuele vissen om zowel gastheer en pathogeen gedrag volgen

Het gedrag van zowel de gastheer en pathogeen kan niet-invasief worden gevolgd enkele dagen gebruik van dit model. De mogelijkheid om beelden op de ontwikkeling van de infectie op hoge resolutie in vivo en is gebruikt om de pathogenese van mucosale candidiasis onderzoeken. Neutrofielen spelen een sleutelrol bij resistentie tegen candidiasis bij muizen en mensen 35-38. Met behulp van MPO: GFP zebravis 39 (neutrofielen uiten groen fluorescerend eiwit), en C. albicans de uiting van de Dtomato rood fluorescerend eiwit 32 hebben we neutrophil- Candida dynamiek tijdens de vroege infectie (figuur 4) waargenomen.

Neutrofielen zijn de eerste aangeboren celtype worden verworven aan de kant van mucosale infectie en de infectie van de zwemblaas live C. albicans leidt tot een snelle en continue rekrutering van neutrofielen (figuur 4A, B). Interessant is neutrofielen niet wezenlijk aangeworven om de zwemblaas wanneer warmte gedode gistcellen werden geïnjecteerd (Figuur 4A, B).

Filamenten ontwikkelen zich snel na injectie van gistcellen en C. albicans blijft ontkiemen voor de eerste 48 uur na de injectie (HPI). Na dit punt het aantal filamenten af (figuur 4D) en het aandeel van gist verhogingen (niet getoond). Het vermogen te volgen exemplaren niet-invasief kunnen deze longitudinale studies (24-well plaatweefselkweek gerechten) en wijst op de individuele verschillen in progressie van de ziekte en gastheer reacties (figuur 4C). Dergelijke gedetailleerde studies sommen schimmel- en immuuncellen op de plaats van infectie meerdaagse blijven onpraktisch in de muis.

Een snelle zwemblaas dissectie techniek om beeldvorming te verbeteren

Beeldvorming van de interactie van immuun- of epitheelcellen met C. albicans is in de hier gepresenteerde model relatief eenvoudig. In bepaalde omstandigheden kan de aanwezigheid van de luchtbel en de dikte van het weefsel rondom de zwemblaas, huid en spieren, compromissen gedetailleerde ruimtelijke resolutie. Om de beeldkwaliteit te verbeteren hebben we een methode om de zwemblaas ontleden van de zebravis en snel Beeld wordt (binnen 10 minuten) van confocale microscopie (figuur 5A) ontwikkeld. Dit is vooral handig wanneer de beeldvorming van transgene vis lijnen waar de fluorescentie alomtegenwoordig wordt uitgedrukten er vreemde fluorescentie in het omringende weefsel, zoals NF-KB: GFP 40 of α-catenine: citroengeel lijnen 41,42 (Figuur 5B, C). De techniek vereist behendigheid en praktijk snel uitvoeren, maar het is mogelijk om volledig beeld 95% van de vis geprobeerd.

Figuur 1
Figuur 1: Micro-naald vorm voor zwemblaas injectie. (A) Overzicht van de vorm en de meting micro-naald. (B) Vergroting van de micro-naald tip van A. Elke grote verticale lijn in B zijn 0,2 mm van elkaar.

Figuur 2
Figuur 2: Imaging slide. Een 2% LMA druppel in het midden van 4 stippen van vacuüm vet, 1 cm van elkaar op een glasplaatje. De disseCTED zwemblaas wordt in het midden van de LMA en een dekglas neergelaten bovenop totdat het op de LMA en vacuüm vet maakt.

