Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modellering candidiasis i slimhinner i Larvesebrafisk av Swimbladder Injection

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52182
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

Abstract

Tidlig forsvar mot slimhinne patogener består av både en epitelial barriere og medfødte immunceller. Den immunocompetency av begge, og deres inter, er avgjørende for beskyttelse mot infeksjoner. Interaksjonene mellom epitel og medfødte immunceller med et patogen er best undersøkt in vivo, hvor kompleks oppførsel utfolder seg over tid og rom. Men ikke eksisterende modeller ikke tillate for enkel rom-tid-avbildning av kampen med patogener på slimhinnene nivå.

Den modellen som er utviklet her skaper en slimhinne infeksjon ved direkte injeksjon av soppens patogen, Candida albicans, inn i swimbladder av juvenile sebrafisk. Den resulterende infeksjon gir høy oppløsning avbildning av epitel og medfødte immunceller oppførsel gjennom hele utviklingsprosessen av slimhinnesykdommer. Allsidigheten til denne metoden gjør for avhør av verten for å sondere detaljert sekvens av immun hendelser som fører til phagocyte rekruttering og for å undersøke rollene til bestemte celletyper og molekylære stier i beskyttelse. I tillegg kan virkemåten av organismen som en funksjon av immunangrep avbildes samtidig ved hjelp av fluorescerende protein-uttrykk C. albicans. Økt romlig oppløsning av host-patogen interaksjoner er også mulig å bruke den beskrevne rask swimbladder disseksjon teknikk.

Mucosal infeksjon modellen beskrevet her er enkel og svært reproduserbare, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for studiet av candidiasis i slimhinner. Dette systemet kan også være stort sett settes til andre slimhinne patogener slik som mykobakterielle, bakterielle eller virale mikrober som normalt infiserer gjennom epiteliale overflater.

Protocol

MERK: Alle sebrafisk omsorgs protokoller og eksperimenter ble utført i samsvar med NIH veiledningen for Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokoll A2012-11-03.

1. Sebrafisk stell til 4 dager etter befruktning

  1. Samle AB sebrafisk, eller andre transgene linjer, innen de første tre timer etter befruktning, som vist i en annen video 34.
  2. Inkuber 120 egg i en 15 cm petriskåler inneholdende 150 ml av mediet E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgCl2, 2 mM HEPES, pH 6,8) sammen med metylen blått (0,3 ug / ml endelig konsentrasjon) i en 33 ° C inkubator med 12/12 lys / mørk daglengde.
  3. Erstatte media etter 6 timer med E3 + PTU (1-fenyl-2-thiourea, 10 mikrogram / ml endelig konsentrasjon) og fjerne de døde egg.
  4. Inkuberes i 4 dager på 33 ° C, utveksle media med fersk E3 + PTU etter 2 dager.

2. Ijection Micro-nål Forberedelse

  1. Trekk borosilikat kapillær (OD 1,2 mm; ID 0.69 mm) inn i en micro-nål ved hjelp av en nål avtrekker med følgende innstillinger (550 Heat; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
    MERK: Innstillingene vil variere fra filament til filament å oppnå lignende formede mikro nåler (se figur 1), og må justeres på nytt når en ny filament er installert.
  2. Fyll en mikro-nål med 3 ul av 0,4 um-filtrert fosfatbuffersaltløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2 HPO 4; 1,8 mM KH 2PO 4, pH 7,4) ved bruk av en 20 ul microloader pipette tips.
  3. Sett opp mikro-pinne på en mikropipette holder på en micromanipulator festet til et press innsprøytning. Sett injeksjonstrykket til 30 PSI og pulsvarigheten på 30 ms.
  4. Ved hjelp av en petriskål med destillert vann, senke mikro-pinne inntil 1/5 av nålen er i vannet. Klem mikro-pinne with fin pinsett like under vannflaten. Ta med mikro-pinne ut av vannet og trykk pedalen flere ganger til en bolus vises.
  5. Måle diameteren av bolus ved å redusere mikro-nål på et hemocytometer lagvis med en dråpe av type A nedsenking olje. Juster pulsvarighet for å oppnå det ønskede volum (se tabell 1).
  6. Still mottrykket for bolus å holde seg stabilt i olje (senke trykket hvis bolus øker volumet og øke mottrykket hvis bolusvolum avtar). Spill pulsvarigheten for hver mikro-pinne.
  7. Ta av PBS fra mikro-pinne ved å aspirere den med en microloader pipettespissen og utvise venstre-over PBS ved å plassere den tilbake på injektoren og blar kontinuerlig impulsbryter. Forbeholder hver mikro-pinne.

