Abstract
粘膜病原体に対する初期の防衛は上皮バリアと自然免疫細胞の両方で構成されています。両方の免疫適格、と彼らの相互通信は、感染症に対する保護のための最も重要である。病原体上皮および自然免疫細胞の相互作用は最高の複雑な挙動は、時間と空間に繰り広げられる、生体内 、 で調査されている。しかし、既存のモデルは、粘膜レベルでの病原体との戦いの容易な時空間的イメージングを可能にしない。
ここで開発されたモデルは、少年ゼブラフィッシュの浮袋に、真菌病原体、 カンジダ·アルビカンスの直接注射により粘膜感染が作成されます。得られた感染は、上皮および粘膜疾患の発生を通じて自然免疫細胞の挙動の高分解能イメージングを可能にする。この方法の汎用性は、pHをもたらす免疫イベントの詳細なシーケンスをプローブするホストの尋問が可能にagocyte動員および保護において、特定の細胞タイプおよび分子経路の役割を検討する。また、免疫攻撃の関数としての病原体の挙動は、蛍光タンパク質を発現するC.で同時に撮像することができるアルビカンス 。宿主 - 病原体相互作用の増大した空間分解能について迅速浮袋切開技術を用いても可能である。
ここで説明粘膜感染モデルは、粘膜カンジダ症の研究のための貴重なツール作り、簡単な再現性の高いです。このシステムはまた、マイコバクテリア、正常上皮表面を介して感染する細菌またはウイルス、微生物などの他の粘膜病原体に広く翻訳可能であってもよい。
Protocol
注：すべてのゼブラフィッシュケアプロトコルおよび実験は施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルA2012-11-03下のNIHガイドラインに従って行った。
4日後に受精1.ゼブラフィッシュ飼育
- 別の映像34に示すように、最初の3時間後に受精内、ABゼブラフィッシュ、または任意の他のトランスジェニック系統を収集する。
- （; 0.17ミリモルのKCl、0.33のCaCl 2、0.33のMgCl 2、2mMのHEPES、pH6.8の5 mMのNaCl）をメチレンブルー（0.3 / mlの最終E3培地150 mlを含む15センチメートルペトリ皿に120の卵をインキュベート12/12の明/暗光周期で33℃のインキュベーター中の濃度）。
- E3 + PTU（1-フェニル-2-チオ尿素、10μg/ mlの最終濃度）と6時間後にメディアを交換して、死んだ卵を取り除く。
- 2日後に新鮮なE3 + PTUと交換媒体、33℃で4日間インキュベートする。
2.でjectionマイクロニードルの準備
- 次の設定で針プラーを使用したマイクロニードルに（110時間550ヒート; 0プル; 130ベロシティ）;（ID 0.69ミリメートル外径1.2ミリメートル）ホウケイ酸キャピラリーを引き出します。
NOTE：設定は、同様の形状のマイクロニードルを得るために、フィラメントからフィラメントに変化するであろう（ 図1参照）、新たなフィラメントがインストールされるたびに再調整する必要がある。 - 0.4μmのフィルタリン酸緩衝生理食塩水の3μlのマイクロニードルを埋める（; 137のNaCl、2.7のKCl; 10のNa 2 HPO 4; PBS 1.8 mMのKH 2 PO 4; pH7.4）を20μlのmicroloaderピペットを用いて、先端。
- 高圧噴射システムに接続されているマイクロマニピュレータにマイクロピペットホルダー上のマイクロニードルを設定します。 30 PSIへの射出圧力と30ミリ秒のパルス持続時間を設定します。
- 針の1/5が水になるまで蒸留水でペトリ皿を使用して、マイクロニードルを下げる。マイクロニードルのWiクリップちょうど水位以下に目細かいピンセット。水の中からマイクロニードルを持参し、ボーラスが表示されるまで、ペダルを数回押してください。
- タイプの一滴浸漬油でレイヤード血球計数器上のマイクロニードルを下げてボーラスの直径を測定します。所望の容積を得るために、パルス持続時間を調整する（ 表1参照）。
- 油で安定した状態を保つ（ボーラスは体積が増加した場合、圧力を下げ、ボーラスボリュームが減少した場合背圧を増やす）するボーラスのための背圧を設定します。各マイクロニードルのためのパルス持続時間を記録します。
- microloaderピペットチップを使用してそれを吸引することによって、微小針からPBSを削除し、インジェクタに戻ってそれを配置し、連続パルススイッチを切り替えることで、左オーバーPBSを追放。各マイクロニードルを予約。
3. カンジダ準備
- コドン最適化dTomato、GFP、BFP、EOSや極東で形質転換ストリークカンジダ·アルビカンス酵母peptineデキストロース（YPD）寒天プレート（10g / Lの酵母エキスが20g / Lペプトン、20グラム/ Lのデキストロースに滅菌木製のダボを用いて凍結ストック（25％グリセロール中で-80℃のストック）から赤、が20g / L寒天;オートクレーブし、ペトリ皿中を25ml注ぎ）、30℃で一晩インキュベートする。
- 滅菌木製のダボを用いてつのコロニーを選択し、YPD液体（10g / Lの酵母エキスが20g / Lペプトン、20グラム/ Lのデキストロース、オートクレーブし、無菌的に16×150mmのガラス培養において5mlのアリコートを5 mlに植菌管）。
- 60rpmでローラードラムで30℃で一晩インキュベートする。
- Cの 1ミリリットルを収集1.7ミリリットル滅菌遠心管にアルビカンス文化と転送。
- 秒のカップルのための5000×gで遠心分離する。上清を空にし、徹底的に滅菌PBS、渦の1ミリリットルを追加します。これを2回繰り返します。
- 滅菌PBS 1,000：1ミリリットル株式1に希釈することにより、血球計数器を使用してコロニーを数える。
4にゼブラフィッシュを注入する浮袋
- 33℃のインキュベーター中で30分間注入皿（2％アガロース）を温める。
- 所望の時間に、すべてのゼブラフィッシュを吸引することなく、25ミリリットルピペットを用いて注入するために、魚を含む15センチメートルペトリ皿からE3 + PTUの150ミリリットルの100を削除します。
- （最終濃度は200μg/ ml）を、残りの50ml培地に4 mg / mlの緩衝化トリカインメタンスルホン酸塩ストック（TR）2 mlを加えることにより、ゼブラフィッシュのdpf 4を麻酔し、15分間待つ。
- 解剖顕微鏡下では、膨張した浮袋で魚を選択します。魚はまた、MPOにおける好中球分布として、均質な表現型のために、その時点でスクリーニングすることができる：解剖顕微鏡落射蛍光を用いて、GFPライン 。
- C.を希釈PBS中1ml当たり形成単位1.5×10 7コロニー（CFU / ml）を基準にした元濃度（ ステップ3.8）からアルビカンス株式を。
- プラスチック製の移送管を用いて射出皿30ゼブラフィッシュを転送するTTEとは余分なメディアを取り出します。
- 釣りワイヤツールを使用すると、（0.012インチ径釣り糸ホウケイ酸キャピラリー内にスーパー接着）、垂直方向に注入ディッシュを保持し、垂直方向に魚を方向付けることで、10匹の魚の3行を作る。
- 余分なメディアを取り出します。
- 徹底的に1.5×10 7 CFU / mlのCでチューブをボルテックスアルビカンス 。
- Cの 3μlの1のマイクロニードルを埋めるアルビカンスが新しいmicroloaderピペットチップを使用して、適切な設定にパルス持続時間を設定する（ ステップ2.9参照 ）。
- 浮袋（ 図3A）の背面に向かって目指して、マイクロニードルと魚の頭の間に20°の角度を作るために、注入の皿を回します。
- 針の穴がルーメン内にあることを確認しながら、浮袋にマイクロニードルを押し、一度ペダルを押してください。
- 各魚を繰り返し、E3で料理をあふれさせることで回復皿（25ミリリットルE3 + PTU）に移転Dリカバリー皿にそれを空に。
- 注射皿に別の30魚を転送します。
- 徹底的にC.ボルテックスで満たされた新しいマイクロ針で繰り返し注射アルビカンス 。
- 必要に応じて、汚染を避けるため、別の回復皿（ ステップ4.10）に転送するために異なる注入の皿を使用して、PBS対照を注入して終了。
5.目的の接種のために魚のスクリーニング
- 溶解するまでマイクロ波処理し、37℃に冷却し、沸騰、E3 40mlのアガロース低溶融物160mgを加えることにより、0.4％低融点アガロース溶液（LMA）を40mlを準備する。一旦冷却TR（最終濃度200μg/ ml）を400μlのを追加します。
- （25 mLのE3 + PTU、最終濃度を200μg/ mlのにTRの唯一の1ミリリットルを使用してステップ4.3）に記載されているようで30分の回復後、魚を麻酔し。
- 体重ボートでLMAの2ミリリットルに転送（できるだけメディアとの）30魚。
- トランスファーピペットで吸引し、個々の魚とのみ10×6中央井戸を使用して、96ウェルイメージングプレートにLMAの1滴の魚プレート。
- 画面にすべての魚は、イメージングプレートにロードされるまで繰り返します。
- 媒体を5分間室温で固化しましょう。
- 彼らはガラスの底に接触していることを確認しながら、彼らの側に魚を置きます。
- 倒立落射蛍光/共焦点顕微鏡および適切なフィルターで20X対物レンズを用い、C.数を記録する各魚の浮袋でアルビカンス酵母細胞。
- 、浮袋で15-25酵母細胞魚（または所望の接種材料）を選択して安楽死させる非選択魚（E3におけるTRの800μgの/ mlで）によってE3 + PTU 50mlの深いペトリ皿に選択された魚を戻すイメージングプレート選択したウェルにE3の3滴を追加し、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて魚を吸引する。
- 所望の期間のために、33℃でインキュベートする。
6.魚ポストスクリーニングイメージング
- 所望の時間に、イメージに魚を含む深いペトリ皿からE3 + PTUメディアの50ミリリットルの25を削除します。
- （25ミリリットルE3 + PTU残り、最終濃度を200μg/ mlのにTRの唯一の1ミリリットルを使用してステップ4.3）に記載されているような魚を麻酔し。
- 適切96ウェルイメージングプレート及び位置に魚プレート（ - 5.7 5.3ステップ ）。
- 適切なレーザーおよび発光フィルターを使用して共焦点顕微鏡を走査して画像。微分干渉コントラスト（DIC）の下で4倍対物レンズを用いて魚に第1焦点と第2マイクロ秒/ピクセル速度および1024×600ピクセルのアスペクト比を有する走査モードで共焦点レーザーで20X対物レンズを用いて関心領域の画像を取得する。 3フレームのカルマン·フィルタモードを適用し、1μmのステップサイズでのZスタックを取得する。
- 50ミリリットルE3 + PTUまたはindividuaに深くシャーレに戻るリットルウェル（24ウェル培養皿を3ml E3 + PTU）と33℃でインキュベートする。
7.浮袋を解剖
- 高真空グリースで10ミリリットル注射器を埋める。
- 2％のLMA（アガロースE3の8ミリリットル中の低融点の160 mgのと歩調5.3）を準備します。
- 所望の時間に、魚（ ステップ5.2）を麻酔し。
- 転送10 E3 1mlの1.7 mlの遠心管に魚や遠心管に4 mg / mlのトリカイン（最終濃度800μg/ ml）を200μlを添加し、室温で15分間インキュベートすることによって安楽死させる。
- マイクロスライド（75×25ミリメートル、 図2）に1センチメートル離れて、広場に真空グリースの4滴を配置することにより、画像化スライドガラスを準備します。
- 広場の真ん中に2％のLMAの2滴を置きます。
- 解剖顕微鏡下で独立したスライドガラス上に1魚を置き、心臓が鼓動を停止していることを確認して、余分な水分を除去する。
- 消化管からそれを分離し、左ピンセットで空気圧ダクトによる浮袋をピックアップし、それが固化する前に、2％のLMAの中心に配置します。
- イメージングスライドガラスの上にカバースリップ（18×18 mm）を置き、真空グリースなどLMA（ 図2）に触れるまで押し込みます。
- 切開の10分以内に画像がステップ6.4で説明したように。 手順を繰り返し7.7から7.11他の魚と。
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Representative Results
後部浮袋でマイクロインジェクション
ここに提示された実験方法はC.一貫した用量の注射を記載ゼブラフィッシュのDPF 4の浮袋でアルビカンス酵母細胞。イマージョンモデルと以前の研究は、Cに浮袋免疫応答を示唆しているアルビカンスは、哺乳類の粘膜カンジダ症32と同様である。ここでは、より多くの、簡単な再現性があり、迅速であり、変更された感染法を実証する。ゼブラフィッシュの数百を注入し、数時間以内にスクリーニングすることができる。
