Abstract
В начале защита от слизистой оболочки патогенных микроорганизмов состоит как из эпителиальной барьера и врожденных иммунных клеток. Immunocompetency обоих, и их взаимосвязь, имеют первостепенное значение для защиты от инфекций. Взаимодействия эпителиальных и врожденных иммунных клеток с патогеном лучше всего исследованы в естественных условиях, где сложное поведение разворачивается во времени и пространстве. Тем не менее, существующие модели не позволяют легко пространственно-временной визуализации битве с патогенами на уровне слизистой оболочки.
Модель, разработанная здесь создает слизистой инфекции путем прямой инъекции грибкового возбудителя, Candida Albicans, в плавательного пузыря несовершеннолетних рыбок данио. В результате инфекции позволяет с высоким разрешением изображений эпителиальной и врожденного поведения иммунных клеток в течение развития заболевания слизистой оболочки. Универсальность этого метода позволяет на допрос хозяина, чтобы исследовать подробно последовательность иммунных событий, ведущих к телagocyte набор и изучить роль отдельных типов клеток и молекулярных путей в защите. Кроме того, поведение патогена в зависимости от иммунной атаки могут быть отображены одновременно с помощью флуоресцентного белка, экспрессирующих С Albicans. Увеличение пространственного разрешения взаимодействия хозяин-патоген также возможно с помощью описанной метод быстрого плавательный пузырь рассечение.
Слизистой инфекция модель, описанная здесь, проста и легко воспроизводимым, что делает его ценным инструментом для изучения слизистой кандидоза. Эта система может быть также широко переводимые в другие слизистые патогенов, таких как микобактерий, бактериальных или вирусных микробов, которые обычно инфицируют через эпителиальные поверхности.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы и эксперименты данио помощи были выполнены в соответствии с NIH руководящих принципов по Уходу за животными и использованию комитета (IACUC) Протокол A2012-11-03.
1. Данио рерио Разведение до 4 дней после оплодотворения
- Сбор AB данио, или любые другие трансгенных линий, в течение первых 3 ч после оплодотворения, как показано в другом видео 34.
- Инкубируют 120 яиц в 15 см чашки Петри, содержащие 150 мл E3 средств массовой информации (5 мМ NaCl; 0,17 мМ KCl; 0,33 мМ CaCl 2; 0,33 мМ MgCl 2, 2 мМ HEPES; рН 6,8) с метиленовым синим (0,3 мкг / мл конечная Концентрация) в 33 ° C инкубаторе с 12/12 свет / темнота фотопериода.
- Заменить СМИ после 6 ч с E3 + ПТУ (1-фенил-2-тиомочевины, 10 мкг / мл конечной концентрации) и удалить мертвые яйца.
- Выдержите в течение 4 дней при 33 ° С, обмениваясь СМИ со свежими E3 + ПТУ после 2 дней.
2. Впроекция Micro-иглы Подготовка
- Потяните боросиликатного капилляра (OD 1,2 мм; ID 0,69 мм) в микро-иглы с помощью иглы съемник со следующими параметрами (550 тепла; 0 Потяните; 130 скорость; 110 раз).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут отличаться в зависимости от нити к нити накала, чтобы получить подобную форму микро-иглы (рисунок 1) и должны быть скорректированы, когда установлен новый накаливания. - Заполните микро-иглы с 3 мкл 0,4 мкм фильтруется фосфатного буфера солевым раствором (PBS; 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4) с использованием 20 мкл пипетки microloader Подсказка.
- Настройка микро-иглы на держателе микропипетки на микроманипулятора подключена к системе впрыска под давлением. Установите давление впрыска до 30 МПа, а продолжительность импульса на 30 мс.
- Использование чашку Петри с дистиллированной водой, снизить микро-иглы до 1/5 иглы не находится в воде. Клип микро-иглы Wiго мелкие пинцет чуть ниже уровня воды. Принесите микро-иглы из воды и нажмите педаль несколько раз, пока не появится болюса.
- Измерьте диаметр болюса путем снижения микро-иглы на гемоцитометра слоистой одной каплей типа погружения масла. Регулировка длительности импульса для получения нужного объема (таблица 1).