3. Candida Forberedelse

  1. Streak Candida albicans transformert med kodonoptimalisert dTomato, GFP, BFP, EOS eller FarRød fra en frosset lager (-80 ° C lager i 25% glycerol) ved hjelp av en steril treplugg på en gjær peptine dekstrose (YPD) agarplate (10 g / L gjærekstrakt, 20 g / l pepton, 20 g / L dekstrose , 20 g / L agar, autoklaveres og helte 25 ml i petriskåler) og inkuberes over natten ved 30 ° C.
  2. Plukk en koloni ved hjelp av en steril treplugg og inokulere til 5 ml YPD-væske (10 g / L gjærekstrakt, 20 g / l pepton, 20 g / l dekstrose, autoklavert og aseptisk aliquotted i 5 ml i 16 x 150 mm glasskultur rør).
  3. Inkuber over natten ved 30 ° C i en valsetrommel ved 60 rpm.
  4. Samle 1 ml C. albicans kultur og overføring til et 1,7 ml sterilt sentrifugerør.
  5. Sentrifuger ved 5000 x g i et par sekunder. Tømme supernatanten og tilsett 1 ml steril PBS, virvle grundig. Gjenta dette to ganger.
  6. Telle koloniene med en hemocytometer ved å fortynne 1 ml lager 1: 1000 i steril PBS.

4. Injeksjon av Sebrafisk iden Swimbladder

  1. Varm en injeksjons fatet (2% agarose) i 30 minutter i en 33 ° C inkubator.
  2. Ved ønsket tidspunkt, fjerne 100 av de 150 ml E3 + PTU fra 15 cm petriskål inneholdende fisken å injisere ved hjelp av en 25 ml pipette uten å aspirere noen sebrafisk.
  3. Bedøve 4 dpf sebrafisk ved å tilsette 2 ml av en 4 mg / ml bufret Tricaine metansulfonat lager (TR) til de gjenværende 50 ml media (sluttkonsentrasjon 200 pg / ml) og vent i 15 min.
  4. Under en disseksjonsmikroskop, velge fisk med en oppblåst swimbladder. Fisk kan også bli vist på den tiden for homogen fenotype, som for eksempel distribusjon nøytrofile i MPO: GFP linje ved hjelp av en epifluorescence dissekere mikroskop.
  5. Fortynne C. albicans lager fra sin opprinnelige konsentrasjon (trinn 3.8) til 1,5 x 10 7 kolonidannende enheter per ml (cfu / ml) i PBS.
  6. Overføre 30 sebrafisk på injeksjons tallerken med en plast overføring rørtte og fjerne overflødig medier.
  7. Ved hjelp av en fiske-ledning verktøy (0,012 tommer fiske diameter linje super-limt inn en borosilikat kapillær), lage 3 linjer med 10 fisk, ved å holde injeksjons fatet vertikalt og orientere fisken vertikalt.
  8. Fjern overflødig medier.
  9. Grundig vortex røret med 1,5 x 10 7 cfu / ml C. albicans.
  10. Fylle en mikro-pinne med 3 mL av C. albicans ved hjelp av en ny microloader pipette og angi pulsvarigheten til riktig innstilling (se trinn 2.9).
  11. Rotere injeksjons rett til å gjøre en vinkel på 20 ° mellom mikro-nål og leder av fisk, sikter mot baksiden av swimbladder (figur 3A).
  12. Skyv mikro-pinne inn i swimbladder, noe som gjør at boringen av nålen er i lumen, og trykk på pedalen en gang.
  13. Gjenta for hver fisk og overføre til en recovery tallerken (25 ml E3 + PTU) ved flom fatet med E3 end den tømmes i utvinningen parabolen.
  14. Overføre ytterligere 30 fisk til injeksjons parabolen.
  15. Gjenta injeksjon med en ny mikro-pinne fylt med grundig vortexet C. albicans.
  16. Elegant ved å injisere den PBS-kontroll, om nødvendig, ved hjelp av forskjellige injeksjonsantenne for å unngå forurensning, og overføre til en separat gjenvinning av fatet (trinn 4.10).