Figuur 3
Figuur 3: Injectie van C. albicans in de zwemblaas blijft gelokaliseerd op de injectieplaats. (A) Schematische voorstelling van de oriëntatie en positie van de micro-naald C. albicans injecteren in de achterkant van de zwemblaas in 4 dpf zebravis larven. (B) Representatieve inoculum na selectie voor injectie bolus van 15-25 gistcellen door epifluorescentie microscopie voor 3 verschillende groepen vissen. Gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde wordt weergegeven, n = 17, 17 en 20 voor groepen A, B en C respectievelijk. (C) Representatieve beelden van C. albicans (CaF2-Dtom, rode fluorescentie uiten Candida) infectie bij AB juveniele zebravis onmiddellijk na injectie. Beelden werden verworven met 10X en 20X doelstellingen (links en rechts panelen, respectievelijk) en zijn composieten van maximale projecties in het rode kanaal (12 en 19 plakjes, respectievelijk) met een enkel sneetje in de DIC-kanaal. Schets van de luchtbel (geel) en de epitheliale bekleding (wit) zijn vertegenwoordigd op het linker paneel. Schaalbalken 250 en 50 pm vertegenwoordigen respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: zwemblaas injectie zorgt voor ruimte en tijd dissectie van gastheer-pathogeen dynamiek. (A) Vertegenwoordiger beelden van MPO: GFP vis lijn geïnjecteerd met live of warmte gedood (HK) CAF2-Dtom in de zwemblaas op 4 dpf en afgebeeld 48 hpi. Beelden zijn composieten van maximale projectie op de green eennd rode kanalen (20 plakjes) en een enkel sneetje in de DIC-kanaal. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn. (B, C). Gastheerreactie C. albicans infectie. Neutrofielen worden gerekruteerd naar de plaats van infectie (SOI) vanaf 6 HPI en blijven nemen in aantal gedurende 48 uur. De mogelijkheid om beeld en houden afzonderlijke vissen gescheiden (24-well plaat) maakt gedetailleerde immuun dynamiek worden gevisualiseerd. (D) Pathogen respons. C. albicans gistcellen ontkiemen voor de eerste 24 HPI, maar terugkeren naar gistcellen van 24 hpi. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Dissectie van de zwemblaas zorgt voor fijnere details in beeld te brengen. (A) Schematische weergave van thij stappen betrokken bij dissectie van de zwemblaas in 4-5 DPF zebravis. Blauwe pijlen geven de richting van trekken met de pincet (L voor links en R voor rechts). (B, C). Representatieve beelden van ontleed zwemblaas van α-catenine: citrien vis lijn 41,42 (groen krappe kruispunten) geïnjecteerd op 4 dpf met C. albicans (CaF2-Dtom) en afgebeeld door confocale microscopie 2 hpi. Panelen zijn composieten maximale projecties in de rode en groene kanalen (25 segmenten voor B 3 plakken voor C) en een enkel segment van het DIC in paneel B. Schaalbalken 100 urn B en 100 urn en 10 urn C. Zoom klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Volume (nl) 1 2 3 4 5
Diameter (mm) 0,124 0,156 0,179 0,197 0,212

Tabel 1: Bolus volume relatie diameter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voorschotten en beperkingen van de zwemblaas micro-injectie ziektemodel

De hier gepresenteerde model is een uitbreiding van de mucosale candidiasis onderdompeling model Gratacap et al (2013).; voegt de voordelen van een gecontroleerde besmetting tijd zeer reproduceerbare infectiedosis, en dus verbeterde efficiëntie. We tonen hier nieuwe methoden die niet-invasieve temporale documentatie van de infectie dynamiek in groot detail, alsmede hogere resolutie ex vivo beeldvorming van de zwemblaas mogelijk te maken. Deze procedures moeten de studie van C. te vergemakkelijken albicans -innate immunologische interactie systeem dynamiek op het slijmvlies. Een beperkt aantal mucosale infectie modellen zijn beschreven in de zebravis, allemaal beperkt tot spijsverteringskanaal verstoring / infecties 24,43. De zwemblaas hier gepresenteerde model breidt de sites van de infectie tot een orgaan dat een aantal gelijkenissen met de long deelt en biedt een afgesloten terreinvan de infectie, met minder mogelijkheid voor de ziekteverwekker te weggespoeld.