- Установка противодавление на болюса оставаться стабильными в масле (понизить давление если увеличивает объем болюса и увеличить противодавление, если объем болюса уменьшение). Запишите длительность импульса для каждого микро-иглы.
- Снимите PBS с микро-иглы путем аспирации его с помощью пипетки microloader и изгнать левой над PBS, поместив его на форсунки и листать непрерывный переключатель импульса. Забронируйте каждый микро-иглы.
3. Candida Подготовка
- Подряд Candida Albicans превращается с кодон-оптимизированный dTomato, GFP, BFP, EOS или далекоКрасный из замороженного запаса (-80 ° С запас в 25% глицерин) с помощью стерильного деревянный дюбель на дрожжи peptine декстрозы (YPD) агаром (10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л декстрозы , 20 г / л агара, в автоклаве и выливают в 25 мл в чашки Петри) и инкубируют в течение ночи при 30 ° С.
- Выбор одной колонии с помощью стерильной деревянный дюбель и инокуляции до 5 мл YPD жидкости (10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л декстрозы, в автоклаве и асептически аликвоты в 5 мл в 16 х 150 мм стекл культуры трубы).
- Инкубируют в течение ночи при 30 ° С в валец при 60 оборотах в минуту.
- Соберите 1 мл C. Albicans культура и передачи в 1,7 мл стерильную центрифужную пробирку.
- Центрифуга на 5000 мкг в течение нескольких секунд. Слейте супернатант и добавить 1 мл стерильной PBS, вихря тщательно. Повторите это дважды.
- Граф колоний, используя гемоцитометра путем разбавления 1 мл бульона 1: 1000 в стерильной PBS.
4. инъекционных данио рерио вПлавательный пузырь
- Теплый инъекций блюдо (2% агарозном) в течение 30 мин в 33 ° C инкубаторе.
- В нужное время, удалить 100 из 150 мл E3 + ПТУ из 15 см чашки Петри, содержащую рыб, чтобы ввести с помощью 25 мл пипетки без аспирации любой данио.
- Обезболить 4 DPF рыбок данио, добавив 2 мл 4 мг / мл Буферизованные Tricaine метансульфоната складе (TR) к 50 мл среды остальные (конечная концентрация 200 мкг / мл) и подождите в течение 15 мин.
- Под микроскопом рассекает, выберите рыбу с завышенной плавательного пузыря. Рыба также может быть показан на то время для однородной фенотипа, таких как распределение нейтрофилов в МРО: GFP линии с помощью эпифлуоресцентной рассекает микроскопа.
- Развести С Albicans складе от своей первоначальной концентрации (шаг 3,8) до 1,5 × 10 7 колониеобразующих единиц на мл (КОЕ / мл) в PBS.
- Трансфер 30 данио на инжекторный чашки с помощью пластиковых передачи трубыTTE и удалить излишки средства массовой информации.
- Использование рыболовные проволоки инструмент (0,012 дюйма диаметр лески супер-склеиваются в боросиликатного капилляра), сделайте 3 линии 10 рыб, удерживая впрыска блюдо вертикально и ориентироваться рыбу вертикально.
- Удалить излишки средств массовой информации.
- Тщательно вихрь трубки с 1,5 х 10 7 КОЕ / мл C. Albicans.
- Наполните одну микро-иглы с 3 мкл C. Albicans, используя новый наконечник microloader пипетки и установить длительность импульса на соответствующую настройку (см шаг 2,9).
- Поверните инъекции блюдо, чтобы сделать угол 20 ° между микро-иглы и головы рыбы, стремясь к задней части плавательного пузыря (рис 3а).
- Нажмите микро-иглы в плавательного пузыря, убедившись, что отверстие иглы в просвете, и нажмите на педаль.
- Повторите для каждой рыбы и передать в послеоперационную блюдо (25 мл E3 + ПТУ) от наводнения блюдо с E3 вd опорожнения в аварийный блюдо.
- Перевести еще 30 рыбу впрыска блюдо.
- Повторите инъекции с новой микро-иглы, наполненный тщательно перемешивали C. Albicans.
- Отделка путем введения контроля PBS, в случае необходимости, с использованием другого инъекции тарелку, чтобы избежать загрязнения и передачи в отдельную посуду восстановления (этап 4.10).
5. Скрининг Рыба для Желаемые инокулята
- Подготовка 40 мл 0,4% низкой расплава раствор агарозы (LMA), добавив 160 мг низкой расплава агарозы в 40 мл Е3, кипения от микроволновой печи до полного растворения и охлаждения до 37 ° С. Добавить 400 мкл TR (конечная концентрация 200 мкг / мл) один раз охлажденным.
- После 30 мин восстановления, анестезию рыб, как описано (шаг 4,3 с использованием только 1 мл TR в 25 мл Е3 + ПТУ, конечная концентрация 200 мкг / мл).
- Передача 30 рыба (с минимальным СМИ, как это возможно) до 2 мл LMA в весовой лодке.
- Отберите индивидуальный рыба с пипетки и пластины рыбы с 1 капли LMA в визуализации 96-луночного планшета, используя только центральные скважин 10 х 6.
- Повторите, пока все рыбы на экран не будут загружены в изображений пластины.
- Пусть носитель затвердевают при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Расположите рыбу на их стороне, убедившись, что они находятся в контакте с прозрачным дном.
- Использование цели 20X на перевернутом эпифлуоресцентной / конфокальной микроскопии и соответствующий фильтр, запишите номер С. альбиканс дрожжевые клетки в плавательного пузыря каждой рыбы-х годов.
- Выбор рыбы с 15-25 дрожжевых клеток в плавательного пузыря (или желаемого посевной материал), эвтаназии невыбранные рыбы (800 мкг / мл TR в Е3) и возврата выбранный рыбу глубокой чашке Петри с 50 мл Е3 + ПТУ по добавив 3 капли E3 на изображения плит выбранных скважин и отсасывание рыбу с пластиковой пипетки.
- Инкубировать при 33 ° С в течение требуемой продолжительности.
6. Визуализация Рыба Post-скрининг
- В нужное время, удалить 25 из 50 мл E3 + ПТУ СМИ из глубокой чашке Петри, содержащую рыб к изображению.
- Анестезировать рыбу, как описано (шаг 4,3 с использованием только 1 мл TR в 25 мл Е3 + ПТУ остальные, конечная концентрация 200 мкг / мл).
- Пластина рыбу в 96-луночного планшета изображений и положения соответствующим образом (шаги 5,3 - 5,7).
- Изображение на сканирующей конфокальной микроскопии, используя соответствующие лазеры и фильтры выбросов. Сначала сфокусируйтесь на рыбу, используя цели 4X под дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и получать изображения интересующей области, используя цели 20X с конфокальной лазеров в режиме сканирования с 2 скорости мкс / пиксель и 1024 х 600 пикселей соотношением. Приобретать Z-стеки с размером шага 1 мкм, применяя режим фильтра Калмана из 3 кадров.
- Вернуться в глубокое блюдо Петри с 50 мл Е3 + ПТУ или в individuaл скважины (блюдо культуры 24-а, 3 мл E3 + ПТУ) и инкубировать при 33 ° C.
7. Пройдя плавательного пузыря
- Заполните 10 мл шприц с высокой вакуумной смазки.
- Приготовьте 2% LMA (шаг 5,3 с 160 мг низкой температурой плавления агарозы в 8 мл E3).
- В нужное время, анестезию рыбу (шаг 5,2).
- Передача 10 рыб в 1,7 мл центрифужную пробирку с 1 мл Е3 и эвтаназии путем добавления 200 мкл 4 мг / мл Tricaine (конечная концентрация 800 мкг / мл) в центрифужную пробирку и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Подготовка предметное стекло визуализации путем размещения 4 капли вакуумной смазки в квадрат, 1 см друг от друга на microslide (75 х 25 мм, на рисунке 2).
- Поместите 2 капли 2% LMA в центре площади.
- Поместите одну рыбу на отдельном стекле под микроскопом рассекает и убедитесь, что сердце перестало биться, удалить лишнюю воду.
- Возьмите плавательный пузырь пневматическим канала с левой пинцетом, отделяя его от желудочно-кишечного тракта, и поместите его в центре 2% LMA, прежде чем он затвердевает.
