Introduction
T-cellreceptor excision cirklar (TRECs) och K-strykning rekombination excision cirklar (KRECs) är små cirkulariserade DNA-element som är utskurna i en proportion av T- och B-celler, respektive, under ett genomiskt DNA-rekombination, som kan leda till bildning av en mycket diversifierad repertoar av T- och B-cellreceptorer. De har ingen funktion, utan för att de är stabila och inte kan replik, de späds efter varje celldelning, vilket kvarstår endast i en av de två dotterceller. Därför kan deras nivåer i perifert blod antas som en uppskattning av tymus och benmärg utgång.
Medan TREC-analysen har till stor del använts under de senaste 15 åren för att bedöma omfattningen av tymus utgång, till 1 av KREC analysen, som ursprungligen utvecklades mäta B-celltillväxt och dess bidrag till B-cells homeostas vid hälsa och sjukdom, 2 har först nyligen föreslagits som en markör för ben marrow utgång. 3,4 Här beskriver vi den metod vi utvecklat för samtidig kvantifiering av både TRECs och KRECs. 4
Med denna kombinerade metod är variabiliteten associerad med DNA-kvantifiering genom realtids-PCR elimineras genom användning av ett unikt standardkurva erhållen genom att späda en trippel-insert plasmid innehållande fragment av TRECs, KRECs och T-cellreceptor-alfa konstant (TCRAC) gen i en 1: 1: 1-förhållande. Detta möjliggör en mer korrekt bedömning av TREC och KREC antal kopior. Vidare, den samtidiga kvantifieringen av de två målen i den samma reaktionen tillåter minskning reagenskostnaden.
Den föreslagna TREC / KREC analysen kan vara användbart för att mäta omfattningen av T- och B-cells neo-produktionen hos barn eller vuxna med svår kombinerad immunbrist (SCID), 4 vanlig variabel immun, 5 autoimmuna sjukdomar, 6-8 och HIV-infektion . 9 Dessutom kan den användas för attövervaka immun återhämtning efter hematopoetisk stamcellstransplantation, 10 enzymersättnings, 11 och antivirala 9 eller immunomodulerande terapier. 6-8 Slutligen därför SCID patienter redovisas enligt TREC analys trots de underliggande genetiska defekter, och agammaglobulinemi patienter kan identifieras med hjälp KREC kvantifiering , den TREC / KREC analysen kan också användas för att upptäcka immun hos nyfödda screeningprogram. 12 I detta fall skall provningen utföras på DNA extraherat från små fläckar av blod blottades och torkades på filterpapper, måste vara mycket känslig och specifik för målsjukdomarna samt mycket reproducerbar och kostnadseffektivt.
Införandet av KREC kvantifiering i testet bör förbättra föreställningar av nyfödda screening för immun, som rutinmässigt har utförts i vissa delar av USA (WI, MA, CA) sedan 2008 då Wisconsin blev den första att inföe analysen av TRECs i sitt postnatal screeningprogram. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Etik uttalande: Detta protokoll följer riktlinjerna i vår institution, Spedali Ċivili di Brescia
1. Beredning av en "Triple-Insert" plasmid
- Urval och beredning av lämpligt utgångsmaterial:
- Skaffa ett prov innehållande celler mycket som kan få TRECs och KRECs detekterbara med PCR, såsom perifert blod av en ung frisk person samlas in EDTA-rör.
OBS: Ursprungligen hade vi utvecklat metoden använder tymocyter för TRECs och mononukleära celler från tonsill fragment för KRECs, men friska försöks har oftast en mängd TRECs och KRECs tillräckliga att detta kan påvisas med PCR. Därför bör perifert blod vara ett fullgott alternativ, lättare att få och att arbeta med. Med tanke på att TRECs särskilt minskar med åldern hos friska vuxna, perifert blod från en ung vuxen, om inte från barn, rekommenderas. - Separat perifert blod mononuclear celler (PBMC) från en standard densitetsgradient separationsmetod.