浮袋の正確で再現性の感染は、マイクロインジェクションによって臓器の後部領域を標的にすることによって達成される。浮袋への注射は、幼虫または胚ゼブラフィッシュ（ 例えば、静脈内または後脳心室）のために、他のほとんどのマイクロインジェクションルートよりも学ぶことは簡単です。注射の前に魚の準備がシミです浮袋は魚が古いように膨張される必要があることを除いて、他の注入部位の場合とLAR、。 33℃での養殖魚の約75％が4のdpfによって膨張した浮袋を有した（データは示さず）。浮袋は魚を注入するために使用される表皮ならびに薄い筋肉層およびマイクロニードルの下に配置される面取りされる必要がある。魚が注入される角度（ 図3A）は、大幅に手順の速度および容易さを改善する。それはすべてのスクリーニング酵母細胞の可視化を可能にし、選択範囲をスキューう浮袋の各側の酵母細胞の存在を回避するように浮袋の背面にボーラスの注入が重要である。浮袋の背面に向かって注入することも空気圧ダクトを通った後、消化管の下接種材料の損失の可能性を避けることができます。ボーラスが気泡と変位として魚が注入された検証は比較的容易であるバック浮袋のは、その後のメディア（ 図3C）が充填されている。これは、注入時の可視化を容易にするであろう、フェノールレッドを使用することも可能である。なぜならCの大きさのアルビカンス酵母細胞（3 -が4μm）、接種量は、マイクロニードルの閉塞に起因する5×10 7のcfu / mlのより低い濃度に制限される。これは、5 nlのボーラス内に、1〜250の酵母細胞の注入を可能にする。私たちの手では、1〜1.5×10 7 CFU / mlで4 NLを注入するには、最も一貫性のある結果が得られた。これは、魚1匹あたり10〜50酵母細胞の範囲をもたらした。 15-25酵母細胞（ 図3B）に接種材料を狭めることより厳しい表現型とレスポンスを提供します。これらの条件を用いて、注入された魚の約50％が、95％を超える生存率24時間後噴射に適切な接種範囲（データは示さず）を有している。これは、上の病原体負荷の影響を調査するために、より低い/より高い接種物魚を維持することも可能である病気の発症。
浮袋は（楕円体の体積の計算式を使用して400×200×200ミクロン、長さx H x幅）約100 nlの総容量であるため、高いボリュームの注入も可能です（4 NLの3パルスまでされている魚の生存率に有意な影響なしに使用し、データは示さず）。
ホストと病原体の動作の両方を追跡する個々の魚の長手方向の生体内イメージング
宿主および病原体の両方の動作は、このモデルを使用して、数日間の非侵襲的追跡することができる。画像化する能力、インビボでの高解像度での感染の開発は、粘膜カンジダ症の発症機序を調べるために使用されていることができる。好中球は、マウスおよびヒト35-38におけるカンジダ症への抵抗で重要な役割を果たしている。使用MPO：GFPゼブラフィッシュ39（好中球は、緑色蛍光タンパク質を発現する）、及びC. dTomを表現アルビカンス赤色蛍光タンパク質32 ATO、我々は、感染の初期（ 図4）の間に好中球カンジダダイナミクスを観察した。
好中球は、粘膜感染部位に動員された最初の生得的な細胞型である、ライブC.と浮袋の感染アルビカンスは、好中球（ 図4A、B）の迅速かつ連続的な動員につながる。熱で殺した酵母細胞は、（ 図4A、B）を注入した際に興味深いことに、好中球は、実質的に浮袋に動員されていません。
フィラメントは、酵母細胞の注入後に急速に発展し、C.アルビカンスは最初の48時間のポスト噴射（HPI）のために発芽し続けています。しかし、フィラメントの数が減少する。この時点（ 図4D）および酵母の割合が増加した後（図示せず）。非侵襲的に個々の魚を追跡する能力は、これらの縦の研究（24ウェルプレートを可能に組織培養皿）とは、疾患の進行および宿主応答（ 図4C）の個人差を強調する。数日間感染部位で真菌および免疫細胞を列挙するような詳細な研究は、マウスにおいて非実用的で残る。
急速浮袋解剖技術は、イメージングを向上させるため
C.による免疫細胞または上皮細胞の相互作用を撮像するアルビカンスは、ここに提示モデルで比較的容易である。しかし、特定の状況では、気泡の存在浮袋、皮膚と筋肉を取り囲む組織の厚さは、詳細な空間分解能を損なう。画像品質を改善するために、我々は、共焦点顕微鏡（ 図5A）により（10分以内）に急速ゼブラフィッシュ画像の外に浮袋を分析するための方法を開発した。蛍光は、遍在的に発現されるトランスジェニックフィッシュ系統を撮像する場合に特に有用であるGFP 40またはαカテニン：シ トリンライン41,42（ 図5B、C）、およびそのようなNF-κBなどの周囲の組織内の余分な蛍光は、あります。技術は急速に実行するように器用さと練習が必要ですが、それはすべての魚の95％が試みられ、完全に画像に実現可能である。