Er zijn een aantal kritische factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het beheersen van deze technieken. Het belangrijkste punt is de eis voor een opgeblazen zwemblaas. Dit vereist de vis 5 dpf als kinderen wanneer gekweekt bij 28 ° C of 4 dpf bij 33 ° C Deze hogere temperatuur wordt gebruikt om de ontwikkeling van de vis versnellen en beter benaderen het fysiologische bereik van zoogdier epitheliale temperaturen (muizenhuid temperatuur 33,1 ° C 44). Echter, de beperking van dit model om deze bijzondere temperatuurbereik moet in gedachten worden gehouden en de waargenomen fenotypes moet in een zoogdier systeem worden gecontroleerd voor meer complete interpretatie. De injectieplaats (de achterste zwemblaas) is ook kritisch, als de pneumatische buis blijft open in physostomous vis (die zebravis bevat) en hoge druk injectie elders in het orgaan kan de ziekteverwekker te duwen langs de zwemblaas en in het spijsverteringskanaal. Kwantificering van het inoculum is minder nauwkeurig wanneer de gistcellen niet allemaal aan de achterkant van de zwemblaas, omdat de dikte van de vis in de romp maakt het moeilijk om beide zijden van de zwemblaas visualiseren. Dissectie van de zwemblaas vereist behendigheid en beeldvorming moet plaatsvinden direct na om artefacten te voorkomen dat als gevolg van de fysieke trauma van de procedure.

De beperkingen van de techniek hebben voornamelijk betrekking op het ontwikkelingsstadium van de vis. Dit beperkt het gebruik van morfolino technologie om een ​​paar dagen van onderzoek en knockdown werkzaamheid moet zorgvuldig worden getest om onderscheid tussen volledige of gedeeltelijke werkzaamheid. Morfolino activiteit zo laat in de ontwikkeling eerder gerapporteerd, en we hebben ook met succes gebruikt morpholinos in dit model, met gevalideerde splice-blocking dat steeds effectief was 5 dpf. Het gebruik van pharmacological drugs kan een goed alternatief in dit model als er geen beperking voor de leeftijd van de vis. Het gebruik van vis afgelopen 72 uur na de bevruchting vereist soms meer toezicht dan het werken met larvale zebravis, afhankelijk van de institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissies. De duur van de studie is ook beperkt, zoals zebravis niet overleven bij hoge langer dan 10 dagen in statische laboratoriumomstandigheden 45. Anderzijds, met jonge vissen van 5 dpf ontwikkeling plaats jongere embryo's of larven laat onderzoeken waar alle organen zoals nieren, lever of pancreas volledig functioneel 46-49. Vergeleken met in vitro celkweek of in vivo muizenmodellen, het aantal beschikbare reagentia (antilichamen en chemische antagonisten-agonisten) wordt beperkt in het zebravis; De mogelijkheid om chemische stoffen rechtstreeks aan de media aan een voordeel. Het aantal knock-out en knock-in zebravis is nog beperkt, maar de rise gerichte genoom bewerken opent nieuwe mogelijkheden voor het genereren van mutanten. De combinatie van het relatieve gemak fluorescente reporter lijnen (typespecifieke of signaleringsroute specifieke cel) met de transparantie van de juveniele zebravis blijft een van de primaire en unieke voordelen van dit systeem te construeren.

Vooruitblikkend

De zebravis zwemblaas infectie model breidt het bereik van de vragen die gesteld kunnen worden over de gastheer-pathogeen interactie op de gewervelde slijmvliesepitheel het aanbieden van een nieuwe route van besmetting voor andere pathogenen die binnendringen via het epitheel en het benadrukken van het nut van dit orgel voor het sonderen gewervelde ziekte .