- Skaffa ett prov innehållande celler mycket som kan få TRECs och KRECs detekterbara med PCR, såsom perifert blod av en ung frisk person samlas in EDTA-rör.
- DNA-extraktion:
- Utdrag DNA från PBMC med ett kommersiellt DNA Blood Mini Kit. Följ tillverkarens anvisningar med några ändringar som beskrivs nedan.
- Inkubera proverna vid 70 ° C (i stället för 56 ° C) under 10 min med användning av en skakapparat-inkubator vid 1400 varv per minut.
- Lägg elueringsbufferten upphettades vid 70 ° C till kolonnen, inkubera i 5 min vid 70 ° C och eluera DNA genom centrifugering såsom enligt tillverkarens instruktioner. Bestäm extraherade DNA-koncentrationen genom spektrofotometrisk uppskattning vid 260/280 nm.
- Utdrag DNA från PBMC med ett kommersiellt DNA Blood Mini Kit. Följ tillverkarens anvisningar med några ändringar som beskrivs nedan.
- Framställning av en plasmid innehållande de skär av TREC och KREC signal lederna (SJ) och TCRAC referens gen:
- Förstärk det DNA som extraherats från PBMC (för att erhålla den TREC-SJ, KREC-SJ, och TCRAC fragment) med primers specifika för TRECs, KRECs och TCRAC (se tabell 1).
OBS: Vid 5'-änden, de KREC- och TCRAC-specifika primers innehåller Hindlll- och Spel-restriktionsställen (i gemener i de sekvenser som visas Tabell 1) med ett lämpligt antal flankerande ytterligare nukleotider (indikeras i kursiv); båda funktioner är inte närvarande i de kanoniska KREC och TCRAC sekvenser.
- Förstärk det DNA som extraherats från PBMC (för att erhålla den TREC-SJ, KREC-SJ, och TCRAC fragment) med primers specifika för TRECs, KRECs och TCRAC (se tabell 1).
| TRECs | framåt | 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 ' |
| omvänd | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 ' | |
| KRECs | framåt | 5'CCC AAG ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 ' |
| omvänd | 5'CCC AAG CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 ' | |
| TCRAC | framåt | 5'- G ac tagg TAT GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 ' |
| omvänd | 5'G ac tagg TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 ' |
Tabell 1. Primers används för kloningsförfaranden. Vid 5'-änden, med små bokstäver visas nukleotider motsvarar restriktionsenzymställen, medan det i kursiv stil visas läggs flankerande nukleotider.
- Utför PCR-reaktioner i en slutlig volym av 25 | il, som består av 1 x buffert II, 1,5 mM MgCl2, dNTP-blandning (200 ^ M vardera), primrar vid den slutliga koncentrationen av 900 nM AmpliTaq DNA-polymeras (2,5 U / 25 | il), och 100 ng DNA.
- Använd följande PCR-parametrarna: första steg vid 95 ° C under 10 min, följt av 40 cykler av 95 ° C under 30 sek; 60 ° C under 30 sek; 72 ° C under 30 sek, och slutligen en cykel av 72 ° C under 10 min. PCR produktlängder bör vara: 380 bp för TRECs, 166 bp för KRECs, 381 bp för TCRAC.
- Sätt i PCR-produkten i TREC-SJ i acceptorstället av pCR2.1-TOPO vektor TA. Omvandla plasmid DNA i XL1-blått kemiskt kompetenta celler genom värmechock efter protokoll som med cellerna. Bland kolonierna som växer på grund av ampicillinresistens, identifiera de bärande insatsen, vilket kommer att visas vitt på grund av förlorad β-galaktosidas komplemente och ympa in dem i en master maträtt. Slutligen, identifiera kolonierna innehåller TREC fragmentet av PCR.
- Expandera en av de identifierade kolonierna och rena plasmid-DNA med hjälp av en plasmid miniprep kit och följ tillverkarens anvisningar. Digerera plasmid-DNA och den TCRAC amplifierade produkten med Spel-restriktionsenzym och ligera TCRAC fragmentet in i Spel-restriktionsstället.
- Omvandla plasmid DNA i XL1-blå celler och identifiera kolonierna innehåller TCRAC fragmentet av PCR. Expandera en av de identifierade kolonierna och renaplasmid-DNA med användning av plasmiden miniprep kit.
- Smälta plasmid-DNA och KREC förstärkta produkten med Hindlll och klona KREC-SJ fragment i Hindlll restriktionsstället. Omvandla plasmid DNA i XL1-blå celler och identifiera kolonierna som innehåller den tredje fragmentet av PCR.
- Verifiera, genom direkt sekvensering kan närvaron av de tre skären och avsaknaden av mutationer. Kartan över den slutliga trippel insert plasmiden representeras i figur 1.
Figur 1. Triple-insert plasmidkarta. Triple-insert plasmidkarta visar läget för TREC, KREC, TCRAC sekvenser och restriktionsenzymställen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Expandera en av de identifierade kolonierna, rena plasmid-DNA med hjälp av en plasmid Midiprep kit. Bestäm plasmid-DNA koncentration genom spektrofotometrisk uppskattning vid 260/280 nm och DNA-kvaliteten genom gelelektrofores. Förvara lämpliga alikvoter av plasmiden vid -80 ° C (t ex., 50 | il vardera).
2. Standard Curve Förberedelse
OBS: Förbered alla utspädningar i 0,1 x TE-buffert på en plats som är speciellt utformad för inneslutning av DNA överföring.
- Beräkna massan av plasmid kopietal av intresse (se tabell 2), med beaktande av att plasmiden storleken är 4846 bp och att den genomsnittliga massan per bp är 1.096 x 10 -21 g / bp, och därför: m p = ( 4846 bp) x (1.096 x 10 -21 g / bp) = 5,311.216 x 10 -21 g = 5,311 x 10 -18 g.
| Kopiera # | x 5,311 x 10 -18 g | Massa av plasmid-DNA (g) |
| 1 x 10 6 | 5,311 x 10 -12 |
| 1 x 10 5 | 5,311 x 10 -13 |
| 1 x 10 4 | 5,311 x 10 -14 |
| 1 x 10 3 | 5,311 x 10 -15 |
| 1 x 10 2 | 5,311 x 10 -16 |
Tabell 2. Massa av plasmid behövs för varje standardkurva spädpunkt.
- Beräkna koncentrationen av plasmid-DNA genom att dividera de nödvändiga plasmiden massorna med volymen (5 | il), som skall pipetteras i varje reaktion (se tabell 3).
| Massa av plasmid-DNA (g) | ÷ 5 pl | Slutlig koncentration av plasmid-DNA (g / il) |
| 5,311 x 10 -12 | 1,062 x 10 -12 | |
| 5,311 x 10 -13 | 1,062 x 10 -13 | |
| 5,311 x 10 -14 | 1,062 x 10 -14 | |
| 5,311 x 10 -15 | 1,062 x 10 -15 | |
| 5,311 x 10 -16 | 1,062 x 10 -16 |
Tabell 3. Beräkning av plasmid koncentrationer som behövs för varje spädpunkt.
- Tina en alikvot av plasmiden. Linjärisera 2 | ig av plasmid-DNA med Xhol och bestämma dess koncentration By spektrofotometrisk uppskattning vid 260/280 nm.
- Bered en lämplig utspädning av det linjäriserade plasmid-DNA i syfte att uppnå en bekväm arbetsstamlösning att utgå från (t.ex., 100 ng / ul = 0,1 ug / ul = 1 x 10 -7 g / | il). Förvara återstoden av den lineariserade plasmid-DNA vid -80 ° C.
- Utför ett lämpligt antal 01:10 eller 1: 100 späd att föra plasmiden på mer praktiskt koncentration av 1 x 10 -10 g / l.
- Använd formeln C 1 V 1 = C 2 V 2 för att beräkna utspädningsvolymen (V 2 - V 1) behövs för att förbereda den första standardkurvan punkten av serien (1 x 10 6 kopior, vilket motsvarar 1.062 x 10 -12 g / 5 pl, se tabell 4).
| Initial konc. (G / il) | Plasmid-DNA vol (il) | Diluent vol (il) | Slutlig Vol. (Il) | Slutlig konc. (G / il) | Slutlig kopietalet av plasmid-DNA / 5 pl |
| C 1 | V 1 | V 2 -V 1 | V 2 | C 2 | |
| 1 x 10 -7 | 5 pl | 45 | il | 50 | il | 1 x 10 -8 | N / A |
| 1 x 10 -8 | 5 pl | 495 | il | 500 | il | 1 x 10 -10 | N / A |
| 1 x 10 -10 | 5 pl | 465 | il | 470 | il | 1,062 x 10 -12 | 1 x 10 6 |
| 1,062 x 10 -12 | 50 | il | 450 | il | 500 | il | 1,062 x 10 -13 | 1 x 10 5 |
| 1,062 x 10 -13 | 50 | il | 450 | il | 500 | il | 1,062 x 10 -14 | 1 x 10 4 |
| 1,062 x 10 -14 | 50 | il | 450 | il | 500 | il | 1,062 x 10 -15 | 1 x 10 3 |
| 1,062 x 10 -15 | 50 | il | 450 | il | 500 | il | 1,062 x 10 16 | 1 x 10 2 |
Tabell 4. Utspädnings beräkningar.
- Fortsätt med en regelbunden serie av 1:10 utspädningar för att erhålla de återstående standard kurvpunkter.
OBS: Glöm inte att virvel varje plasmid späd kort innan du utför nästa.
OBS: Det högsta utspädningen av stAndard kurva (10 kopior / 5 ul) skall beredas precis innan analysen utförs, eftersom en sådan liten mängd av plasmid-DNA är inte tillräckligt stabila för att lagras för framtida användning. - Förvara trippel plasmiden utspädningspunkter vid -80 ° C i separata rör fram till användning. Den utspädda trippel-plasmid-DNA är mycket stabila i minst 6 månader.
3. DNA-extraktion från Target Prover
- Separat PBMC från perifert blod samlas i EDTA-rör med hjälp av densitetsgradienten separationsmetod.
OBS: Du kan också använda andra lämpliga utgångsmaterial (t.ex. sorterade lymfocytsubpopulationer, helblod) som riktade urvalet. - Extrahera DNA från PBMC av riktade urval som rapporterats i steg 1.2.
4. Realtids-PCR för kvantifiering av TRECs och KRECs
- Plate förberedelse och lastning:
- Ordna en PCR platta varav minst två replikat för varje provsom skall analyseras: standardkurvan (A → F 1 → 4), positiv kontroll (CTRL +; G1 → 4) och ingen mall kontroll (NTC, H 1 → 4).
OBS: Observera en typisk ordning i tabell 5, men olika format kan skapas. Kom ihåg att TRECs och KRECs kommer att förstärkas tillsammans i samma brunnar, skiljde sig från TCRAC.
- Ordna en PCR platta varav minst två replikat för varje provsom skall analyseras: standardkurvan (A → F 1 → 4), positiv kontroll (CTRL +; G1 → 4) och ingen mall kontroll (NTC, H 1 → 4).
| TRECs + KRECs en | TCRAC B | TRECs + KRECs | TCRAC | TRECs + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| EN | 10 6 kopior | 10 6 kopior | 10 6 kopior | 10 6 kopior | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| B | 10 5 kopior | 10 5 kopior | 10 5 kopior | 10 5 kopior | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 kopior | 10 <sup> 4 kopior | 10 4 kopior | 10 4 kopior | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | 10 3 kopior | 10 3 kopior | 10 3 kopior | 10 3 kopior | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| E | 10 2 kopior | 10 2 kopior | 10 2 kopior | 10 2 kopior | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 kopior | 10 kopior | 10 kopior | 10 kopior | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
Tabell 5. Prov realtids-PCR plattan.
- Beräkna det totala antalet brunnar som behövs (inkluderar 1 - 2 extra brunnar till svars för eventuella pipetteringsfel) och förbereda mastermixen för TRECs / KRECs och TCRAC i separata rör (se tabell 6).
OBS:. De primers och prober specifika för TRECs, KRECs och TCRAC nämns i tabell 7 primer och sond slutliga koncentrationer är 900 nM och 200 nM, respektive.
- Beräkna det totala antalet brunnar som behövs (inkluderar 1 - 2 extra brunnar till svars för eventuella pipetteringsfel) och förbereda mastermixen för TRECs / KRECs och TCRAC i separata rör (se tabell 6).
| TRECs / KRECs | TCRAC | ||
| H2O | 2 | il | H2O | 4,75 pl |
| KRECs för 20 pmol / | il | 1,125 pl | TCRAC för 20 pmol / | il | 1,125 il </ Td> |
| KRECs rev 20 pmol / l | 1,125 pl | TCRAC rev 20 pmol / l | 1,125 pl |
| KRECs sond 10 pmol / | il | 0,5 | il | TCRAC sond 10 pmol / | il | 0,5 | il |
| TRECs för 20 pmol / | il | 1,125 pl | 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12,5 | il |
| TRECs rev 20 pmol / | il | 1,125 pl | ||
| TRECs sond 10 pmol / | il | 0,5 | il | ||
| 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12,5 | il | ||
Tabell 6. Volym av reagenser som behövs för de indikerade brunnarna.
| TRECs | framåt | 5'-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3 ' |
| omvänd | 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 ' | |
| sond | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 ' | |
| KRECs | framåt | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3 |
| omvänd | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 ' | |
| sond | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | framåt | 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 ' |
| omvänd | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| sond | 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 ' |
Tabell 7. Sekvens av primer och prober för realtids PCR-analysen.
- Tillsätt 20 pl av varje blandning (TRECs / KRECs och TCRAC). Innan du lämnar reagensberedningslokalen, försegla reaktionsplattan med ett optiskt lim lock.
- I en nukleinsyra extraktion rummet, lyft den självhäftande locket och tillsätt 5 ìl av genomisk DNA-prov (400-500 ng) till brunnarna. Tillsätt 5 pl iskt DNA (dvs, framställt från PBMC erhålls från navelsträngsblod) till CTRL + brunnarna.
NOTERA: Som ett alternativ till navelsträngsblod, använder DNA från samma kända, positivt prov av perifert blod eller en pool av prover, eller förbereda en "artificiell" positiv standard genom blandning av en bestämd mängd av trippelskär plasmid med genomiskt DNA från TREC- och KREC-negativa cellinjer. - Lägg 5 | il vatten till NTC brunnarna. Täta reaktionsplattan igen med den optiska bindemedlets täckskikt.
- Flytta till en plats säkerställer inneslutning av plasmid-DNA överföring; tina varje späd point av plasmid-DNA standardkurvan endast före användning och förbereda den högsta utspädningen (10 kopior / 5 pl). Lyft upp den självhäftande täck bara från A → H 1 → 4 brunnar och tillsätt 5 ìl av varje punkt utspädning av plasmid-DNA standardkurva. Täta vidhäftande locket igen.
- Verifiera frånvaron av bubblor på botten av brunnarna, vilket säkerställer att reagensen är placerade vid botten.
- Kör analys på en Realtids-PCR-systemet. Standardprotokollet består av första steget vid 50 ° C under 2 min, en initial upphettning vid 95 ° C under 10 min, följt av 45 cykler av denaturering vid 95 ° C under 15 sek, och en kombinerad primer / prob hybridisering och förlängning vid 60 ° C under 1 min.
- Spara data i slutet av PCR-program.
OBS: För att undvika DNA korskontaminering, kom ihåg: att följa de vanliga rekommendationerna god laboratoriesed för kvantitativ PCR när du installerar realtid PCR-analys: använda separata områden / rum för nukleinsyra utvinning,Reagens, plasmid manipulation, amplifieringsreaktion; använda separata pipett uppsättningar; byta handskar / rockar så är lämpligt.
- Resultat och beräkning:
OBS: Följande steg är baserade på vår erfarenhet av att använda den programvara som medföljer den realtids-PCR instrument som nämns i Materials tabell, men i allmänhet bör de tillämpas på andra realtids PCR-analys plattformar och mjukvaror. Kom ihåg att även om användning av samma mjukvara, vanligtvis det finns mer än ett sätt att verkställa de nödvändiga kommandon (t.ex. ikoner, genvägar).- Öppna den sparade resultatet filen i programmet och klicka på fliken "Resultat". På toppen av fönstret, klicka på menyn "Analys" och välj "Analys inställningar". Låt programmet avgöra tröskeln automatiskt genom att välja "Alla" detektorer och "Auto Ct" (Ct = tröskelcykel. Låt programvaran uppsättningen "Automatic Baseline"; för bakgrunds eliminering som standard.
- Klicka på fliken som heter "Förstärkning Plot" och, längst till höger i fönstret, välj en av de tre "detektorer" i motsvarande rullgardinsmenyn (t.ex. börja med TRECs). Precis nedanför, välja "Manuell Ct" att manuellt ställa en tröskel; gå till den nedre delen av fönstret och välj brunnarna som svarar mot standardpunkter vald detektorkurvan utspädning för att visa förstärknings tomter. För att göra detta klickar du bara och dra musen över motsvarande celler i tabellen.
- För att justera tröskeln manuellt, dra den röda tröskellinjen upp och ner, och klicka sedan på "Analysera" till omanalysera resultat. För att kontrollera hur ställer tröskeln påverkar resultaten, välj "Rapport" -fliken, och se den resulte Ct av respektive standardkurva utspädningspunkter. När du flyttar tröskeln, försök att uppfylla följande rekommendationer för att få en optimal placering.
- Gå tillbaka till "Amplification Plot" -fliken och kontrollera att tröskeln är i en region i exponentiell förstärkning tillräckligt över bakgrundsbrus men under platåfasen. Om förstärkningen tomten inte visas i logaritmisk skala, högerklicka på tomten för att påminna om "Graph Settings" och ställa efter köra Y-axeln inställning som "log", sätta gränsen halvvägs i den linjära delen av tomt, och observera förstärkning kurvor ungefär parallellt med varandra.
- Klicka på "Rapport" flik för att se Ct resultaten. Se till att tröskel placeringen gett resultat som maximerar precisionen i de två replikat av varje standardkurva utspädningspunkter.
- Kontrollera att tröskeln är placerad vid den punkt som bäst återspeglar extrema tiopotenser av standardkurva utspädningspunkter (optimal känslighet). Upprepa steg 4.2.2 och återstående understeg för de återstående två detektorer (KRECs och TCRAC).
- Gå till fliken Rapport, dra musen igen i tabellen i den nedre delen av fönstret för att markera cellerna motsvarar brunnarna i standardkurvan för alla detektorer (TRECs, KRECs, TCRAC). Kontrollera att den resulte Ct av de tre målen är mycket lik på samma utspädningspunkter (t.ex. skillnaden inte mer än 0,5 Ct). Justera trösklar om det behövs och åter kolla.
OBS! Eftersom trippel insatsen plasmiden innehåller en enkelkopia av varje mål och därför förstärkningsförhållandet bör teoretiskt vara nära 1: 1: 1. I vissa fall kan det vara nödvändigt att manuellt justera även baslinjen för en eller flera av detektorerna för att få bättre resultat. Bara minns "Analysinställningar" fönstret väljer detektorn för vilken justering behövs, ställ sedan in "Manual Baseline", och sätt egna värden för Start och Slut Cycles (vanligen 3 till 15). Klicka sedan på "OK & Analysera" och kontrollera tidigare punkter. - Acceptera den experimentella session efter att ha kontrollerat följande:
- Klicka på "Rapport" -fliken, gå till den nedre delen av fönstret, väljer NTC brunnar och kontrollera att motsvarande Ct är "Undet" (dvs, är närvarande i NTC brunnar ingen förstärkning).
- Välj "Standard Curve" fliken och se till höger av tomten fönstret; välj detektorer från rullgardinsmenyn och se om den rapporterade standard kurvlutning varierar mellan -3,55 och -3,32 (motsvarande PCR effektivitetsvinster av 91-100%)
- Se till att förklaringsgraden (R2) är högre än 0,998 (Figur 2), genom att läsa dess värde precis nedanför backen och intercept (i samma "standardkurva" fliken, efter att ha valt varje detektor).
OBS: Var uppmärksam på de extrema späd poäng eftersom deras snedställning kan påverka lutningen lättare (de har en hög "leverage "effekt på regressionslinjen). I synnerhet kom ihåg att den högsta plasmiden utspädningen kan försämra tidigare än väntat. Men när det är möjligt är det bra att inte kasta dem, eftersom ett rationellt tillvägagångssätt kan vara att betrakta 100 som gränsen för kvantitativ detektion: med andra ord, för prover mellan 10 och 100, kan resultatet rapporteras som <100 eller "positiv , men inte kvantifierbar ", medan om utanför kurvan intervall (<10) kan det rapporteras som 0 eller" omätbara ".
OBS: Det kan vara lämpligt att hålla ett arkiv av Ct-värdena för tidigare standard förtunningar i syfte att beräkna ett genomsnittligt värde för varje späd punkt att hållas som ett slags optimalt "referens" intervall eller intern kvalitetskontroll för framtida experiment (t.ex. beräkna medelvärdet och SD att bygga Shewhart styrdiagram). Analogt, kan det vara bra att hålla ett arkiv av det förflutna Ct av den positiva kontrollen.
Figur 2. Standardkurvor för TRECs, KRECs och TCRAC. Tomter för standardkurvan poäng och log-regressionslinjen uppskattar för TRECs (A), KRECs (B), och TCRAC (C) är byggda för att kontrollera att den ideala exponentiella förstärkningsfrekvens (lutning = 3,32) som skulle motsvara en verkningsgrad på 100%. Ct: tröskel cykel; R2:. Regressionsgraden Klicka här för att se en större version av denna siffra.- Klicka på "Rapport" -fliken och kontrollera att Ct för den positiva kontrollen (som finns i motsvarande celler i tabellen under diagrammet) är överens med resultaten från de tidigare analyserna på samig känd positiv kontroll.
OBS: "Rapport" -fliken visar mängden TRECs, KRECs och TCRAC av proverna som testas att programvaran har beräknats genom interpole från respektive standardkurvan med Ct-värden erhållna efter tröskeln och baslinjen är korrekt inställd (a ny analys med en ny tröskel / baslinjen skulle ändra dessa resultat). För att se var interpole sker på standardkurvan, välj fliken "standardkurva", välj sedan önskade brunnarna, och leta efter den svarta "X" som förekommer på regressionslinjen. Deras y-axelvärde är interpolerade kvantiteten. Om du använder alltid samma positiva kontrollen, kan lämpliga referensintervall och / eller kvalitetskontroll diagram byggas, baserat på tidigare värden bestämda på den positiva kontrollen.
