Introduction
T-celle-receptor excision cirkler (TRECs) og K-sletning rekombination excision cirkler (KRECs) er små cirkulariserede DNA-elementer, der er udskåret i en andel på T- og B-celler, henholdsvis i en genomisk DNA-rekombination proces, der fører til dannelsen af en meget forskelligartet repertoire af T- og B-celle receptorer. De har ingen funktion, men fordi de er stabile og ikke kan replikeres, er de fortyndes efter hver celledeling, således vedvarende kun i ét af de to datterceller. Derfor kan antages niveauet i perifert blod som et estimat af thymus og knoglemarv output.
Mens TREC analysen er stort set brugt de sidste 15 år for at vurdere omfanget af thymus output, til 1 på KRec analysen, der oprindeligt blev udviklet måle B-celle proliferation og dens bidrag til B-celle homeostase i sundhed og sygdom, 2 er først for nylig foreslået som en markør for knogle marrow output. 3,4 Her beskriver vi den metode, vi har udviklet til samtidig kvantificering af både TRECs og KRECs. 4
Med denne kombinerede fremgangsmåde Variabiliteten er forbundet til DNA kvantificering af real-time PCR elimineret ved anvendelse af en unik standardkurve fremstillet ved fortynding af en triple-insert plasmid indeholdende fragmenter af TRECs, KRECs og T-celle-receptor alpha konstant (TCRAC) gen i en 1: 1: 1 ratio. Dette tillader en mere nøjagtig vurdering af TREC og KRec kopiantal. Desuden samtidig kvantificering af de to mål i den samme reaktion tillader reduktion reagens omkostninger.
Den foreslåede TREC / KRec analysen kan være nyttigt at måle omfanget af T- og B-celle neo-produktion hos børn eller voksne med svær kombineret immundefekt (SCID), 4 Almindelig variabel immundefekt, 5 autoimmune sygdomme, 6-8 og HIV-infektion . 9 kan desuden bruges tilovervåge immune bedring efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation, 10 enzymerstatningsterapi, 11 og antiviral 9 eller immunmodulerende behandlinger. 6-8 Endelig fordi SCID patienter indregnes ved TREC assay trods de underliggende genetiske defekter, og agammaglobulinæmi patienter kan identificeres under anvendelse KRec kvantificering Den TREC / KRec analysen kan også anvendes til at detektere immundefekter hos nyfødte screeningsprogrammer. 12. I dette tilfælde skal testen udføres på DNA ekstraheret fra små pletter af blod blottet og tørres på filtrerpapir, skal være meget følsom og specifik for de pågældende sygdomme, samt yderst reproducerbar og omkostningseffektiv.
Indførelsen af KRec kvantificering i testen bør forbedre opførelser af nyfødte screening for immundefekter, som rutinemæssigt blevet udført i nogle dele af USA (WI, MA, CA) siden 2008, hvor Wisconsin blev den første til at introduktionene analyse af TRECs i sit postnatal screeningsprogram. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Etik erklæring: Denne protokol følger retningslinjerne i vores institution, Spedali Ċivili di Brescia
1. Fremstilling af en "Triple-Insert" plasmid
- Udvælgelse og fremstilling af passende udgangsmateriale:
- Anskaf en prøve indeholdende celler meget sandsynligt at have TRECs og KRECs påvises ved PCR, såsom perifert blod af en ung sund emne opsamlet i EDTA-rør.
BEMÆRK: Oprindeligt havde vi udviklet metoden ved hjælp af thymocytter til TRECs og mononukleære celler fra tonsil fragmenter for KRECs, men raske forsøgspersoner har normalt et beløb på TRECs og KRECs tilstrækkelige til at tillade deres påvisning ved PCR. Derfor bør perifert blod være et godt alternativ, lettere at opnå og at arbejde med. I betragtning af at TRECs især falde med alderen hos raske voksne, perifert blod fra en ung voksen, hvis ikke fra en børnepool, tilrådes. - Separat perifert blod mononucLear celler (PBMC) ved en standard densitetsgradient separation metode.
- Anskaf en prøve indeholdende celler meget sandsynligt at have TRECs og KRECs påvises ved PCR, såsom perifert blod af en ung sund emne opsamlet i EDTA-rør.
- DNA-ekstraktion:
- Uddrag DNA fra PBMC under anvendelse af et kommercielt DNA Blood Mini Kit. Følg producentens anvisninger med de få ændringer, der er beskrevet nedenfor.
- Inkuber prøverne ved 70 ° C (i stedet for 56 ° C) i 10 minutter under anvendelse af et rysteapparat-inkubator ved 1.400 rpm.
- Tilføj elueringspufferen opvarmet ved 70 ° C til søjlen, inkuberes i 5 minutter ved 70 ° C og eluere DNA ved centrifugering ifølge producentens anvisninger. Bestem det ekstraherede DNA-koncentrationen ved spektrofotometrisk skøn ved 260/280 nm.
- Uddrag DNA fra PBMC under anvendelse af et kommercielt DNA Blood Mini Kit. Følg producentens anvisninger med de få ændringer, der er beskrevet nedenfor.
- Fremstilling af et plasmid indeholdende inserts af TREC og KRec signal leddene (SJ) og TCRAC henvisning gen:
- Amplificere DNA ekstraheret fra PBMC (for at opnå den TREC-SJ, KRec-SJ og TCRAC fragmenter) med primere specifikke for TRECs, KRECs og TCRAC (se tabel 1).
BEMÆRK: Ved 5'-enden, de KREC- og TCRAC-specifikke primere indeholder Hindlll- og Spel restriktionsstederne (i små bogstaver i sekvenserne vist Tabel 1) med et passende antal flankerende yderligere nukleotider (angivet i kursiv); begge funktioner ikke er til stede i de kanoniske KRec og TCRAC sekvenser.
- Amplificere DNA ekstraheret fra PBMC (for at opnå den TREC-SJ, KRec-SJ og TCRAC fragmenter) med primere specifikke for TRECs, KRECs og TCRAC (se tabel 1).
| TRECs | fremad | 5'-AAA GAG GGC AGC FTT CTC CAA GGC-3 ' |
| omvendt | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 ' | |
| KRECs | fremad | 5'CCC AAG CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 ' |
| omvendt | 5'CCC AAG CTT GTG AGG GAC ACG KAG CC-3 ' | |
| TCRAC | fremad | 5'G ac tag TAT GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 ' |
| omvendt | 5'G ac tag TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 ' |
Tabel 1. Primere anvendt til kloning procedurer. Ved 5'-enden, med små bogstaver er vist nukleotider svarende til restriktionsenzymsites, mens i kursiv er vist tilføjes flankerende nukleotider.
- Udfør PCR-reaktioner i et slutvolumen på 25 pi, der består af 1x puffer II, 1,5 mM MgCI2, dNTP-blanding (200 pM hver), primere ved slutkoncentration på 900 nM, AmpliTaq DNA-polymerase (2,5 U / 25 pi), og 100 ng DNA.
- Brug følgende PCR-parametre: første trin ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 30 sek; 60 ° C i 30 sek; 72 ° C i 30 sek, og endelig 1 cyklus ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkt længder bør være: 380 bp for TRECs, 166 bp til KREC, 381 bp for TCRAC.
- Sæt PCR-produkt på TREC-SJ i TA acceptor site af pCR2.1-TOPO Vector. Omdan plasmid-DNA'et i XL1-blue kemisk kompetente celler ved hjælp af varme-shock efter protokollen tilvejebragt med cellerne. Blandt de kolonier, der vokser på grund af ampicillinresistens, identificere dem, der udfører indsatsen, som vil blive vist hvide på grund af tabt β-galactosidase komplementation, og pode dem ind i en mester fad. Endelig identificere kolonier indeholdende TREC fragment ved PCR.
- Udvid en af de identificerede kolonier og rense plasmid-DNA ved hjælp af et plasmid miniprep kit og følg producentens anvisninger. Fordøje plasmid-DNA og TCRAC amplificerede produkt med Spel restriktionsenzym og ligere TCRAC fragment i Spel-restriktionssted.
- Omdan plasmid-DNA'et i XL1-blue-celler og identificere de kolonier, der indeholder TCRAC fragment ved PCR. Udvid en af de identificerede kolonier og renseplasmid DNA under anvendelse af plasmid miniprep kit.
- Fordøje plasmid-DNA og KRec amplificerede produkt med HindIII og klone KRec-SJ fragment i HindIII restriktionssted. Omdan plasmid-DNA'et i XL1-blue-celler og identificere de kolonier, der indeholder det tredje fragment ved PCR.
- Kontroller, ved direkte sekventering tilstedeværelsen af de tre skær og fraværet af mutationer. Kortet over den endelige triple-insert plasmid er repræsenteret i figur 1.
Figur 1. Triple-insert plasmidkort. Triple-insert plasmid kort, der viser placeringen af TREC, KRec, TCRAC sekvenser og restriktionsenzymsteder. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
- Expand en af de identificerede kolonier oprense plasmid DNA under anvendelse af et plasmid midiprep kit. Bestem plasmid DNA-koncentration ved spektrofotometrisk vurdering ved 260/280 nm og DNA kvalitet ved gelelektroforese. Opbevar passende portioner af plasmidet ved -80 ° C (f.eks., 50 pi hver).
2. Standard Curve Forberedelse
BEMÆRK: Forbered alle fortyndinger i 0,1X TE buffer i et sted, der er specielt konstrueret til inddæmning af DNA fremførsel.
- Beregn massen af numrene plasmid kopi af interesse (se tabel 2), under hensyntagen til, at plasmidet størrelse er 4846 bp og at den gennemsnitlige masse pr bp er 1,096 x 10 -21 g / bp, og derfor: m p = ( 4846 bp) x (1,096 x 10 -21 g / bp) = 5,311.216 x 10 -21 g = 5,311 x 10 -18 g.
| Kopier # | x 5.311 x 10 -18 g | Masse af plasmid DNA (g) |
| 1 x 10 6 | 5.311 x 10 -12 |
| 1 x 10 5 | 5.311 x 10 -13 |
| 1 x 10 4 | 5.311 x 10 -14 |
| 1 x 10 3 | 5.311 x 10 -15 |
| 1 x 10 2 | 5.311 x 10 -16 |
Tabel 2. Masse af plasmid nødvendig for hver standard kurve fortynding punkt.
- Beregn koncentrationen af plasmid-DNA ved at dividere de nødvendige plasmid masser af volumen (5 pi), der skal pipetteres i hver reaktion (se tabel 3).
| Masse af plasmid DNA (g) | ÷ 5 pi | Slutkoncentration af plasmid DNA (g / pl) |
| 5.311 x 10 -12 | 1,062 x 10 -12 | |
| 5.311 x 10 -13 | 1,062 x 10 -13 | |
| 5.311 x 10 -14 | 1,062 x 10 -14 | |
| 5.311 x 10 -15 | 1,062 x 10 -15 | |
| 5.311 x 10 -16 | 1,062 x 10 -16 |
Tabel 3. Beregning af plasmid koncentrationer nødvendige for hver fortynding punkt.
- Optø en portion af plasmidet. Linearisere 2 ug af plasmid-DNA'et med XhoI og bestemme dens koncentration By spektrofotometrisk vurdering ved 260/280 nm.
- Klargør en korrekt fortynding af det lineariserede plasmid-DNA for at opnå en bekvem arbejder stamopløsning at starte fra (fx 100 ng / pl = 0,1 pg / pl = 1 x 10 -7 g / pl). Opbevar den resterende del af det lineariserede plasmid-DNA ved -80 ° C.
- Udfør en bekvem antal på 1:10 eller 1: 100 fortyndinger for at bringe plasmid på mere brugbar koncentration på 1 x 10 -10 g / pl.
- Brug formlen C 1 V 1 = C 2 V 2 at beregne fortyndingsvolumen (V 2 - V 1) er nødvendig for at forberede det første standardkurve punkt i serie (1 x 10 6 kopier svarende til 1,062 x 10 -12 g / 5 pi, se tabel 4).
| Initial konc. (G / pl) | Plasmid-DNA vol (ul) | Diluent vol (ul) | Final Vol. (Pi) | Slutkoncentration. (G / pl) | Endelig kopital af plasmid-DNA / 5 pi |
| C 1 | V 1 | V 2 -V 1 | V 2 | C2 | |
| 1 x 10 -7 | 5 pi | 45 pi | 50 pi | 1 x 10 -8 | N / A |
| 1 x 10 -8 | 5 pi | 495 pi | 500 pi | 1 x 10 -10 | N / A |
| 1 x 10 -10 | 5 pi | 465 pi | 470 pi | 1,062 x 10 -12 | 1 x 10 6 |
| 1,062 x 10 -12 | 50 pi | 450 pi | 500 pi | 1,062 x 10 -13 | 1 x 10 5 |
| 1,062 x 10 -13 | 50 pi | 450 pi | 500 pi | 1,062 x 10 -14 | 1 x 10 4 |
| 1,062 x 10 -14 | 50 pi | 450 pi | 500 pi | 1,062 x 10 -15 | 1 x 10 3 |
| 1,062 x 10 -15 | 50 pi | 450 pi | 500 pi | 1,062 x 10- 16 | 1 x 10 2 |
Tabel 4. Fortynding beregninger.
- Fortsæt med en række regelmæssige 01:10 fortyndinger for at få de resterende standardkurve point.
BEMÆRK: Glem ikke at vortex hvert plasmid fortynding kortvarigt, inden du udfører det næste.
BEMÆRK: Den højeste fortynding af stAndard kurve (10 kopier / 5 pi) skal fremstilles umiddelbart før udførelse af analysen, fordi en sådan lille mængde af plasmid-DNA ikke er stabil nok til at blive gemt til senere brug. - Opbevar triple-plasmid fortynding punkter ved -80 ° C i separate rør indtil anvendelse. Den fortyndede triple-plasmid-DNA er meget stabil i mindst 6 måneder.
3. DNA ekstraktion fra målstikprøver
- Separat PBMC fra perifert blod opsamlet i EDTA-rør ved hjælp af densitetsgradient separation metode.
BEMÆRK: Du kan også bruge andre passende udgangsmateriale (f.eks, sorteret lymfocytsubpopulationer, fuldblod) som target prøve. - Uddrag DNA fra PBMC prøver target som rapporteret i trin 1.2.
4. Real-time PCR til kvantificering af TRECs og KRECs
- Forberedelse Plate og læsning:
- Arranger en PCR-plade, herunder mindst to replikater for hver prøverskal analyseres: standardkurve (A → F 1 → 4), positiv kontrol (CTRL +; G1 → 4) og uden template-kontrol (NTC; H 1 → 4).
BEMÆRK: Overhold en typisk ordning i tabel 5, men kan oprettes forskellige formater. Husk, at TRECs og KRECs vil blive forstærket sammen i samme boringer, der er adskilt fra TCRAC.
- Arranger en PCR-plade, herunder mindst to replikater for hver prøverskal analyseres: standardkurve (A → F 1 → 4), positiv kontrol (CTRL +; G1 → 4) og uden template-kontrol (NTC; H 1 → 4).
| TRECs + KRECs a | TCRAC B | TRECs + KRECs | TCRAC | TRECs + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 10 6 eksemplarer | 10 6 eksemplarer | 10 6 eksemplarer | 10 6 eksemplarer | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| B | 10 5 eksemplarer | 10 5 eksemplarer | 10 5 eksemplarer | 10 5 eksemplarer | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 eksemplarer | 10 <sup> 4 eksemplarer | 10 4 eksemplarer | 10 4 eksemplarer | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | Kopier 10 3 | Kopier 10 3 | Kopier 10 3 | Kopier 10 3 | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| E | 10 2 eksemplarer | 10 2 eksemplarer | 10 2 eksemplarer | 10 2 eksemplarer | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 kopier | 10 kopier | 10 kopier | 10 kopier | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
Tabel 5. Eksempel real-time PCR-plade.
- Beregn det samlede antal brønde, der er nødvendige (inkluderer 1 - 2 ekstra brønde til at redegøre for eventuelle pipetteringsfejl) og forberede master mix for TRECs / KRECs og TCRAC i separate rør (se tabel 6).
BEMÆRK:. De primere og prober specifikke for TRECs, KRECs og TCRAC er nævnt i tabel 7 Primeren og sonde endelige koncentrationer er 900 nm og 200 nM.
- Beregn det samlede antal brønde, der er nødvendige (inkluderer 1 - 2 ekstra brønde til at redegøre for eventuelle pipetteringsfejl) og forberede master mix for TRECs / KRECs og TCRAC i separate rør (se tabel 6).
| TRECs / KRECs | TCRAC | ||
| H2O | 2 pi | H2O | 4.75 pi |
| KRECs til 20 pmol / pl | 1.125 pi | TCRAC for 20 pmol / pl | 1.125 pi </ Td> |
| KRECs rev 20 pmol / pl | 1.125 pi | TCRAC rev 20 pmol / pl | 1.125 pi |
| KRECs proben 10 pmol / pl | 0,5 pi | TCRAC proben 10 pmol / pl | 0,5 pi |
| TRECs for 20 pmol / pl | 1.125 pi | 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12,5 pi |
| TRECs rev 20 pmol / pl | 1.125 pi | ||
| TRECs proben 10 pmol / pl | 0,5 pi | ||
| 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12,5 pi | ||
Tabel 6. Mængden af reagenser, der er nødvendige for de angivne brønde.
| TRECs | fremad | 5'-CAC ATC FTT TTC AAC CAT GCT-3 ' |
| omvendt | 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 ' | |
| sonde | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 ' | |
| KRECs | fremad | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3 |
| omvendt | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 ' | |
| sonde | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | fremad | 5'-TGG CCT AAC FTT GAT FTT CTT-3 ' |
| omvendt | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| sonde | 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 ' |
Tabel 7. Sekvens af primer og prober til real-time PCR assay.
- Tilføj 20 pi af hver blanding (TRECs / KRECs og TCRAC). Før du forlader reagensklargøring værelse, forsegle reaktionen pladen med en optisk selvklæbende cover.
- I en nukleinsyre ekstraktion, elevator klæbemidlet og tilsæt 5 pi af genomisk DNA-prøve (400-500 ng) til brøndene. Tilsæt 5 pi genomisk DNA (dvs. fremstillet af PBMC opnået fra navlestrengsblod) til Ctrl + brønde.
BEMÆRK: Som alternativ til navlestrengsblod bruge DNA fra den samme kendte, positive blodprøve perifert eller pulje af prøver, eller forberede en "kunstig" positive standard ved at blande en bestemt mængde af triple-insert plasmid med genomisk DNA fra TREC- og KRec-negative cellelinjer. - Tilsæt 5 pi vand til NTC brønde. Seal reaktionen pladen igen med optisk klæbemiddel dækslet.
- Flyt til et sted, sikrer inddæmning af plasmid-DNA fremførsel; tø hver fortynding point af plasmid-DNA'et standardkurve kun før brug og forberede den højeste fortynding (10 kopier / 5 pi). Løft limen dækker kun fra A → H 1 → 4 brønde og tilsættes 5 pi hvert punkt fortynding af plasmid-DNA standardkurve. Forsegl klæbende dækslet igen.
- Kontroller fravær af bobler på bunden af brøndene, og dermed sikre, at reagenserne er placeret nederst.
- Kør analysen på en real-time PCR-system. Den standardprotokol består af første trin ved 50 ° C i 2 min, en indledende opvarmning ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 45 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 15 sek, og en kombineret primer / probe-annealing og forlængelse ved 60 ° C i 1 min.
- Gem data ved slutningen af PCR-programmet.
BEMÆRK: For at undgå DNA krydsforurening, husk: at følge de sædvanlige gode anbefalinger laboratoriepraksis for kvantitativ PCR ved oprettelsen af real time PCR assay: anvende separate områder / lokaler til nukleinsyre udvinding,reagensklargøring plasmid manipulation, amplifikationsreaktion; anvende separate pipette sæt; Skift handsker / frakker er relevant.
- Resultater og beregning:
BEMÆRK: Følgende trin er baseret på vores erfaringer ved hjælp af den software, der leveres med real-time PCR instrument nævnt i Materials Table, men generelt, bør de gælde for andre realtids-PCR analyse platforme og software. Husk, at selv hvis du bruger den samme software, som regel er der mere end én måde at udføre de nødvendige kommandoer (f.eks, ikoner, genveje).- Åbn den gemte resultat filen i softwaren, og klik på fanebladet "Results". På toppen af vinduet, skal du klikke på "Analyser" menuen og vælg "Analyse indstillinger". Lad softwaren bestemme tærsklen automatisk ved at vælge "Alle" detektorer og "Auto Ct" (Ct = tærskel cyklus. Lad software sæt "Automatic Baseline"; for baggrunden elimination som standard.
- Klik på fanebladet med navnet "Forstærkning Plot", og på den yderste højre del af vinduet, skal du vælge en af de tre "detektorer" i den tilsvarende rullemenu (f.eks starte med TRECs). Lige under, skal du vælge "Manuel Ct" til manuelt at indstille en grænse; gå til den nedre del af vinduet, og vælg brøndene svarende til standardkurven fortynding punkter af den valgte detektor for at vise amplifikationsprodukterne plots. For at gøre dette skal du blot klikke og trække musen over de tilsvarende celler i tabellen.
- For at justere tærsklen manuelt, skal du trække den røde tærskel linje op og ned, og derefter klikke på "Analyze" for at reanalyze resultater. For at kontrollere, hvordan indstillingen tærsklen påvirker resultaterne, skal du vælge "Report" fanen, og se den deraf Ct af de respektive standardkurve fortynding point. Ved flytning af grænsen, så prøv at overholde følgende anbefalinger for at få en optimal placering.
- Gå tilbage til fanen "Amplification Plot", og kontrollere, at tærsklen er i et område af eksponentiel forstærkning tilstrækkeligt over baggrundsstøjen, men under plateaufasen. Hvis forstærkningen plot ikke er vist i logaritmisk skala, skal du højreklikke på grunden til at huske de "Graph Settings" og sæt Y-aksen indstilling post-køre som "log", sætte tærsklen halvvejs i den lineære del af plot, og observere forstærkning kurver omtrent parallelt med hinanden.
- Klik på "Rapport" fanen for at se resultaterne Ct. Sørg for, at tærsklen placering givet resultater, som maksimerer nøjagtigheden af de to gentagelser af hver standardkurve fortynding point.
- Kontroller, at tærsklen er placeret på det sted, som bedst afspejler ekstreme størrelsesordener af standardkurven fortynding punkter (optimal følsomhed). Gentag trin 4.2.2 og de resterende undertrin for de resterende to detektorer (KRECs og TCRAC).
- Gå til fanen Rapport træk musen igen i tabellen i den nederste del af vinduet for at vælge de felter, der svarer til brøndene i standardkurven for alle detektorer (TRECs, KRECs, TCRAC). Kontroller, at den deraf Ct af de tre mål er meget ens med den samme fortynding punkter (f.eks forskel ikke mere end 0,5 Ct). Juster tærskler, hvis nødvendigt og re-check.
BEMÆRK: Da den triple-insert plasmid indeholder en enkelt kopi af hvert mål, og derfor forstærkningen forholdet burde teoretisk være tæt på 1: 1: 1. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt manuelt at justere også udgangspunktet for en eller flere af detektorerne for at få bedre resultater. Bare huske "Analyse indstillinger" vinduet, skal du vælge detektoren for der er behov for justering, derefter indstille "Manuel Baseline", og indsætte brugerdefinerede værdier for start og slut Cycles (normalt 3 til 15). Klik derefter på "OK & Analysér igen" igen og igen foregående punkter. - Accepter den eksperimentelle session, efter at kontrollere følgende:
- Klik på "Rapport" fanen, skal du gå til den nederste del af vinduet, skal du vælge NTC brønde og kontroller, at den tilsvarende Ct er "Undet" (dvs. ingen forstærkning er til stede i NTC brønde).
- Vælg fanebladet "Standard Curve", og ser til højre af plottet vinduet; Vælg detektorer fra drop-down menuen og se, om den rapporterede standardkurven hældning ligger mellem -3,55 og -3,32 (svarende til PCR effektivitetsgevinster af 91 - 100%)
- Sørg for, at determinationskoefficienten (R2) er højere end 0,998 (figur 2), ved at læse sin værdi lige under hældning og skæringspunkt (i samme fane "Standard Curve", efter at have valgt hver detektor).
BEMÆRK: Vær opmærksom på de ekstreme fortynding punkter, da deres forskydning kan påvirke hældningen lettere (de har en høj "leveraseri "effekt på regressionslinien). Især huske på, at den højeste plasmidet fortynding kan forringe hurtigere end forventet. , Når det er muligt er det imidlertid hensigtsmæssigt ikke at kassere dem, fordi en rationel tilgang kan være at overveje 100 som grænsen for kvantitativ påvisning med andre ord, for prøver mellem 10 og 100, kan resultatet rapporteres som <100 eller "positiv , men ikke kvantificerbar ", mens hvis udenfor kurven område (<10) kan det indberettes som 0 eller" målbart ".
BEMÆRK: Det kan være nyttigt at holde et arkiv af Ct-værdier fra tidligere standardkurve fortyndinger, for at beregne en gennemsnitsværdi for hver fortynding punkt, der skal holdes som en slags optimal "reference" rækkevidde eller intern kvalitetskontrol for fremtidige eksperimenter (fx beregne middelværdi og SD til at bygge herunder Shewhart kontrol diagrammer). Analogt kan det være nyttigt at holde et arkiv over fortidens Ct af den positive kontrol.
Figur 2. Standard kurver for TRECs, KRECs og TCRAC. Plots af standardkurven point og log-regressionslinje estimater for TRECs (A), er KRECs (B), og TCRAC (C) bygget til at kontrollere overholdelsen af den ideelle eksponentiel forstærkning rate (hældning = 3,32), som ville svare til en effektivitet på 100%. Ct: tærskel cyklus; R2:. Regression determinationskoefficienten Klik her for at se en større udgave af dette tal.- Klik på "Rapport" fanen og kontrollere, at Ct af den positive kontrol (findes i de tilsvarende celler i tabellen under diagrammet) er i overensstemmelse med resultaterne af de tidligere analyser på samig kendt positiv kontrol.
BEMÆRK: "Rapport" fanen viser mængden af TRECs, KRECs og TCRAC af prøverne, der testes, at softwaren er beregnet ved interpolation fra den respektive standard optegnes ved Ct-værdier opnået efter tærsklen og baseline er blevet korrekt sat (en ny analyse med en ny tærskel / baseline ville ændre disse resultater). For at se, hvor interpolation foregår på standardkurven, vælge fanen "Standard Curve", og vælg derefter de ønskede brønde, og se efter det sorte "X" vises på regressionslinjen. Deres y-aksen angiver den interpolerede mængde. Hvis du bruger altid den samme positive kontrol, kan passende referenceområder og / eller kvalitetskontrol diagrammer bygges, baseret på tidligere værdier bestemt på den positive kontrol.
- Klik på "Rapport" fanen og kontrollere, at Ct af den positive kontrol (findes i de tilsvarende celler i tabellen under diagrammet) er i overensstemmelse med resultaterne af de tidligere analyser på samig kendt positiv kontrol.
- Klik på menuen "Filer", "Gem", og derefter "Export" til en .csv-fil til at eksportere de mængder af alle brønde i en text fil med kommaseparerede værdier.
- Importer the.csv filen i et regneark software og beregne antallet af TRECs eller KRECs pr 10 6 PBMC ved at sætte følgende formel passende: [(gennemsnitlig mængde TRECs eller KRECs) / (gennemsnitlig mængde TCRAC / 2)] x 10 6
BEMÆRK: Den gennemsnitlige mængde TCRAC divideres med 2, fordi i hver celle er der to TCRAC genkopier, f.eks, en for hvert kromosom.
BEMÆRK: sammenhæng i endelige antal TRECs og KRECs af den positive kontrol kan betragtes, men husk på, at værdier ikke perfekt vil matche på grund af den ekstra variation af standardkurven fortynding point. I tilfælde af grov divergens, kan forsøget skal gentages. Igen kan kontrolkort være bygget til at fastsætte en passende referenceområde. - (Valgfrit, men anbefales) Hvis resultaterne af den komplet blodtælling er til rådighed, beregne TRECs eller KRECs pr ml blod ved hjælp af følgende formel:
TRECs eller KRECs per 1 x 10 6) x (lymfocyt + monocyt tæller i 1 ml blod) / 10 6 = kopier / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen blev udført i et repræsentativt udsnit af 87 raske kontrolpersoner: 42 børn i alderen 0-17 (mand / kvinder: 25/17) og 45 voksne i alderen 24-60 (hanner / hunner: 29/16). Resultaterne blev opnået som TRECs og KRECs pr 10 6 PBMC, og derefter TRECs og KRECs pr ml blod blev beregnet.
Antallet af TRECs falder med alderen pga thymusinvolution, 4 især i en meget skarp måde fra 0 til 3 - 4 år. Hos voksne er TREC nummer afhænger også af køn, fordi det nedsætter hurtigere hos mænd end hos kvinder. 5 Dette kan skabe problemer i fastsættelse af passende referenceområder, der bør være differentieret på grundlag af alder og eventuelt køn, hvis en meget præcis estimering af normalitet er nødvendig.
Figur 3. TREC kvantificering i sund do Nors. Mængden af TRECs blev bestemt som TRECs / 10 6 celler i raske børn (A) og voksne (B) og derefter beregnet som TRECs / ml i de samme emner (C, D). Klare kredse: Kvinder; udfyldte cirkler: hanner. Lines blev opnået ved lineær regression under anvendelse af log-transformerede data. Hos børn blev to regressionslinier monteret bedre repræsentere den variable rente i TREC falde med alderen. Hos voksne udgør stiplede linier udviklingen i faldet med alder TRECs hos kvinder, der er langsommere end hos mænd (kontinuerlig linje). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Antallet af KRECs falder med alderen med et mønster der ligner TRECs kun hos børn, mens knoglemarven produktion i de voksne, er nogenlunde stabilt gennem hele livet, og er ikke afhængig af køn.
_content "FO: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 4:. KRec kvantificering hos raske donorer Mængden af KRECs blev bestemt som KRECs / 10 6 celler i raske børn (A) og voksne (B) og derefter beregnet som KRECs / ml i de samme emner (C, D). Klare kredse: Kvinder; udfyldte cirkler: hanner. Lines blev opnået ved lineær regression under anvendelse af log-transformerede data. Hos børn blev to regressionslinier monteret bedre repræsentere den variable rente på KRec falde med alderen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Til repræsentative formål, simple log-lineære regressionsmodeller var monteret for at skildre det mønster af TREC / KRec falde med alderen, men mere raffinerede ikke-lineære modeller kan monteres in et forsøg på bedre at forudsige den tilsyneladende eksponentiel KRec / TREC falde med alderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