Zebravismodellen van epitheliale infectie op de mucosale niveau zijn gepubliceerd dat de effecten van darmkanaal verstoring door drugs of pathogeen 24,43 sonde. Echter, dit mucosale candidiasis model is de eerste die de swimb benuttenladder en aldus wordt de reeks locaties van infectie die kunnen worden onderzocht in de zebravis buiten het spijsverteringskanaal. Verschillen tussen de zwemblaas mucosale oppervlak en de zoogdieren longen zijn niet volledig opgehelderd en interpretatie / vertaling van de gegevens van dit model tot hogere gewervelde moet voorzichtig worden gemaakt.

De zwemblaas infectie vult een huidige kloof in gewervelde infectie modellen en opent een venster voor de beeldvorming van de interacties van aangeboren immuunsysteem / epitheelcellen met een ziekteverwekker. Nu een divers scala aan vragen, die eerder off-limits, haalbaar is om te verkennen. We kunnen de interacties van verschillende aangeboren immuuncellen vast met elkaar en met epitheelcellen hun spatio-temporeel rekrutering en de aard van C. albicans proliferatie en morfologische schakelen in verband met immune aanval en ziekteprogressie in een niet-immuungecompromitteerde gastheer. De mogelijkheid om het beeld een intacte gastheer voor enkele uren tot dagen in grein detail is duidelijk en belangrijk voordeel van dit systeem.

Ten slotte is de ontologische en genexpressie gelijkenissen tussen de zwemblaas en de zoogdieren longen suggereren verder dat targeting dit orgel met gen knock-down of chemische drugs geconserveerde mechanismen van microbiële-long interactie en immunologie 50-52 kunnen onthullen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs danken dr Le Trinh en Dr. Tobin voor royaal verstrekken van de α-catenine: citrien vis lijn en Bill Jackman voor het mogelijk maken om de opnames te doen in zijn lab. De auteurs erkennen de financieringsbronnen National Institutes of Health (Subsidies 5P20RR016463, 8P20GM103423 en R15AI094406) en USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Dit handschrift is gepubliceerd als Hoofd Land- en Bosbouw Experiment Station publicatienummer 3371.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml tubes Axygen MCT-175-C
Deep Petri dishes Fisher Scientific 89107-632
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) Fine Science Tools 11251-30
Wooden dowels VWR Scientific 10805-018
Low melt agarose VWR Scientific 12001-722
Flaming Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate capillary Sutter Instruments BF120-69-10
MPPI-3 injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting microscope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
20X microscope objective Olympus UPlanSApo 20x/0.75
Roller drum New Brunswick Scientific TC-7
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Glass culture tubes (16 x 150 mm) VWR Scientific 60825-435
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
HEPES (Corning) VWR Scientific BDH4520-500GP
Children clay (Play-Doh) Hasbro
CaCl2 Fisher Scientific C69-500
Methylene blue VWR Scientific VW6276-0
PTU Sigma P7629-10G
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712
Hemocytometer (Hausser scientific) VWR Scientific 15170-172
Type A immersion oil Blue Marble Products 51935
Centrifuge Eppendorf 5424
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
Agarose (Lonza) VWR Scientific 12001-870
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Fishing wire Stren
96 well imaging plate (Sensoplate) Greiner Bio-One 655892
High vacuum grease (Dow Corning) VWR Scientific 59344-055
Microslide (25 x 75 mm) VWR Scientific 48300-025
Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 VWR Scientific 48366-045
15 cm Petri dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 32-106
Glycerol (EMD chemicals) VWR Scientific EMGX0185-5
24-well culture dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 25-107
Weight boats (8.9 cm) VWR Scientific 89106-766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Tags

Immunologie zebravis mucosale candidiasis mucosale infectie epitheliale barrière epitheelcellen aangeboren immuniteit zwemblaas,
Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C.,More

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection. J. Vis. Exp. (93), e52182, doi:10.3791/52182 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter