Introduction
T-cel receptor excisie cirkels (TRECS) en K verwijderen recombinatie excisie cirkels (KRECs) zijn kleine gecirculariseerde DNA-elementen die zijn uitgesneden in een verhouding van T- en B-cellen, respectievelijk, in een genomisch DNA recombinatie proces leidt tot de vorming van een zeer gediversifieerde repertoire van T- en B-celreceptoren. Zij hebben geen functie, maar omdat ze stabiel zijn en niet kunnen worden gerepliceerd, worden ze verdund na elke celdeling, waardoor aanhoudende slechts één van de twee dochtercellen. Daardoor kan het niveau in het perifere bloed worden aangenomen als een schatting van de thymus en beenmerg output.
Terwijl de TREC-test is grotendeels gebruikt in de afgelopen 15 jaar in de mate van thymus uitgang te evalueren, 1 de Krec assay, die aanvankelijk werd ontwikkeld om B-cel proliferatie en de bijdrage ervan aan de B-cel homeostase in gezondheid en ziekte, 2 meten is pas recent voorgesteld als een marker van bot marrow uitgang. 3,4 Hier beschrijven we de methode die we ontwikkeld voor de gelijktijdige kwantificering van zowel TRECS en KRECs. 4
Met deze gecombineerde methode wordt de variabiliteit geassocieerd DNA kwantificatie door real-time PCR geëlimineerd door het gebruik van een unieke standaardcurve verkregen door verdunning van een triple-insertie plasmide bevattende fragmenten van TRECS, KRECs en T-celreceptor alfa constante (TCRAC) gen in een 1: 1: 1 verhouding. Dit maakt een meer nauwkeurige evaluatie van de TREC en Krec copy number. Verder is de gelijktijdige kwantificering van de twee doelen in dezelfde reactie laat reagens kostenreductie.
De voorgestelde TREC / Krec test kan nuttig zijn om de omvang van T- en B-cellen neo-productie bij kinderen of volwassenen met ernstige gecombineerde immuundeficiëntie (SCID), 4 Hypogammaglobulinemie, 5 autoimmuunziekten, 6-8 en HIV-infectie meten Voorts. 9, kan het worden gebruikt ombewaken van het immuunsysteem herstel na hematopoietische stamceltransplantatie, 10 enzymvervanging, 11 en antivirale 9 of immunomodulerende therapieën. 6-8 slot omdat SCID patiënten worden opgenomen op basis van TREC test ondanks de onderliggende genetische defecten, en agammaglobulinemie patiënten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van Krec kwantificering De TREC / Krec test kan ook worden gebruikt om immuundeficiënties detecteren bij pasgeboren screeningprogramma's. 12 In dit geval moet de test worden uitgevoerd op DNA geëxtraheerd uit kleine bloedvlekken geblot en gedroogd op filterpapier, moeten zeer gevoelig en specifiek zijn voor deze ziekten, evenals zeer reproduceerbare en kosteneffectief.
De invoering van Krec kwantificering in de test prestaties van pasgeboren screening voor immuundeficiënties die routinematig werd uitgevoerd in sommige delen van de Verenigde Staten (WI, MA, CA) sinds 2008 verbeteren wanneer Wisconsin werd eerste Inleidinge de analyse van TRECS in haar postnatale screening programma. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Ethiek verklaring: Dit protocol volgt de richtlijnen van onze instelling, de Spedali Civili di Brescia
1. Voorbereiding van een "Triple-Insert" Plasmid
- Selectie en de opstelling van een passende uitgangsmateriaal:
- Het verkrijgen van een monster dat cellen zeer waarschijnlijk TRECS en KRECs detecteerbaar met PCR, zoals perifere bloed van een jonge gezonde onderwerp in EDTA-buizen.
NB: Oorspronkelijk hadden we de methode met behulp van thymocytes voor TRECS en mononucleaire cellen uit tonsillen fragmenten voor KRECs ontwikkeld, maar gezonde proefpersonen hebben meestal een bedrag van TRECS en KRECs voldoende om hun detectie door PCR mogelijk te maken. Daarom moet perifeer bloed een alternatief, gemakkelijker te verkrijgen en om mee te werken. Aangezien TRECS name afnemen met de leeftijd bij gezonde volwassenen, perifeer bloed van een jonge volwassene, zo niet uit kinderen wordt geadviseerd. - Aparte perifere bloed mononucLear cellen (PBMC) van een standaard dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze.