5. Screening the Fish for Ønsket Inokulum

  1. Forbered 40 ml av 0,4% agarose med lavt smelteoppløsning (LMA) ved å tilsette 160 mg agarose med lav smelte til 40 ml E3, koking av mikrobølger til det er oppløst, og avkjøling til 37 ° C. Tilsett 400 ul av TR (sluttkonsentrasjon 200 pg / ml) en gang avkjølt.
  2. Etter 30 min utvinning, bedøver fisken som beskrevet (trinn 4.3 ved å bruke kun ett ml TR i 25 ml E3 + PTU, sluttkonsentrasjon 200 pg / ml).
  3. Overføring 30 fisk (med så lite media som mulig) til 2 ml av LMA i en vekt båt.
  4. Aspirer enkeltfisk med en overføring pipette og plate fisken med en LMA dråper inn i en 96-brønners plate avbildning, bare ved hjelp av de 10 x 6 sentrale brønner.
  5. Gjenta til all fisken til skjermen er lastet til bildebehandling plate.
  6. La mediet størkne ved romtemperatur i 5 min.
  7. Plasser fisken på sin side, noe som gjør at de er i kontakt med glassbunn.
  8. Bruke 20X objektiv på en omvendt epifluorescence / konfokal mikroskop og riktig filter, registrere antall C. albicans gjærceller i hver fiskens swimbladder.
  9. Velg fisken med 15-25 gjærceller i swimbladder (eller ønsket inokulum), avlive ikke-utvalgte fisk (800 ug / ml TR i E3) og returnere utvalgte fisk til en dyp petriskål med 50 ml E3 + PTU av tilsetning av 3 dråper E3 til avbildningsplate utvalgte brønner og aspirering av fisk med en plastoverførings pipette.
  10. Inkuber ved 33 ° C i den ønskede varighet.

6. Imaging Fish Post-screening

  1. Ved ønsket tidspunkt, fjernes 25 av de 50 ml E3 + PTU medier fra den dype Petriskål inneholdende fisken til bildet.
  2. Bedøver fisken som beskrevet (trinn 4.3 ved å bruke kun ett ml TR i 25 ml E3 + PTU gjenværende, sluttkonsentrasjon 200 pg / ml).
  3. Plate fisken inn i en 96-brønns bildebehandling plate og posisjon hensiktsmessig (trinn 5.3 til 5.7).
  4. Bilde ved å skanne konfokalmikroskopi å bruke de riktige lasere og emisjonsfiltre. Først fokus på fisken med 4X Målet etter differensial interferens kontrast (DIC) og hente bilder fra regionen av interesse å bruke 20X objektiv med konfokale lasere i skannemodus med to usek / pixel fart og 1024 x 600 pixel størrelsesforhold. Erverve Z-stabler med en mikrometer trinnstørrelse, bruke Kalman filter modus av tre rammer.
  5. Tilbake til en dyp petriskål med 50 ml E3 + PTU eller inn individual brønner (24-brønnen kultur parabolen, 3 ml E3 + PTU) og inkuberes ved 33 ° C.

7. dissekere Swimbladder

  1. Fyll en 10 ml sprøyte med høyt vakuum fett.
  2. Fremstille en 2% LMA (trinn 5.3 med 160 mg av lavtsmeltende agarose i 8 ml E3).
  3. Ved ønsket tidspunkt, bedøver fisken (trinn 5.2).
  4. Overføring 10 fisk til en 1,7 ml sentrifugerør med 1 ml av E3 og avlive ved tilsetning av 200 ul av 4 mg / ml Tricaine (sluttkonsentrasjon 800 pg / ml) til sentrifugerør og inkubering i 15 minutter ved romtemperatur.
  5. Forberede en bilde glass lysbilde ved å plassere fire dråper vakuum fett i en firkant, en cm fra hverandre på en microslide (75 x 25 mm, figur 2).
  6. Plasser to dråper 2% LMA i midten av plassen.
  7. Plasser en fisk på et eget glass skyve under en disseksjonsmikroskop og kontrollere at hjertet har sluttet å slå, fjerne overflødig vann.
    8. (Figur 4A).
  8. Plukk opp swimbladder av pneumatisk kanal med venstre pinsett, som skiller den fra fordøyelseskanalen, og plassere den på midten av 2% LMA før det stivner.
  9. Plasser en cover-slip (18 x 18 mm) på toppen av bilde glass lysbilde og skyv den til den berører vakuum fett samt LMA (figur 2).
  10. Bilde i 10 min for disseksjon som beskrevet i trinn 6.4. Gjenta trinn 07.07 til 07.11 med de andre fiskene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikroinjeksjon i bakre swimbladder

Den eksperimentelle metode som presenteres her beskriver injeksjon av en konsistent dose C. albicans gjærceller i swimbladder av fire dpf sebrafisk. Tidligere arbeid med nedsenking Modellen viser at swimbladder immunrespons til C. albicans er lik pattedyr mukosal candidiasis 32. Her viser vi en modifisert infeksjon metode som er mer oversiktlig, reproduserbar og rask; flere hundrevis av sebrafisk kan injiseres og skjermet innen et par timer.

Nøyaktig og reproduserbar infeksjon av swimbladder oppnås ved å målrette den bakre delen av organet ved mikroinjeksjon. Injeksjon i swimbladder er lettere å lære enn de fleste andre mikroinjeksjon ruter for larve eller embryonale sebrafisk (f.eks intravenøs eller hindbrain ventrikkel). Tilberedning av fisken før injeksjon er similar den for andre injeksjonssteder, med det unntak at swimbladder må blåses opp slik at fisken blir eldre. Omtrent 75% av fisken tas opp ved 33 ° C har en oppblåst swimbladder med 4 dpf (data ikke vist). Den swimbladder er plassert under en epidermal samt tynne muskellaget og mikro-nål som brukes for injisering av fisken må være avfaset. Vinkelen ved hvilken fisken blir injisert (figur 3A) også i stor grad bidrar til raskere og lettere prosedyren. Injeksjon av bolus på baksiden av swimbladder er viktig fordi det tillater visualisering av alle gjærcellene ved screening og unngår tilstedeværelse av gjærceller på hver side av swimbladder, som vil forskyve det valgte området. Injisering mot baksiden av swimbladder unngår også et mulig tap av inoculumet gjennom den pneumatiske kanalen og deretter nedover i fordøyelseskanalen. Verifisering som fisken er blitt injisert er forholdsvis enkelt som bolus forskyver luftboblen ogiden av swimbladder senere blir fylt med media (Figur 3C). Det er også mulig å anvende fenolrødt ved injeksjon, noe som vil gjøre det lettere visualiseringen. På grunn av størrelsen av C. albicans gjærceller (3-4 um), blir inokulum dose begrenset til konsentrasjoner under 5 x 10 7 cfu / ml på grunn av tilstopping av mikro-nål. Dette tillater injeksjon av mellom en og 250 gjærceller innenfor en 5 nl bolus. I våre hender, injisere fire nl på 1-1,5 x 10 7 cfu / ml ga de mest konsistente resultater. Dette resulterte i et område på 10 til 50 gjærceller per fisk. Innsnevring inokulumet til 15-25 gjærceller (Figur 3B) gir en strammere fenotype og respons. Ved hjelp av disse forhold, omtrent 50% av de injiserte fisk har riktig inokulum serie med over 95% overlevelse 24 timer etter injeksjon (data ikke vist). Det er også mulig å holde fisk med et lavere / høyere inokulum for å undersøke effekten av patogen byrde påsykdomsutvikling.