- Место крышку скольжения (18 х 18 мм) на верхней части изображения стекло и вставьте его, пока он не коснется вакуумной смазки, а также LMA (рисунок 2).
- Изображение течение 10 мин вскрытия, как описано в стадии 6,4. Повторите шаг 7,7 - 7,11 с другой рыбой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроинъекция в задней плавательного пузыря
Экспериментальный метод, представленный здесь описывает введение постоянной дозы С. альбиканс дрожжевые клетки в плавательного пузыря из 4 DPF рыбок данио. Предыдущая работа с моделью погружения предполагает, что плавательный пузырь иммунный ответ на С. Albicans аналогична млекопитающих кандидоза слизистой оболочки 32. Здесь мы показываем, модифицированный метод инфекция, которая более проста, воспроизводимым и быстрым; несколько сотен данио могут быть введены и просеивают в течение нескольких часов.
Точным и воспроизводимым инфекции плавательного пузыря осуществляется путем воздействия на заднюю область органа путем микроинъекции. Инъекция в плавательного пузыря легче учиться, чем в большинстве других микроинъекции маршрутов для личинок или эмбриональной рыбок данио (например, внутривенное или задний мозг желудочка). Приготовление рыбы перед инъекцией является СимиLAR в том, что для других местах инъекций, с тем исключением, что плавательный пузырь должен быть завышены, так что рыба старше. Приблизительно 75% из рыбы, поднятыми на 33 ° С имеют завышенные плавательный пузырь по 4 денье (данные не показаны). Плавательный пузырь расположен под эпидермальным, а также тонкой мышечный слой и микро-иглы, используемой для инъекций рыбу нужно скошенный. Угол, под которым рыба вводят (3А) и значительно повышает скорость и простоту процедуры. Инъекция болюса в задней части плавательного пузыря является важным, так как позволяет визуализировать все дрожжевые клетки при скрининговых и избежать присутствия дрожжевых клеток на каждой стороне плавательного пузыря, который будет искажать диапазон выбора. Инъекционное к задней части плавательного пузыря и предотвращает возможную потерю инокулята через пневматического канала, а затем вниз по желудочно-кишечного тракта. Проверка которых рыба была введена сравнительно легко, как болюс вытесняет пузырек воздуха, иЗадняя часть плавательного пузыря впоследствии наполнена сред (рис 3C). Кроме того, можно использовать фенол красный при введении, которое сделает визуализации проще. Из-за размера C. Albicans дрожжевые клетки (3 - 4 мкм), доза инокулята ограничивается концентрациях ниже 5 х 10 7 КОЕ / мл вследствие засорения микро-иглы. Это позволяет инъекции от одного до 250 дрожжевых клеток в пределах 5 нл болюса. В наших руках, потребители инъекционных 4 NL на 1-1,5 х 10 7 КОЕ / мл дал наиболее достоверные результаты. В результате в диапазоне 10-50 дрожжевых клеток на рыб. Сужение посевной 15-25 дрожжевых клеток (рис 3B) дает более плотную фенотип и ответ. Использование этих условиях, примерно на 50% из рыбы, инъецированных имеют соответствующий диапазон посевной с более чем 95% выживаемости 24 ч после инъекции (данные не показаны). Кроме того, можно сохранить рыбу с ниже / выше инокулята для того, чтобы исследовать эффект нагрузки на патогенаразвитие болезни.
Плавательный пузырь примерно 100 нл Общий объем (400 х 200 х 200 мкм, L х В х Ш, используя формулу для объема эллипсоида), так инъекции больших объемах также возможно (до 3 импульсов 4 NL были использоваться без какого-либо значительного эффекта на выживаемость рыбы; данные не представлены).
Продольный прижизненной визуализации отдельных рыб следовать хозяина и поведение патогенных микроорганизмов
Поведение хозяина и патогена может следовать неинвазивного в течение нескольких дней, используя эту модель. Способность изображение развитие инфекции с высоким разрешением в естественных условиях может и была использована для изучения патогенеза слизистой кандидоза. Нейтрофилы играют ключевую роль в сопротивлении кандидоза у мышей и людей 35-38. Использование МПО: GFP рыбок данио 39 (нейтрофилы выразить зеленый флуоресцентного белка), и С. Albicans выражения dTomато красного флуоресцентного белка 32, мы наблюдали neutrophil- динамику Candida в начале инфекции (рисунок 4).