- Het verkrijgen van een monster dat cellen zeer waarschijnlijk TRECS en KRECs detecteerbaar met PCR, zoals perifere bloed van een jonge gezonde onderwerp in EDTA-buizen.
- DNA-extractie:
- Uittreksel DNA van PBMC met behulp van een commerciële DNA Blood Mini Kit. Volg de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen hieronder beschreven.
- Incubeer de monsters bij 70 ° C (in plaats van 56 ° C) gedurende 10 min met behulp van een shaker-incubator bij 1400 rpm.
- Voeg elutiebuffer verwarmd op 70 ° C naar de kolom, incubeer gedurende 5 min bij 70 ° C en elueer DNA door centrifugatie volgens instructies van de fabrikant. Bepaal het geëxtraheerde DNA-concentratie door spectrofotometrische schatting bij 260/280 nm.
- Uittreksel DNA van PBMC met behulp van een commerciële DNA Blood Mini Kit. Volg de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen hieronder beschreven.
- Voorbereiding van een plasmide dat de inserts van TREC en Krec signaal gewrichten (SJ) en TCRAC referentie-gen:
- Amplificeren het DNA uit PBMC geëxtraheerd met primers specifiek voor TRECS, KRECs en TCRAC (de TREC-SJ, Krec-SJ en TCRAC fragmenten verkrijgen) (zie tabel 1).
NB: Aan het 5'-uiteinde, de KREC- en TCRAC-specifieke primers bevatten HindIII en Spel restrictie sites (in kleine letters in de getoonde tabel 1 sequenties) met een geschikt aantal flankerende extra nucleotiden (cursief); beide functies zijn niet aanwezig in de canonieke Krec en TCRAC sequenties.
- Amplificeren het DNA uit PBMC geëxtraheerd met primers specifiek voor TRECS, KRECs en TCRAC (de TREC-SJ, Krec-SJ en TCRAC fragmenten verkrijgen) (zie tabel 1).
| TRECS | vooruit | 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 ' |
| omgekeerde | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 ' | |
| KRECs | vooruit | 5'-CCC aag CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 ' |
| omgekeerde | 5'-CCC aag CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 ' | |
| TCRAC | vooruit | 5'-G ac tag TAT GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 ' |
| omgekeerde | 5'-G ac tag TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 ' |
Tabel 1. Primers gebruikt voor de klonering procedures. Aan het 5'-einde in kleine letters getoond nucleotiden die overeenkomen met restrictie-enzymplaatsen, terwijl in cursief zijn weergegeven toegevoegd flankerende nucleotiden.
- Voer PCR reacties in een eindvolume van 25 pl, bestaande uit 1x Buffer II, 1,5 mM MgCl2, dNTP mix (200 pM elk), primers bij de uiteindelijke concentratie van 900 nM, AmpliTaq DNA polymerase (2,5 E / 25 ul), en 100 ng DNA.
- Gebruik de volgende PCR parameters: eerst bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 30 seconden; 60 ° C gedurende 30 seconden; 72 ° C gedurende 30 seconden, en uiteindelijk 1 cyclus van 72 ° C gedurende 10 min. PCR product lengten moet: 380 bp voor TRECS, 166 bp voor KREC's, 381 bp voor TCRAC.
- Plaats het PCR-product van TREC-SJ in de TA acceptor site van het pCR2.1-TOPO vector. Transformeer de nucleïnezuren in XL1-blauw chemisch competente cellen door hitte-shock volgens het protocol voorzien de cellen. Onder de kolonies die groeien als gevolg van ampicilline-resistentie, te identificeren die het dragen van de insert, die wit zal verschijnen vanwege verloren β-galactosidase complementatie en te enten ze in een grote schaal. Tenslotte identificeren van de kolonies die de TREC fragment door PCR.
- Vouw één van de geïdentificeerde kolonies en zuiveren plasmide-DNA met een plasmide miniprep kit en de instructies van de fabrikant. Digest het plasmide-DNA en het TCRAC geamplificeerde product met Spel restrictie-enzym en ligeren van de TCRAC fragment in de Spel restrictieplaats.
- Transformeer de nucleïnezuren in XL1-blauwe cellen en identificatie van de kolonies die de TCRAC fragment door PCR. Openen een van de geïdentificeerde koloniën en zuiverenhet plasmide-DNA met het plasmide miniprep kit.
- Digest het plasmide-DNA en het Krec geamplificeerde product met HindIII en kloon Krec SJ-fragment in de HindIII restrictieplaats. Transformeer de nucleïnezuren in XL1-blauwe cellen en identificatie van de kolonies die het derde fragment door PCR.
- Controleer, door direct sequencing, de aanwezigheid van de drie inzetstukken en de afwezigheid van mutaties. De kaart van de uiteindelijke triple-insertie plasmide is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1. Triple-insert plasmide kaart. Triple-insert plasmide kaart waarop de plaats van TREC, Krec, TCRAC sequenties en restrictie-enzym plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Vouw één van de geïdentificeerde kolonies, zuivert het plasmide-DNA met een plasmide Midiprep kit. Bepaal het plasmide DNA concentratie spectrofotometrische bepaling bij 260/280 nm en de DNA kwaliteit die door gelelektroforese. WINKEL geschikte hoeveelheden van het plasmide bij -80 ° C (bv., 50 pi elk).
2. Standaard Curve Voorbereiding
OPMERKING: Bereid alle verdunningen in 0.1x TE buffer in een plaats speciaal ontworpen voor inperking van de DNA-carry-over.
- Bereken de massa van het plasmide kopie-aantallen van belang (zie tabel 2), gezien het feit dat de plasmide grootte is 4846 bp en de gemiddelde massa per bp 1,096 x 10 -21 g / bp, en derhalve: m p = ( 4846 bp) x (1,096 x 10 -21 g / bp) = 5,311.216 x 10 -21 g = 5,311 x 10 -18 g.
| Exemplaar # | x 5,311 x 10 -18 g | Massa van plasmide-DNA (g) |
| 1 x 10 6 | 5,311 x 10 -12 |
| 1 x 10 5 | 5,311 x 10 -13 |
| 1 x 10 4 | 5,311 x 10 -14 |
| 1 x 10 3 | 5,311 x 10 -15 |
| 1 x 10 2 | 5,311 x 10 -16 |
Tabel 2. Massa van plasmide nodig voor elke standaard curve verdunning punt.
- Bereken de concentraties van plasmide-DNA door het verdelen van de benodigde plasmide massa door het volume (5 ui) wordt gepipetteerd in elk reactiemengsel (zie tabel 3).
| Massa van plasmide-DNA (g) | ÷ 5 pl | De eindconcentratie van plasmide-DNA (g / ul) |
| 5,311 x 10 -12 | 1.062 x 10 -12 | |
| 5,311 x 10 -13 | 1.062 x 10 -13 | |
| 5,311 x 10 -14 | 1.062 x 10 -14 | |
| 5,311 x 10 -15 | 1.062 x 10 -15 | |
| 5,311 x 10 -16 | 1.062 x 10 -16 |
Tabel 3. Berekening van plasmide concentraties nodig voor elke verdunning punt.
- Ontdooi een portie van de plasmide. Lineariseren 2 ug van het plasmide DNA met XhoI en bepaal de concentratie by spectrofotometrische schatting bij 260/280 nm.
- Bereid een juiste verdunning van het gelineariseerde plasmide-DNA om een geschikte werkvoorraadoplossing bereiken gaan van (bijvoorbeeld 100 ng / pl = 0,1 ug / ul = 1 x 10 -7 g / ul). Bewaar de rest van het gelineariseerde plasmide DNA bij -80 ° C.
- Voer een geschikte aantal van 1:10 of 1: 100 verdunningen van het plasmide in het meer werkbare concentratie van 1 x 10 -10 g / ul brengen.
- Gebruik de formule C 1 V 1 = C2 V2 het verdunningsvolume berekenen (V2 - V1) nodig eerste standaardcurve punt van de reeks bereiden (1 x 10 6 kopieën, corresponderend met 1,062 x 10 -12 g / 5 pl; zie Tabel 4).
| Eerste conc. (G / ul) | Plasmide DNA vol (pl) | Diluent vol (pl) | Final Vol. (Pl) | Eindconcentratie. (G / ul) | Definitieve aantal kopieën van plasmide DNA / 5 pl |
| C1 | V 1 | V 2 V-1 | V2 | C2 | |
| 1 x 10 -7 | 5 gl | 45 pi | 50 gl | 1 x 10 -8 | N / A |
| 1 x 10 -8 | 5 gl | 495 ul | 500 pi | 1 x 10 -10 | N / A |
| 1 x 10 -10 | 5 gl | 465 ul | 470 ul | 1.062 x 10 -12 | 1 x 10 6 |
| 1.062 x 10 -12 | 50 gl | 450 ul | 500 pi | 1.062 x 10 -13 | 1 x 10 5 |
| 1.062 x 10 -13 | 50 gl | 450 ul | 500 pi | 1.062 x 10 -14 | 1 x 10 4 |
| 1.062 x 10 -14 | 50 gl | 450 ul | 500 pi | 1.062 x 10 -15 | 1 x 10 3 |
| 1.062 x 10 -15 | 50 gl | 450 ul | 500 pi | 1.062 x 10- 16 | 1 x 10 2 |
Tabel 4. Verdunning berekeningen.
- Ga verder met een regelmatige reeks van 1:10 verdunningen van de resterende standaardcurve worden geselecteerd.
LET OP: Vergeet niet om elk plasmide verdunning kort vortex voordat u de volgende.
OPMERKING: De hoogste verdunning van het stAndard kromme (10 exemplaren / 5 ul) worden bereid net voordat de test, omdat een dergelijke kleine hoeveelheid plasmide DNA niet stabiel genoeg om te worden opgeslagen voor toekomstig gebruik. - Bewaar de triple-plasmide verdunning punten bij -80 ° C in afzonderlijke buizen tot gebruik. De verdunde triple-plasmide-DNA zeer stabiel gedurende tenminste 6 maanden.
3. DNA-extractie van Target Monsters
- Aparte PBMC van perifere bloed verzameld in EDTA-buisjes met behulp van de dichtheid gradiënt scheidingsmethode.
OPMERKING: U kunt ook gebruik maken van andere geschikte uitgangsmateriaal (bijv, gesorteerd lymfocytensubpopulaties, volbloed) als doelwit monster. - Pak het DNA van PBMC van target monsters zoals gerapporteerd in stap 1.2.
4. Real-time PCR voor het kwantificeren van TRECS en KRECs
- Plaat voorbereiding en laden:
- Schik een PCR-plaat met inbegrip van ten minste twee herhalingen voor elke monstersworden geanalyseerd: standaard curve (A → F 1 → 4), positieve controle (CTRL +; G1 → 4) en no-template controle (NTC; H 1 → 4).
OPMERKING: Neem een typische regeling in tabel 5, maar verschillende formaten kunnen worden gemaakt. Vergeet niet dat TRECS en KRECs samen zal worden versterkt in dezelfde putten, te onderscheiden van die van TCRAC.
- Schik een PCR-plaat met inbegrip van ten minste twee herhalingen voor elke monstersworden geanalyseerd: standaard curve (A → F 1 → 4), positieve controle (CTRL +; G1 → 4) en no-template controle (NTC; H 1 → 4).
| TRECS + KRECs een | TCRAC b | TRECS + KRECs | TCRAC | TRECS + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Een | 10 6 kopieën | 10 6 kopieën | 10 6 kopieën | 10 6 kopieën | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| B | 10 5 kopieën | 10 5 kopieën | 10 5 kopieën | 10 5 kopieën | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 kopieën | 10 <sup> 4 kopieën | 10 4 kopieën | 10 4 kopieën | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | 10 3 kopieën | 10 3 kopieën | 10 3 kopieën | 10 3 kopieën | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| E | 10 2 exemplaren | 10 2 exemplaren | 10 2 exemplaren | 10 2 exemplaren | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 exemplaren | 10 exemplaren | 10 exemplaren | 10 exemplaren | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
Tabel 5. Voorbeeld real-time PCR-plaat.