図1：浮袋を注入するためのマイクロニードル形状。 （A）マイクロニードルの形状と測定の概要A.から微小針の先端の（B）倍率Bのそれぞれの主要な垂直線が離れて0.2ミリメートルである。
図2：イメージングスライド 。 2％のLMA降下がスライドガラスに約1cm離して真空グリースの4ドットの中央に配置されている。ディッセCTED浮袋は、LMAの中央に配置され、それがLMAと真空グリースに接触するまで、カバースリップ上に下げられる。
図3：浮袋中のC. albicansの注射は、注射部位に局在まま。落射蛍光顕微鏡法による15~25酵母細胞の注入ボーラスのための選択後（A）ゼブラフィッシュの幼生のdpf 4浮袋の背面にC.アルビカンスを注入するマイクロニードルの向きおよび位置の概略図、（B）の代表的な接種材料魚の3つの異なるグループのため。 C.のnはグループA、B、およびCはそれぞれ17、17、及び20（C）代表的な画像を、平均および平均の標準誤差で表される。すぐに麟蹄後にAB少年ゼブラフィッシュにおけるアルビカンス （CAF 2-dTom、カンジダを表す赤色蛍光）感染ction。画像は、（それぞれ左および右パネル）10Xと20Xの目的で取得した（それぞれ12及び19スライス）赤チャネルにおける最大突出部の複合体であるDICチャンネルにおける単一のスライスとした。気泡（黄色）と上皮ライニング（白）の概要は、左側のパネル上に表示されている。スケールバーはそれぞれ、250と50程度を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：浮袋注入は、ホスト病原体ダイナミクスの時空間的切開を可能にする。 （A）MPOの代表的な画像：4 DPFで浮袋にライブまたは熱殺した（HK）のCaF2-dTomを注射し、GFPの魚のラインは48 HPIをイメージした。画像は、緑のAの最大値投影の複合体であるND赤チャネル（20スライス）とDICチャンネルにおける単一のスライス。スケールバーは、100μmを表す。（B、C）。 C.への応答をホストアルビカンス感染症。好中球は、早ければ6 HPIとして感染症（SOI）の部位に補充し、48時間かけて増え続けるされている。画像への可能性と（24ウェルプレート）を分離し、個々の魚を保つには、詳細な免疫動態を可視化されることを可能にする。（D）病原体応答℃にアルビカンス酵母細胞は、最初の24 HPIのために発芽するが、24 HPIから酵母細胞に戻すされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：浮袋の解剖が画像化される細かい詳細が可能になります。トンの（A）概略図彼は4-5 DPFのゼブラフィッシュで浮袋の解剖に必要な手順。ブルーの矢印は、ピンセット（右用左用LとR）で引っ張っての方向を示す。（B、C）。 αカテニンから解剖浮袋の代表的な画像：シトリンの魚のライン41,42（緑のタイトジャンクション）は、カンジダ·アルビカンスと4 DPF（CAF2-dTom）で注入し、共焦点顕微鏡2 HPIによって画像化。パネルはBで100μmのパネルBにスケールバーに赤と緑のチャネル（Bの25スライスとCのために3スライス）の最大突起及びDICのための単一のスライスの複合体であるとCの100及び10μm くださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| ボリューム（NL） | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 直径（mm） | 0.124 | 0.156 | 0.179 | 0.197 | 0.212 |
表1：直径関係にボーラスボリューム。
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Discussion
浮袋のマイクロインジェクション疾患モデルの進歩と限界
ここで紹介するモデルは、Gratacap らに記載粘膜カンジダ症浸漬モデルの拡張である（2013）。それは、制御された感染時間、再現性の高い感染量、したがって、改善された効率の利点が追加されます。ここでは、非侵襲非常に詳細に感染動態の時間的なドキュメントだけでなく、より高解像度浮袋のex vivoイメージングを可能にする新しい方法を実証する。これらの手順は、Cの研究を促進すべきであるアルビカンスは、粘膜の免疫系の相互作用のダイナミクスを-innate。粘膜感染モデルの限られた数は、すべての消化管障害/感染24,43に限定されるものではゼブラフィッシュにおいて記載されている。ここに提示浮袋モデルが肺にいくつかの類似点を共有し、閉じ込められたサイトを提供しています臓器に感染部位を拡張洗い流されるべき病原体にはあまり可能性と、感染の。