Den swimbladder er omtrent 100 nl totalvolum (400 x 200 x 200 mikrometer, L x H x B, ved hjelp av formelen for volumet av en ellipsoide) slik at injeksjon av større volumer er også mulig (inntil tre pulser av 4 nl har vært anvendt uten noen vesentlig effekt på overlevelse av fisk; data ikke vist).

Langsgående intra avbildning av enkeltfisk til å følge både vert og patogen oppførsel

Oppførselen til både verts og patogen kan følges ikke-invasiv måte i flere dager ved hjelp av denne modellen. Evnen til å avbilde utvikling av infeksjon med høy oppløsning in vivo kan, og har blitt brukt til å undersøke patogenesen av candidiasis i slimhinner. Nøytrofile spille en nøkkelrolle i motstand mot candidainfeksjon hos mus og mennesker 35-38. Ved hjelp av MPO: GFP sebrafisk 39 (nøytrofile uttrykke grønt fluorescerende protein), og C. albicans uttrykker dTomato rød fluorescerende protein 32, har vi observert neutrophil- Candida dynamikk i løpet av tidlig infeksjon (figur 4).

Nøytrofile er den første medfødt celletype å bli rekruttert til stedet av slimhinneinfeksjon, og infeksjon i swimbladder med levende C. albicans fører til en rask og kontinuerlig rekruttering av nøytrofiler (figur 4A, B). Interessant, neutrofiler ikke vesentlig rekruttert til swimbladder når varmedrepte gjærceller ble injisert (figur 4A, B).

Filamenter utvikler seg raskt etter injeksjon av gjærceller og C. albicans fortsetter å spire etter den første 48 timer etter injeksjon (hpi). Imidlertid, etter dette punkt er antall filamenter avtar (figur 4D), og andelen av gjær øker (ikke vist). Muligheten til å følge enkeltfisk non-invasiv gjør at disse longitudinelle studier (24-brønns platevevskulturskåler) og fremhever de individuelle forskjeller i sykdomsutvikling og vertsresponser (Figur 4C). Slike detaljerte studier opplisting sopp og immunceller på stedet av infeksjon over flere dager forbli upraktisk i musen.

En rask swimbladder disseksjon teknikk for å forbedre bilde

Imaging samspillet av immun eller epitelceller med C. albicans er relativt lett i modellen presenteres her. Men i visse tilfeller nærvær av luftboblen og tykkelsen av vevet som omgir swimbladder, hud og muskler, kompromitterer detaljert romlig oppløsning. For å forbedre bildekvaliteten vi har utviklet en metode for å dissekere swimbladder ut av sebrafisk og bilde det raskt (innen 10 min) ved konfokalmikroskopi (figur 5A). Dette er spesielt nyttig når avbildning transgene fisk linjer der fluorescens er ubikvitært uttryktog det er overflødig fluorescens i den omgivende vev, så som NF-kB: GFP 40 eller α-catenin: citrin linjer 41,42 (figur 5B, C). Teknikken krever fingerferdighet og praksis å utføre hurtig, men det er mulig å fullstendig bilde 95% av all fisken forsøkt.

Figur 1
Figur 1: Micro-nål form for swimbladder injeksjon. (A) Oversikt over mikro-nål form og måling. (B) forstørrelse av mikro nålespissen fra A. Hver store vertikale linje i B er 0,2 mm fra hverandre.