- Bereken het totale aantal putten nodig (onder andere 1-2 extra putten rekening te houden met mogelijke pipetteerfouten) en voorbereiden van de master mix voor TRECS / KRECs en TCRAC in aparte buizen (zie tabel 6).
NB:. De primers en probes specifiek voor TRECS, KRECs en TCRAC worden vermeld in Tabel 7 De primer en probe uiteindelijke concentraties zijn 900 nm en 200 nm, respectievelijk.
- Bereken het totale aantal putten nodig (onder andere 1-2 extra putten rekening te houden met mogelijke pipetteerfouten) en voorbereiden van de master mix voor TRECS / KRECs en TCRAC in aparte buizen (zie tabel 6).
| TRECS / KRECs | TCRAC | ||
| H2O | 2 pi | H2O | 4.75 pi |
| KRECs 20 pmol / ul | 1.125 pi | TCRAC 20 pmol / ul | 1.125 pi </ Td> |
| KRECs rev 20 pmol / pl | 1.125 pi | TCRAC rev 20 pmol / pl | 1.125 pi |
| KRECs probe 10 pmol / ul | 0,5 pl | TCRAC probe 10 pmol / ul | 0,5 pl |
| TRECS 20 pmol / ul | 1.125 pi | 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12.5 pi |
| TRECS rev 20 pmol / pl | 1.125 pi | ||
| TRECS probe 10 pmol / ul | 0,5 pl | ||
| 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12.5 pi | ||
Tabel 6. volume van vereiste reagentia voor het aangegeven putten.
| TRECS | vooruit | 5'-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3 ' |
| omgekeerde | 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 ' | |
| sonde | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 ' | |
| KRECs | vooruit | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3 |
| omgekeerde | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 ' | |
| sonde | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | vooruit | 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 ' |
| omgekeerde | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| sonde | 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 ' |
Tabel 7. Volgorde van de primer en probes voor de real-time PCR assay.
- Voeg 20 ul van elke mix (TRECS / KRECs en TCRAC). Voor het verlaten van het reagens voorbereiding kamer, sluit de reactie plaat met een optische lijm deksel.
- In een nucleïnezuur extractie, lift de kleefmiddelafdekking en voeg 5 ul genomisch DNA monster (400-500 ng) aan de putjes. Voeg 5 ui genomisch DNA (dwz bereid uit PBMC verkregen van navelstrengbloed) aan de CTRL + putjes.
Opmerking: Als alternatief voor navelstrengbloed, DNA dat uit dezelfde bekende positieve perifeer bloedmonster of pool van monsters, of bereidt een "kunstmatige" positieve norm door mengen van een bepaalde hoeveelheid van triple-insertie plasmide met genomisch DNA van TREC- en Krec-negatieve cellijnen. - Voeg 5 ul water aan de NTC putjes. Dicht de reactie plaat opnieuw met de optische lijm deksel.
- Verplaatsen naar een locatie zorgen insluiting van plasmide DNA carry-over; dooi elke verdunning point van het plasmide DNA standaard curve alleen voor gebruik en de voorbereiding van de hoogste verdunning (10 kopieën / 5 pi). Til de lijm deksel alleen van A → H 1 → 4 putten en voeg 5 ul van elk punt verdunning van plasmide DNA standaardcurve. Dicht de lijm weer dekking.
- Controleer de afwezigheid van bellen op de bodem van de putjes, waardoor de reagentia staan onderaan.
- Voer de test op een real-time PCR-systeem. De standaard protocol bestaat uit eerste stap bij 50 ° C gedurende 2 min, een initiële verhitting bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 45 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 sec, en een gecombineerde primer / probe annealing en verlenging bij 60 ° C gedurende 1 min.
- Sla de gegevens op het einde van de PCR-programma.
OPMERKING: Om DNA kruisbesmetting te vermijden, vergeet niet: de gebruikelijke goede laboratoriumpraktijken aanbevelingen voor kwantitatieve PCR volgen bij het opzetten van de real-time PCR-test: gebruik aparte ruimtes / kamers voor nucleïnezuur extractie,reagens voorbereiding, plasmide manipulatie, amplificatiereactie; Gebruik aparte pipet sets; veranderen handschoenen / jassen naargelang het geval.