これらの技術を習得する際に考慮しなければならないいくつかの重要な要因がある。最も重要な点は、膨張した浮袋の要件です。これは28℃または33℃で4 DPFで飼育時5 DPF歳のことを魚が必要ですこのより高い温度は、魚の開発を加速し、より良い哺乳類上皮温度（マウス皮膚温度は33.1℃で 44である）の生理学的範囲を近似するために使用される。しかし、この特定の温度範囲で、このモデルの制限に留意する必要があると観察された表現型は、より完全な解釈のために哺乳動物系で確認されるべきである。空気圧ダクトphysostomous魚類（ゼブラフィッシュを含む）と高圧injのに開いたままで注射部位（後部浮袋）も重要である浮袋を過ぎや消化管に病原体をプッシュすることができ、臓器の別の場所でection。トランクの魚の厚みが困難浮袋の両側を可視化することを可能にするため、酵母細胞は、浮袋の背面にすべてでない場合には接種材料の定量もあまり正確である。浮袋の切開は、器用さを必要とし、画像化に起因手順の物理的外傷にアーチファクトを回避するために直後に行われる必要がある。
技術の限界は、魚の発達段階に主に関連している。これは、研究の数日モルホリノ技術の使用を制限し、ノックダウン効果は、慎重に完全または部分的な有効性を区別するために試験されなければならない。モルホリノ活動は開発中のこの後半は、以前に報告されている、と我々はまた、成功してまだ5 DPFに有効であった検証スプライスブロッキングで、このモデルではモルフォリノを使用してきた。 PHARMの使用魚の年齢に制限はありませんようにacological薬は、この特定のモデルでは良い代替手段かもしれません。 72時間後に受精過去の魚を使用することは時々、幼虫のゼブラフィッシュでの作業の機関の動物の管理と使用の委員会に応じてより多くの監督が必要です。ゼブラフィッシュは、静的な実験室条件45で10日間以上の高レートで生存しないように、研究の長さも、拘束されている。一方で、代わりに若い胚または幼虫の開発DPF 5の稚魚を使用するような腎臓、肝臓や膵臓などのすべての器官が46-49完全に機能的研究が可能になります。 インビトロ細胞培養またはインビボでのマウスモデルにおいて比較し、（抗体および化学的ア ンタゴニスト、アゴニスト）の試薬 の数はゼブラフィッシュにおいて制限されている。しかし、メディアに直接化学物質を追加する可能性が有利である。ノックアウトの数とノックインゼブラフィッシュはまだ限られているが、RISターゲットゲノム編集のeは、変異体の生成のための刺激的な可能性を開く。若年ゼブラフィッシュの透明性蛍光レポーター系（細胞型特異的またはシグナル伝達経路特異的）を構築するための相対的な容易さの組み合わせは、このシステムの主とユニークな利点の一つである。
楽しみにしている
ゼブラフィッシュ浮袋感染モデルは、上皮を通じて侵入する他の病原体のための感染症の新たなルートを提供し、脊椎動物の疾患をプロービングするためのこの器官の有用性を強調し、脊椎動物の粘膜上皮における宿主 - 病原体相互作用について尋ねことができる質問の範囲を拡張。
粘膜レベルでの上皮感染のゼブラフィッシュのモデルは、薬や病原体24,43によって腸管障害の影響を探ることが発表されている。しかし、この粘膜カンジダ症モデルがswimbを利用することが第一です。はしごため、消化管を超えてゼブラフィッシュで調べることができる感染部位の範囲を拡張します。浮袋の粘膜表面および哺乳動物肺の違いは完全には解明されておらず、高等脊椎動物に、このモデルからのデータの解釈/翻訳を注意深くなされるべきである。
浮袋感染は、脊椎動物感染モデルにおける現在のギャップを埋め、病原体に先天性免疫/上皮細胞の相互作用を画像化するためのウィンドウを開きます。今、以前に立ち入り禁止の質問の多様な範囲は、探索することが実現可能である。我々は、互いに、そして上皮細胞、それらの時空間動員、およびC.の性質の異なる自然免疫細胞の相互作用を決定することができるアルビカンスの増殖および非免疫抑制宿主における免疫攻撃および疾患の進行に関連する形態学的切替。画像への可能性は、GREの日数に数時間そのままホスト詳細にこのシステムの明らかと大きな利点を表している。
最後に、浮袋と哺乳類の肺の間に存在論的、および遺伝子発現の類似性は、さらに遺伝子ノックダウンや化学薬品でこの器官を標的にする微生物の肺相互作用および免疫学50〜52の保存されたメカニズムを明らかにすることができることを示唆している。
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Acknowledgments
私たちは彼の研究室で撮影を行うことを可能にするためシトリンの魚のラインとビル·ジャックマン：著者は、寛大にαカテニンを提供するための博士ルトリン博士とトービンに感謝。著者は、資金源国立衛生研究所（助成5P20RR016463、8P20GM103423とR15AI094406）とUSDAを認める（プロジェクト＃ME0-H-1-00517-13）。この原稿は、メイン農林試験場公開番号3371として公開されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
- Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
- Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
- Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
- Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
- Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
- Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
- Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
- Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
- Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
- Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
- Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
- Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
- Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
- Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
- Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
- Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
- Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
- Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
- Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
- Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
- Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
- Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
- Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
- Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
- Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
- Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
- Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).