- Klicka på "Rapport" -fliken och kontrollera att Ct för den positiva kontrollen (som finns i motsvarande celler i tabellen under diagrammet) är överens med resultaten från de tidigare analyserna på samig känd positiv kontroll.
- Klicka på menyn "File", "Spara", och sedan "Exportera" till en CSV-fil att exportera de kvantiteter av alla brunnar i en text-fil som innehåller kommaseparerade värden.
- Importera the.csv fil i ett kalkylprogram och beräkna antalet TRECs eller KRECs per 10 6 PBMC genom att ställa följande formel lämpligt: [(medelvärde mängd TRECs eller KRECs) / (medelvärde mängd TCRAC / 2)] x 10 6
OBS: Den genomsnittliga mängden TCRAC divideras med två eftersom det i varje cell finns det två TCRAC genkopior, t.ex., en för varje kromosom.
OBS: Konsistensen på det slutliga antalet TRECs och KRECs av positiv kontroll kan anses, men tänk på att värdena inte helt kommer att matcha på grund av den extra variationen av standardkurvan utspädningspunkter. Vid grov divergens, kan försöket behöva upprepas. Återigen, kan styrdiagram byggas för att ställa in en lämplig referensintervall. - (Valfritt, men rekommenderas) Om resultaten av den blodstatus är tillgängliga, beräkna TRECs eller KRECs per ml blod med hjälp av följande formel:
TRECs eller KRECs per 1 x 10 6) x (lymfocyter + monocyt räkna i 1 ml blod) / 10 6 = kopior / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen genomfördes i ett representativt urval av 87 friska kontroller: 42 barn i åldern 0-17 (manliga / honor: 25/17) och 45 vuxna i åldern 24-60 (män / kvinnor: 29/16). Resultaten erhölls som TRECs och KRECs per 10 6 PBMC, och sedan de TRECs och KRECs per ml blod beräknades.
Antalet TRECs minskar med åldern på grund av tymisk involution, 4 särskilt i en mycket skarp mode 0-3 - 4 år. Hos vuxna, det TREC antalet beror också på kön eftersom det minskar snabbare hos män än hos kvinnor. 5 Detta kan skapa problem i att ställa lämpliga referensintervall, som bör differentieras utifrån ålder och eventuellt kön, om så en mycket exakt Det behövs uppskattning av normalitet.
Figur 3. TREC kvantifiering friska do nors. Mängden TRECs bestämdes som TRECs / 10 6 celler i friska barn (A) och vuxna (B) och sedan beräknat som TRECs / ml i samma ämnen (C, D). Tydliga cirklar: honor; fyllda cirklar: hanar. Linjer erhölls genom linjär regression med användning av logaritmerade data. Hos barn har två regressionslinjer monterade för att bättre representera den rörliga räntan i TREC minskar med åldern. Hos vuxna, streckade linjerna representerar utvecklingen av minskningen med åldern av TRECs sågs hos kvinnor, vilket är långsammare än hos män (kontinuerlig linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Antalet KRECs minskar med åldern med ett mönster som liknar TRECs endast hos barn, medan de vuxna benmärgen utgången är ganska stabil under hela livet och inte beroende på kön.
_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 4:. KREC kvantifiering hos friska donatorer Mängden KRECs bestämdes som KRECs / 10 6 celler i friska barn (A) och vuxna (B) och sedan beräknat som KRECs / ml i samma ämnen (C, D). Tydliga cirklar: honor; fyllda cirklar: hanar. Linjer erhölls genom linjär regression med användning av logaritmerade data. Hos barn har två regressionslinjer monterade för att bättre representera den rörliga räntan i KREC minskar med åldern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För representativa ändamål, enkla log-linjära regressionsmodeller var monterad att skildra mönstret av TREC / KREC minskning med åldern, men mer raffinerade icke-linjära modeller kan monteras in ett försök att bättre förutse synes exponentiella KREC / TREC minskar med åldern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