- Resultaten en berekening:
OPMERKING: De volgende stappen zijn gebaseerd op onze ervaring met behulp van de software die bij de real-time PCR in de Materials tabel genoemde instrument, maar in het algemeen, moeten ze van toepassing zijn op andere real-time PCR-analyse platformen en software. Houd in gedachten dat, zelfs als het gebruik van de dezelfde software, meestal is er meer dan één manier om de benodigde commando's (bv, pictogrammen, snelkoppelingen) uit te voeren.- Open het opgeslagen resultaat bestand in de software en klik op het tabblad "Resultaten". Op de top van het venster klikt u op het menu "Analyse" en selecteer "Analyse instellingen". Laat de software bepalen de drempel automatisch door het selecteren van "All" detectoren en "Auto Ct" (Ct = drempel cyclus. Laat de software set "Automatic Baseline"; voor achtergrond eliminatie standaard.
- Klik op het tabblad met de naam "Amplification Plot" en, op het meest rechtse deel van het venster, selecteert u een van de drie "detectoren" in de overeenkomstige drop-down menu (bijvoorbeeld, beginnen met TRECS). Net onder, selecteert u "Handmatig Ct" een drempel handmatig in te stellen; naar het onderste deel van het venster en selecteer de putten overeenkomt met de standaardkromme verdunning punten van de gekozen detector de versterking plots tonen. Om dit te doen klikt u op en sleep de muis over de overeenkomstige cellen van de tabel.
- Om de drempel handmatig aan te passen, sleept u de rode drempel lijn op en neer, en klik vervolgens op "Analyseren" om de resultaten opnieuw analyseren. Om te controleren hoe het instellen van de drempel van invloed op de resultaten, selecteert u het tabblad "Rapport", en zie de resulterende Ct van de respectievelijke standaardcurve verdunning punten. Bij het verplaatsen van de drempel, proberen om te voldoen aan de volgende aanbevelingen om een optimale plaatsing te krijgen.
- Ga terug naar het tabblad 'Amplification Plot "en controleer of de drempel is in een regio van de exponentiële amplificatie genoeg boven het achtergrondgeluid, maar onder het plateau fase. Als de versterking plot niet in logaritmische schaal wordt weergegeven, klik met de rechtermuisknop op het perceel aan de "Graph Settings" en zet post-run Y-as instelling als "log", stelt de drempel halverwege in het lineaire deel van het herinneren plot gebruiken en de amplificatiecurves ongeveer evenwijdig aan elkaar.
- Klik op het tabblad "Report" om de Ct resultaten te zien. Zorg ervoor dat de drempel plaatsing geproduceerde resultaten die de precisie van de twee replicaten van elke standaardcurve verdunning punten maximaliseren.
- Controleer dat de drempel wordt geplaatst op het punt dat het best de extreme ordes van grootte van de standaard curve verdunning punten (optimale gevoeligheid). Herhaal stap 4.2.2 en de resterende deelstappen voor de resterende twee detectoren (KRECs en TCRAC).
- Ga naar het tabblad Rapport, sleept u de muis opnieuw in de tabel aan het onderste gedeelte van het venster om de cellen die corresponderen met de putjes van de standaard curve voor alle detectoren (TRECS, KRECs, TCRAC) te selecteren. Controleer of de resulterende Ct van de drie doelstellingen is vergelijkbaar bij dezelfde verdunning punten (bijv verschil niet meer dan 0,5 Ct). Bijstellen drempels als dat nodig is en opnieuw controleren.
OPMERKING: Omdat de triple-insertie plasmide bevat een enkele kopie van elk doel en derhalve de amplificatieverhouding theoretisch dicht bij 1: 1: 1. In sommige gevallen kan het noodzakelijk zijn om handmatig ook de basislijn passen voor één of meer van de detectoren betere resultaten. Herinneren alleen het venster "Analyse instellingen", selecteert u de detector waarvoor de aanpassing nodig is, dan stelt u "Handmatig Baseline", en steek aangepaste waarden voor het begin en einde Cycles (meestal 3 tot 15). Klik vervolgens op "OK & Opnieuw analyseren" en controleer de vorige punten. - Accepteer de experimentele sessie pas na verificatie van de volgende:
- Klik op het tabblad "Report", ga dan naar het onderste gedeelte van het venster selecteert NTC putten en controleer of de bijbehorende Ct is "Undet" (dat wil zeggen, geen versterking is aanwezig in NTC putten).