Figur 2
Figur 2: Imaging lysbilde. En 2% LMA dråpe er plassert i midten av fire prikker av vakuumfett, 1 cm fra hverandre på en glass-slide. Den dissected swimbladder er plassert i midten av LMA og et dekkglass senkes på toppen helt til den får kontakt med LMA og vakuumfett.

Figur 3
Figur 3: Injeksjon av C. albicans i swimbladder forblir lokalisert til injeksjonsstedet. (A) Skjematisk fremstilling av orienteringen og posisjonen av mikro-nål til å injisere C. albicans på baksiden av den swimbladder i 4 dpf sebrafisk larver. (B) Representative inokulum etter seleksjon for injeksjon bolus på 15-25 gjærceller med epifluorescens mikros for tre forskjellige grupper av fisk. Midlere og standard feil av gjennomsnittet er representert, n = 17, 17, og 20 for gruppene A, B og C henholdsvis. (C) Representative bilder av C. albicans (CaF2-dTom, rød fluorescens uttrykker Candida) infeksjon i AB juvenile sebrafisk umiddelbart etter injeDette skjer. Bilder ble kjøpt med 10x og 20x mål (venstre og høyre paneler, henholdsvis) og er sammensetninger av maksimums anslagene i den røde kanalen (12 og 19 skiver, henholdsvis) med et enkelt stykke i DIC kanal. Omrisset av luftboble (gul) og epitelbelegg (hvit) er representert på venstre panel. Skala barer representerer 250 og 50 mikrometer, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Swimbladder injeksjon gir rom-tid-disseksjon av verts patogen dynamikk. (A) Representative bilder av MPO: GFP fisk linje injisert med levende eller varme drept (HK) CaF2-dTom i swimbladder ved 4 dpf og avbildes 48 HPI. Bilder er sammensetninger av maksimal projeksjon på den grønne ennd røde kanaler (20 stykker) og et enkelt stykke i DIC kanal. Skala søylene representerer 100 um. (B, C). Vert respons på C. albicans infeksjon. Nøytrofile rekrutteres til stedet for infeksjon (SOI) så tidlig som 6 HPI og holder på å øke i antall i løpet av 48 timer. Muligheten til bilde og holde enkeltfisk separert (24-brønns plate) tillater detaljerte immun dynamikk å bli visualisert. (D) Patogen respons. C. albicans gjærceller er spirende for første 24 HPI, men gå tilbake til gjærceller fra 24 HPI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Dissection av swimbladder gir finere detaljer som skal avbildes. (A) Skjematisk representasjon av than steg involvert i disseksjon av swimbladder i 4-5 dpf sebrafisk. Blå piler indikerer retningen av å trekke med pinsett (L for venstre og R for Høyre). (B, C). Representative bilder av dissekerte swimbladder fra α-catenin: Citrin fisk linje 41,42 (grønne trange veikryss) injisert ved 4 dpf med C. albicans (CaF2-dTom) og avbildes ved konfokalmikroskopi 2 HPI. Paneler er kompositter med maks anslagene i de røde og grønne kanaler (25 skiver for B og 3 skiver for C) og et enkelt stykke for DIC i panel B. Scale barer 100 mikrometer i B og 100 mikrometer og 10 mikrometer i C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Volum (nl) 1 2 3 4 5
Diameter (mm) 0,124 0,156 0,179 0,197 0,212

Tabell 1: Bolus volum til diameter forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremskritt og begrensninger av swimbladder mikroinjeksjon sykdomsmodell

Modellen som presenteres her er en forlengelse av candidiasis i slimhinner nedsenking modellen beskrevet i Gratacap et al (2013).; det gir fordelene ved en kontrollert infeksjon tid, en meget reproduserbar infeksjonsdose, og derfor forbedret effektivitet. Vi viser her nye metoder som tillater ikke-invasiv temp dokumentasjon av infeksjonsdynamikk i stor detalj samt høyere oppløsning ex vivo avbildning av swimbladder. Disse prosedyrene bør legge til rette studiet av C. albicans -innate immunsystemet interaksjons dynamikk på slimhinnen. Et begrenset antall slimhinneinfeksjon modeller har blitt beskrevet i sebrafisk, alle begrenset til fordøyelseskanalen forstyrrelse / infeksjoner 24,43. Den swimbladder modell presenteres her strekker områder av smitte til et organ som deler noen likheter til lungene, og tilbyr et begrenset områdefor infeksjon, med mindre mulighet for patogenet for å bli vasket bort.