Нейтрофилы первый тип клеток врожденной быть набраны в месте инфекции слизистой оболочки, а также инфекции плавательного пузыря с живой С Albicans приводит к быстрому и непрерывного набора нейтрофилов (рис 4а, б). Интересно, что нейтрофилы не существенно на работу в плавательного пузыря, когда убитых нагреванием клеток дрожжей вводили (4А, В).
Нити быстро развиваться после инъекции клеток дрожжей и С. Albicans продолжает прорастать в течение первых 48 ч после инъекции (ИНН). Тем не менее, после этого момента количество нитей уменьшается (рис 4D) и пропорционально увеличивается дрожжевых (не показан). Способность следовать отдельных рыб неинвазивного позволяет этим продольные исследования (24-луночный планшеткультуры тканей блюда) и подчеркивает индивидуальные различия в прогрессировании заболевания и ответов хозяевах (рис 4в). Такие детальные исследования перечисляя грибковых и иммунные клетки в месте инфекции в течение нескольких дней остаются непрактичным мыши.
Быстрым методом плавательный пузырь рассечение для улучшения изображений
Визуализация взаимодействия иммунных или эпителиальных клеток с С. Albicans относительно легко в модели, представленной здесь. Тем не менее, в некоторых случаях, наличие воздушного пузырька, а толщина ткани, окружающей плавательного пузыря, кожи и мышц, ставит под угрозу подробную пространственное разрешение. Для улучшения качества изображения мы разработали метод препарировать плавательный пузырь из рыбок данио и изображения он быстро (в течение 10 мин) по конфокальной микроскопии (рис 5А). Это особенно полезно при визуализации трансгенных линий рыбы, где флуоресценции экспрессируется повсеместнои есть посторонние флуоресценции в окружающие ткани, такие как NF-kB: GFP 40 или α-катенин: цитрин линии 41,42 (фиг.5В, с). Техника требует ловкости и практика, чтобы быстро выполнить, но это возможно, чтобы полностью изображений 95% всей рыбы баллов.
Рисунок 1: Micro-иглы форма для инъекций плавательного пузыря. (А) Обзор формы микро-иглы и измерения. (Б) Увеличение наконечника микро-иглы с А. Каждый из основных вертикальной линии в В являются 0,2 мм друг от друга.
Рисунок 2: Визуализация слайд. 2% капли LMA находится в середине 4 точками вакуумной смазки, 1 см друг от друга на предметное стекло. ДиссеКТИД плавательный пузырь помещают в середине LMA и покровное стекло опускается сверху, пока он не войдет в контакт с LMA и вакуумной смазки.
Рисунок 3: Инъекция C. Albicans в плавательного пузыря остается локализованным в месте инъекции. (А) Схема ориентации и положении микро-иглы для введения C. Albicans в задней части плавательного пузыря в 4 денье данио личинок. (Б) представитель посевной после отбора болюсной инъекции 15-25 дрожжевых клеток на микроскопии эпифлуоресцентной 3 различных групп рыб. Среднее значение и стандартная ошибка среднего Представляется, N = 17, 17 и 20 для групп А, В и С соответственно. (C) Типичные изображения С Albicans (CaF2-dTom, красной флуоресценции выражения Candida) инфекции в АБ несовершеннолетних рыбок данио сразу после Инджеие. Изображения были получены с 10-кратным и 20-кратным целей (левой и правой панелями, соответственно) и композиты максимальных проекций в красном канале (12 и 19 ломтиками, соответственно) с одним кусочком в канале ДВС. План пузырька воздуха (желтый) и эпителиальной выстилки (белый) представлены на левой панели. Шкала бары представляют 250 и 50 мкм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Плавательный пузырь впрыска позволяет пространственно-временной вскрытия динамики хозяин возбудителя. () Типичные изображения MPO: GFP линии рыбы вводили живой или тепла погибли (HK) CaF2-dTom в плавательного пузыря в 4 денье и отображаемого 48 ИНН. Изображения композиты максимальной проекцией на Зеленыйой красные каналы (20 кусочков) и одного ломтика в канале ДВС. Scale столбцы представляют 100 мкм. (B, C). Принимающая ответ на С. Albicans инфекции. Нейтрофилы на работу в очаге инфекции (SOI), а уже в 6 ИНН и держать на повышение в ряде более 48 часов. Возможность изображения и сохранить отдельные рыбы, разделенные (24-луночный планшет) позволяет подробные иммунные динамика должны быть визуализированы. (D) Возбудитель ответа. С альбиканс дрожжевые клетки прорастающих за первые 24 HPI, но вернуться к дрожжевых клеток от 24 HPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Разбор плавательного пузыря позволяет более тонкие детали, чтобы образ. (А) Схематическое представление тон уйдет участие в вскрытии плавательного пузыря в 4-5 DPF рыбок данио. Синие стрелки указывают направление потянув с помощью пинцета (L для левого и П с правой стороны). (B, C). Характерные изображения расчлененного плавательного пузыря из α-катенина: цитрин лески 41,42 (зеленые плотные соединения) вводят на 4 денье с С. Albicans (CaF2-dTom) и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии 2 HPI. Панели составлены из максимальных проекций в красных и зеленых каналов (25 слайсы для B и 3 ломтика для C) и одного ломтика для ОПК в панель B. масштабные линейки 100 мкм в В и 100 мкм и 10 мкм в С. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
| Объем (NL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Диаметр (мм) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Таблица 1: Объем болюса диаметром отношений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Достижения и ограничения микроинъекции модели болезни плавательного пузыря
Модель, представленная здесь расширение слизистой кандидоза погружения модели, описанной в Gratacap и др (2013).; он добавляет преимущества управляемой времени инфекция, высоко воспроизводимую дозу инфекции, и, следовательно, повышение эффективности. Мы демонстрируем здесь новые методы, которые позволяют неинвазивного временной документации динамики заражения в мельчайших подробностях, а также с большим разрешением экс естественных изображений плавательного пузыря. Эти процедуры должны облегчить изучение языка C. Albicans -innate динамику иммунного взаимодействия системы в слизистой оболочке. Ограниченное количество слизистых моделей инфекции были описаны у рыбок данио, все ограничивается пищеварительного тракта помехи / инфекций 24,43. Плавательный пузырь представленная здесь модель расширяет очагов инфекции в органе, который разделяет некоторые сходства с легких и предлагает ограниченную сайтинфекции, с меньшим возможности для возбудителя быть смыты.
Есть несколько важных факторов, которые должны быть приняты во внимание при освоении этих технологий. Наиболее важным моментом является требование к завышенной плавательного пузыря. Это требует рыбу, чтобы быть в возрасте до 5 денье, когда выращенные при 28 ° С или 4 денье на 33 ° С Это более высокая температура используется для ускорения развития рыбной и лучше приблизить физиологические спектр млекопитающих эпителиальных температурах (температура кожи мыши 33.1 ° C 44). Тем не менее, ограничение этой модели на данном температурном диапазоне необходимо иметь в виду, и наблюдаемые фенотипы должны быть проверены в системе млекопитающих для более полного толкования. Место инъекции (задняя плавательного пузыря) также имеет важное значение, так как пневматическая канал остается открытым в physostomous рыбы (которая включает в себя данио) и инъекцию высокого давленияотражения в другом месте в органе может нажать патоген мимо плавательного пузыря и в желудочно-кишечном тракте. Количественное определение инокулята также менее точным, если дрожжевые клетки не все в задней части плавательного пузыря, так как толщина рыбы в стволе затрудняет визуализировать обе стороны плавательного пузыря. Вскрытие плавательного пузыря требуется ловкость и обработки изображений необходимо принимать сразу же после, чтобы избежать артефактов из-за физической травмы процедуры.