- Selecteer het tabblad "Standard Curve" en kijk aan de rechterkant van het perceel venster; select detectoren in het drop-down menu om te zien of de gerapporteerde standaard stooklijn varieert tussen -3,55 en -3,32 (overeenkomend met rendementen van 91 PCR - 100%)
- Zorg ervoor dat de determinatiecoëfficiënt (R2) is hoger dan 0,998 (figuur 2), door het lezen van zijn waarde net onder de helling en het intercept (in hetzelfde tabblad "Standard Curve", na het selecteren van elke detector).
OPMERKING: Let op de extreme verwatering punten omdat hun foutieve uitlijning van de helling van invloed kunnen gemakkelijker (ze hebben een hoog "leverage "effect op de regressielijn). In het bijzonder, in gedachten houden dat de hoogste plasmide verdunning sneller dan verwacht kunnen degraderen. Wanneer echter mogelijk is het nuttig niet te verwijderen, omdat een rationele benadering kan overwegen 100 als de grens van kwantitatieve detectie: met andere woorden, voor monsters tussen 10 en 100, kan het resultaat worden gerapporteerd als <100 of "positieve , maar niet kwantificeerbaar ", terwijl als buiten de curve bereik (<10) kan worden gerapporteerd als 0 of" niet op te sporen ".
Opmerking: Het kan nuttig zijn een archief van de Ct-waarden van eerdere standaardkromme verdunningen houden, teneinde een gemiddelde waarde voor elke verdunning punt berekenen als een soort optimale "referentie" range of interne kwaliteitscontrole voor toekomstige experimenten worden bewaard (bv, bereken gemiddelde en SD naar Shewhart controlekaarten te bouwen). Analoog kan het nuttig zijn om een archief van het verleden Ct van de positieve controle.
Figuur 2. Standaard curves voor TRECS, KRECs en TCRAC. Plots van de standaard curve punten en log-regressielijn ramingen voor TRECS (A), KRECs (B), en TCRAC (C) zijn gebouwd om de naleving van de ideale exponentiële versterking tarief (helling = 3.32), dat zou overeenkomen met een rendement van 100%. Ct: drempel cyclus; R2:. Regressie determinatiecoëfficiënt Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.- Klik op het tabblad "Report" en controleer of de Ct van de positieve controle (te vinden in de overeenkomstige cellen van de tabel onder de grafiek) is in overeenstemming met de resultaten van de eerdere tests op het same positieve controle bekend.
OPMERKING: Het tabblad "Rapport" toont de hoeveelheid TRECS, KRECs en TCRAC van de monsters wordt getest dat de software heeft berekend door interpolatie van de respectieve standaard curve, met behulp van de Ct-waarden verkregen na de drempel en de basislijn correct zijn ingesteld (een nieuwe analyse met een nieuwe drempel / uitgangswaarde zou deze resultaten te wijzigen). Om te zien waar de interpolatie vindt plaats op de standaard, en selecteer het tabblad "Standard Curve", selecteer vervolgens de gewenste putten, en op zoek naar de zwarte "X" die op de regressielijn. De y-as waarde de geïnterpoleerde hoeveelheid. Bij gebruik van steeds dezelfde positieve controle, kunnen passende verwijzing reeksen en / of kwaliteit controlekaarten worden gebouwd, op basis van eerdere waarden bepaald aan de positieve controle.
- Klik op het tabblad "Report" en controleer of de Ct van de positieve controle (te vinden in de overeenkomstige cellen van de tabel onder de grafiek) is in overeenstemming met de resultaten van de eerdere tests op het same positieve controle bekend.
- Klik op het menu "Bestand", "Opslaan", en vervolgens "Exporteren" naar een CSV-bestand naar de hoeveelheden van alle putten te exporteren in een text-bestand met door komma's gescheiden waarden.
- Importeer the.csv bestand in een spreadsheet-software en bereken het aantal TRECS of KRECs per 10 6 PBMC door het instellen van de volgende formule op de juiste wijze: [(gemiddelde hoeveelheid TRECS of KRECs) / (gemiddelde hoeveelheid TCRAC / 2)] x 10 6
OPMERKING: De gemiddelde hoeveelheid TCRAC wordt gedeeld door 2 omdat in elke cel er twee TCRAC genkopieën, bijvoorbeeld, een voor elk chromosoom.
OPMERKING: De consistentie van het uiteindelijke aantal TRECS en KRECs van de positieve controle kan worden beschouwd, maar in gedachten dat waarden zullen niet perfect aansluiten vanwege de toegevoegde variabiliteit van de standaard curve verdunning punten te houden. Bij grove verschillen, moet de proef worden herhaald. Opnieuw kan controlekaarten worden gebouwd om een passende verwijzing bereik in te stellen. - (Optioneel, maar aanbevolen) Indien de resultaten van het volledig bloedbeeld beschikbaar Bereken het TRECS of KRECs per ml bloed met de volgende formule:
TRECS of KRECs per 1 x 10 6) x (lymfocyt + monocyt telling in 1 ml bloed) / 10 = 6 kopieën / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De test werd uitgevoerd in een representatieve steekproef van 87 gezonde controles: 42 kinderen in de leeftijd 0-17 (man / vrouwtjes: 25/17) en 45 volwassenen in de leeftijd 24-60 (mannen / vrouwen: 29/16). De resultaten werden verkregen als TRECS en KRECs per 10 6 PBMC, en vervolgens de TRECS en KRECs per ml bloed werden berekend.
Het aantal TRECS afneemt met de leeftijd toe te schrijven aan involutie van de thymus, 4 in het bijzonder in een zeer scherpe fashion 0-3 - 4 jaren. Bij volwassenen het TREC nummer ook afhankelijk geslacht omdat het sneller afneemt bij mannen dan bij vrouwen. 5 Dit kan problemen in die prettig referentiewaarden, die moet worden gedifferentieerd op basis van de leeftijd en eventueel geslacht, als een zeer nauwkeurige creëren schatting van normaliteit nodig.
Figuur 3. TREC kwantificering bij gezonde do nors. De hoeveelheid TRECS werd bepaald als TRECS / 10 6 cellen in gezonde kinderen (A) en volwassenen (B) en vervolgens berekend als TRECS / ml in dezelfde onderwerpen (C, D). Duidelijke cirkels: vrouwtjes; gevulde cirkels: mannetjes. Lijnen werden verkregen door lineaire regressie met behulp van log-getransformeerde gegevens. Bij kinderen werden twee regressielijnen gemonteerd op de variabele rente van TREC daling met de leeftijd beter te vertegenwoordigen. Bij volwassenen, gestippelde lijnen geven de trend van daling met de leeftijd van TRECS gezien bij vrouwen, dat is langzamer dan bij mannen (doorlopende lijn). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Het aantal KRECs afneemt met de leeftijd met een patroon vergelijkbaar TRECS alleen bij kinderen, terwijl het beenmerg output in volwassenen het hele leven vrij stabiel en is niet afhankelijk van het geslacht.
_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 4:. Krec kwantificering bij gezonde donoren De hoeveelheid KRECs werd bepaald als KRECs / 10 6 cellen in gezonde kinderen (A) en volwassenen (B) en vervolgens berekend als KRECs / ml in dezelfde onderwerpen (C, D). Duidelijke cirkels: vrouwtjes; gevulde cirkels: mannetjes. Lijnen werden verkregen door lineaire regressie met behulp van log-getransformeerde gegevens. Bij kinderen werden twee regressielijnen gemonteerd op de variabele rente van Krec daling met de leeftijd beter te vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Voor representatieve doeleinden, eenvoudige log-lineaire regressie modellen waren uitgerust om het patroon van TREC / Krec daling met de leeftijd af te beelden, maar meer verfijnd niet-lineaire modellen kan i worden gemonteerdn een poging om beter te voorspellen de schijnbaar exponentiële Krec / TREC daling met de leeftijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