Det er flere viktige faktorer som må tas i betraktning når mestre disse teknikkene. Det viktigste punktet er kravet for en oppblåst swimbladder. Dette krever at fisken være i alderen til 5 dpf når fostret ved 28 ° C eller 4 dpf ved 33 ° C. Denne høyere temperatur brukes for å akselerere utviklingen av fisk og bedre tilnærme fysiologiske området av pattedyr-epiteliale temperaturer (musehud temperaturen er 33,1 ° C 44). Imidlertid må begrensning av denne modellen til denne spesielle temperaturområde for å holdes i bakhodet og observerte fenotyper bør verifiseres i en pattedyr system for mer komplett tolkning. Injeksjonsstedet (bakre swimbladder) er også kritisk, som den pneumatiske ductus er åpen i physostomous fisk (som inkluderer sebrafisk) og høytrykks injEL andre steder i orgelet kan presse patogenet forbi swimbladder og inn i fordøyelseskanalen. Kvantifisering av inokulum er også mindre nøyaktig hvis gjærcellene er ikke alle på baksiden av swimbladder, fordi tykkelsen av fisken i bagasjerommet gjør det vanskelig å visualisere begge sider av swimbladder. Disseksjon av swimbladder krever fingerferdighet og bildebehandling må finne sted umiddelbart etter å unngå gjenstander på grunn av fysiske traumer av prosedyren.

Begrensningene av teknikken er i hovedsak knyttet til utviklingsstadiet av fisken. Dette begrenser bruken av morpholino teknologi til et par dager med studier, og knockdown effekt må være nøye testet for å diskriminere mellom full eller delvis effekt. Morfolino- aktivitet dette sent i utviklingen har tidligere blitt rapportert, og vi har også med hell brukes morpholinos i denne modellen, med validert spleise-blokkering som fremdeles var effektiv på 5 dpf. Bruken av pharmacological medikamenter kan være et godt alternativ i denne modellen så er det ingen begrensning for en alder av fisken. Bruken av fisk forbi 72 timer etter befruktning noen ganger krever mer tilsyn enn å jobbe med larvesebrafisk, avhengig av institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer. Lengden av studien er også begrenset, som sebrafisk ikke overlever ved høye priser for mer enn 10 dager i statiske laboratorieforhold 45. På den annen side, ved hjelp av juvenil fisk av 5 dpf utvikling i stedet for yngre embryoer eller larver muliggjør undersøkelser hvor alle organer som nyrer, lever og bukspyttkjertel er fullt ut funksjonell 46-49. Sammenlignet med in vitro cellekultur og in vivo murine modeller, antall reagenser tilgjengelig (antistoffer og kjemiske antagonister-agonister) er begrenset i sebrafisk; Imidlertid er muligheten for å tilsette kjemikalier direkte til mediet en fordel. Antallet knockout og knock-in sebrafisk er fortsatt begrenset, men rise målrettet genom redigering åpner spennende muligheter for generering av mutanter. Kombinasjonen av relativt enkelt å konstruere fluorescerende reporter linjer (celletype-spesifikke eller signalveien spesifikke) med gjennomsiktigheten av juvenile sebrafisk er fortsatt en av de viktigste og unike fordeler av dette systemet.

Ser frem

Sebrafisk swimbladder infeksjonsmodell utvider utvalget av spørsmål som kan bli spurt om host-patogen interaksjoner ved virveldyr mucosal epitel, og tilbyr en ny rute for infeksjon for andre patogener som invadere gjennom epitel og fremhever nytten av dette organ for sondering virveldyr sykdom .