Ограничения метода в основном зависит от стадии развития рыбы. Это ограничивает применение технологии морфолино до нескольких дней исследования, и нокдаун эффективность должна быть тщательно проверены, чтобы различать полной или частичной эффективностью. Морфолино деятельность так поздно в развитии уже сообщалось ранее, и мы также успешно используется Morpholinos в этой модели, с подтвержденным сплайсинга блокировки, которая все еще эффективны при 5 DPF. Использование Pharmacological препараты могут быть хорошей альтернативой в данной модели, поскольку нет никаких ограничений на возраст рыбы. Использование рыбы мимо 72 ч после оплодотворения иногда требуется больше контроля, чем работать с личиночной рыбок данио, в зависимости от институциональных уходу и использованию животных комитетов. Продолжительность обучения также ограничено, так как данио не выживают при высоких скоростях для более чем 10 дней в статических лабораторных условиях 45. С другой стороны, с использованием молоди из 5 денье, а развитие молодых эмбрионов или личинок позволяет исследований, где все органы, такие как почки, печень или поджелудочная железа полностью функциональный 46-49. По сравнению с в пробирке культуре клеток или в естественных моделей мышей, количество реагентов, доступных (антитела и химические антагонисты-агонисты) ограничена в данио; Однако, возможность добавления химических веществ непосредственно в средствах массовой информации является преимуществом. Количество нокаутом и забивные рыбок данио прежнему ограничен, но RISе целевой редактирования генома открывает захватывающие возможности для генерации мутантов. Сочетание относительной легкостью построить флуоресцентные репортер линии (тип-специфический элемент или путь конкретных сигналов) с прозрачностью ювенильного данио остается одним из основных и уникальных преимуществ данной системы.
С нетерпением жду
Данио модель плавательного пузыря инфекция расширяет спектр вопросов, которые могут быть Отвечая на вопрос о хозяин-патоген взаимодействия в эпителии позвоночных слизистой оболочки, предлагая новый маршрут инфекции для других патогенов, которые вторгаются в через эпителий и подчеркивая полезность этого органа для исследования позвоночных заболеваний ,
Рыбок данио модели эпителиальной инфекции на уровне слизистой оболочки были опубликованы, проверяющие эффекты кишечного нарушения путей от наркотиков или патогена 24,43. Тем не менее, этот слизистой кандидоз модель является первым использовать swimbЛестница и, таким образом, расширяет спектр очагов инфекции, которые могут быть исследованы у рыбок данио за пределами желудочно-кишечного тракта. Различия между поверхностью плавательный пузырь слизистой оболочки и легких млекопитающих не выяснена и интерпретация / перевод данных из этой модели на высших позвоночных должно осуществляться осторожно.
Плавательный пузырь инфекция заполняет существующего пробела в позвоночных моделей инфекции и открывает окно для работы с изображениями взаимодействия врожденного иммунитета / эпителиальных клеток патогеном. Теперь разнообразный спектр вопросов, ранее закрыты, целесообразно исследовать. Мы можем определить взаимодействия различных клеток врожденной иммунной друг с другом и с эпителиальных клеток, их пространственно-временной набора, и природа С Распространение Albicans и морфологическое переключения по отношению к иммунной атаке и прогрессирования заболевания в не-ослабленным иммунитетом хозяина. Возможность изображения без изменений хост в течение нескольких часов до нескольких дней в GREв деталях представляет собой очевидную и главное преимущество этой системы.
Наконец, онтологические и генные сходство экспрессии между плавательного пузыря и легких млекопитающих позволяют предположить, что достижение этого органа с генной нокдаун или химических препаратов может выявить консервативные механизмы взаимодействия микробного легких и иммунологии 50-52.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Ле Трин и д-р Тобин щедро предоставляя α-катенин: линии цитрин рыбы и Билл Джекман за предоставленную нам возможность сделать съемку в своей лаборатории. Авторы признают, источники финансирования Национальные институты здоровья (гранты 5P20RR016463, 8P20GM103423 и R15AI094406) и USDA (Проект № ME0-H-1-00517-13). Эта рукопись опубликована в качестве основного сельского и лесного хозяйства эксперимента публикации Номер станции 3371.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
- Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
- Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
- Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
- Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
- Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
- Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
- Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
- Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
- Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
- Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
- Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
- Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
- Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
- Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
- Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
- Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
- Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
- Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
- Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
- Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
- Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
- Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
- Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
- Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
- Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
- Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
- Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).