Sebrafisk modeller av epitel infeksjon på slimhinnene nivå har blitt publisert som sondere effekten av tarmkanalen forstyrrelse av narkotika eller patogen 24,43. Imidlertid er den første til å utnytte swimb denne candidiasis i slimhinner modellstige og dermed utvider utvalget av steder av infeksjon som kan undersøkes i sebrafisk utover fordøyelseskanalen. Forskjeller mellom swimbladder slimhinnen og pattedyr lunger er ikke helt klarlagt og tolkning / oversettelse av data fra denne modellen til høyere virveldyr bør gjøres med forsiktighet.

Den swimbladder infeksjon fyller en nåværende gap i virveldyr smittemodeller og åpner opp et vindu for å avbilde interaksjoner av medfødte immun / epitelceller med et patogen. Nå et mangfoldig utvalg av spørsmål, tidligere off-limits, er mulig å utforske. Vi kan bestemme de forskjellige interaksjoner av medfødte immunceller med hverandre og med epitelceller, deres rom-tid-rekruttering og arten av C. albicans proliferasjon og morfologisk svitsjing i forhold til immunangrep og sykdomsutvikling i en ikke-immunoundertrykket vert. Muligheten for å avbilde et intakt verts i flere timer til dager i grei detalj representerer en åpenbar og stor fordel med dette systemet.

Til slutt, de ontologiske og genekspresjon likheter mellom swimbladder og pattedyr lunge foreslår videre at målretting dette organet med genet knockdown eller kjemiske stoffer kan avsløre konserverte mekanismer for mikrobiell-lunge samhandling og immunologi 50-52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Le Trinh og Dr. Tobin for sjenerøst gi α-catenin: Citrin fisk linje og Bill Jackman for å tillate oss å gjøre filmingen i laboratoriet hans. Forfatterne erkjenner finansieringskilder National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 og R15AI094406) og USDA (Prosjekt # ME0-H-1-00517-13). Manuskriptet er publisert som hoved Landbruk og skogbruk Experiment Station publikasjon nummer 3371.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml tubes Axygen MCT-175-C
Deep Petri dishes Fisher Scientific 89107-632
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) Fine Science Tools 11251-30
Wooden dowels VWR Scientific 10805-018
Low melt agarose VWR Scientific 12001-722
Flaming Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate capillary Sutter Instruments BF120-69-10
MPPI-3 injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting microscope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
20X microscope objective Olympus UPlanSApo 20x/0.75
Roller drum New Brunswick Scientific TC-7
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Glass culture tubes (16 x 150 mm) VWR Scientific 60825-435
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
HEPES (Corning) VWR Scientific BDH4520-500GP
Children clay (Play-Doh) Hasbro
CaCl2 Fisher Scientific C69-500
Methylene blue VWR Scientific VW6276-0
PTU Sigma P7629-10G
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712
Hemocytometer (Hausser scientific) VWR Scientific 15170-172
Type A immersion oil Blue Marble Products 51935
Centrifuge Eppendorf 5424
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
Agarose (Lonza) VWR Scientific 12001-870
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Fishing wire Stren
96 well imaging plate (Sensoplate) Greiner Bio-One 655892
High vacuum grease (Dow Corning) VWR Scientific 59344-055
Microslide (25 x 75 mm) VWR Scientific 48300-025
Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 VWR Scientific 48366-045
15 cm Petri dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 32-106
Glycerol (EMD chemicals) VWR Scientific EMGX0185-5
24-well culture dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 25-107
Weight boats (8.9 cm) VWR Scientific 89106-766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Tags

Immunologi Sebrafisk candidiasis i slimhinner slimhinneinfeksjon epitelial barriere epitelceller medfødt immunitet swimbladder,
Modellering candidiasis i slimhinner i Larvesebrafisk av Swimbladder Injection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C.,… More

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection. J. Vis. Exp. (93), e52182, doi:10.3791/52182 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter