Introduction
חוגי כריתת קולט T-cell (TRECs) וחוגי כריתת רקומבינציה מחיקה-K (KRECs) הם מרכיבי DNA circularized קטנים שהם נכרת בשיעור של T- ותאי- B, בהתאמה, במהלך תהליך רקומבינציה הדנ"א הגנומי, שהובילו ל היווצרות של רפרטואר מגוון מאוד של T- וקולטנים B-cell. אין להם פונקציה, אלא משום שהם יציבים ולא ניתן לשכפל, הם מדוללים לאחר כל חלוקת תא, ובכך מתמידים רק באחת משני התאים הבת. לכן, רמותיהם בדם ההיקפי ניתן להניח כאומדן של תפוקת מח הרתי ועצם.
בעוד assay TREC כבר בשימוש במידה רבה ב -15 השנים האחרונות על מנת להעריך את היקף תפוקת הרתי, 1 assay KREC, שבמקור פותח כדי למדוד התפשטות B-cell ותרומתה להומאוסטזיס B-cell בבריאות ובחוליים, 2 הוצע רק לאחרונה כסמן של עצם מ 'חץ תפוקה. 3,4 כאן, אנו מתארים את השיטה שפיתחנו עבור הכימות בו זמנית של שני TRECs וKRECs. 4
בשיטה משולבת זו, שונות הקשורים לכימות DNA על ידי בזמן אמת PCR מתבטל על ידי השימוש בעקומת סטנדרט ייחודי שהושגה על ידי דילול פלסמיד משולש להוסיף מכיל שברי TRECs, KRECs וקבוע אלפא קולטן T-cell (TCRAC) גן ביחס של 1: 1: 1. זה מאפשר הערכה מדויקת יותר של עותק מספר TREC וKREC. יתר על כן, הכימות בו זמנית של שתי מטרות באותה התגובה מאפשר הפחתת עלויות מגיב.
Assay TREC / KREC המוצע יכול להיות שימושי כדי למדוד את היקף T- והניאו-ייצור B-cell בילדים או מבוגרים עם חמור משולב כשל חיסוני (SCID), 4 כשל חיסוני נפוץ משתנה, 5 מחלות אוטואימוניות, 6-8 והידבקות ב- HIV . 9 יתר על כן, ניתן להשתמש בו ללפקח על ההתאוששות החיסונית לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic, 10 אנזימים חלופיים, 11 ו -9 אנטי או אימונומודולטוריים טיפולים. 6-8 לבסוף, משום שחולי SCID מוכרים באמצעות assay TREC למרות הפגמים הגנטיים הבסיסיים, וagammaglobulinemia ניתן לזהות מטופלים באמצעות כימות KREC , Assay TREC / KREC יכול לשמש גם כדי לזהות כשלים חיסוניים, בתוכניות הקרנת יילוד. 12 במקרה זה, הבדיקה חייבת להתבצע על DNA שחולץ מכתמים קטנים של דם מחק ויבשה על נייר סינון, חייב להיות רגיש וספציפי למאוד המחלות היעד, כמו גם אפקטיבי עלות לשחזור ומאוד.
כניסתה של כימות KREC במבחן צריכה לשפר את הביצועים של הקרנת יילוד לחסרים חיסוניים, אשר באופן שיגרתי שבוצעו בחלקים מסוימים של ארה"ב (WI, MA, CA) מאז 2008, כאשר ויסקונסין היה ראשון שintroducדואר ניתוח TRECs בתכנית ההקרנה לאחר לידתה. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה:: הערה פרוטוקול זה כדלקמן ההנחיות של מוסדנו, Spedali Civili di Brescia
1. הכנת "Triple-הוספה" פלסמיד
- בחירה והכנת החומר מתאים התחלה:
- להשיג מדגם המכיל תאים מאוד סביר להניח שתהיה לי TRECs וKRECs לזיהוי על ידי PCR, כגון דם היקפי של נושא צעיר ובריא שנאסף לתוך צינורות EDTA.
הערה: במקור, שפתחנו את השיטה באמצעות thymocytes לTRECs ותאי mononuclear מברי שקדים לKRECs, אבל בדרך כלל יש לי נבדקים בריאים סכום של TRECs וKRECs מספיק כדי לאפשר זיהוי שלהם על ידי PCR. לכן, דם היקפי צריך להיות אלטרנטיבה חוקית, קלה יותר לקבל ולעבוד איתו. בהתחשב בכך שTRECs, בפרט, ירידה עם גיל במבוגרים בריאים, דם היקפי ממבוגרים צעירים, אם לא מילדים, מומלץ. - mononuc דם ההיקפי נפרדתאי ליר (PBMC) בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות סטנדרטית.
- להשיג מדגם המכיל תאים מאוד סביר להניח שתהיה לי TRECs וKRECs לזיהוי על ידי PCR, כגון דם היקפי של נושא צעיר ובריא שנאסף לתוך צינורות EDTA.
- מיצוי DNA:
- לחלץ DNA מPBMC באמצעות ערכת DNA דם Mini מסחרית. בצע את הוראות היצרן עם כמה השינויים מתוארים להלן.
- דגירה הדגימות ב 70 ° C (C במקום 56 מעלות) במשך 10 דקות באמצעות שייקר-חממה ב1,400 סל"ד.
- הוסף את חיץ elution מחומם על 70 מעלות צלזיוס לעמודה, דגירה של 5 דקות על 70 מעלות צלזיוס וelute DNA על ידי צנטריפוגה לפי הוראות יצרן. קבע את ריכוז ה- DNA שחולץ על ידי הערכת spectrophotometric ב260/280 ננומטר.
- לחלץ DNA מPBMC באמצעות ערכת DNA דם Mini מסחרית. בצע את הוראות היצרן עם כמה השינויים מתוארים להלן.
- הכנת פלסמיד המכיל מוסיף של מפרקי TREC וKREC אות (SJ) וגן התייחסות TCRAC:
- להגביר את ה- DNA שחולץ מן PBMC (להשיג TREC-SJ, KREC-SJ, ושברי TCRAC) עם פריימרים ספציפיים לTRECs, KRECs וTCRAC (ראה טבלה 1).
הערה: ב5'-הסוף, פריימרים KREC- וTCRAC הספציפיים להכיל אתרי הגבלת HindIII וSpeI (במקרה נמוך יותר ברצפים מוצגים טבלת 1) עם מספר מתאים של איגוף נוקלאוטידים נוספים (מצויינים בנטוי); שני התכונות אינן נוכחים ברצפי KREC וTCRAC הקנונים.
- להגביר את ה- DNA שחולץ מן PBMC (להשיג TREC-SJ, KREC-SJ, ושברי TCRAC) עם פריימרים ספציפיים לTRECs, KRECs וTCRAC (ראה טבלה 1).
| TRECs | קדימה | 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 " |
| הפוך | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 " | |
| KRECs | קדימה | 5'- CCC AAG CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 " |
| הפוך | 5'- CCC AAG CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 " | |
| TCRAC | קדימה | 5'- תג ac G ACT טאט GAG ACC GTGTGC CAG-3 " |
| הפוך | 5'- תג ac G TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 " |
Primers 1. לוח המשמש לנהלי השיבוט. ב5'-הסוף, באותיות קטנות מוצגים נוקלאוטידים המתאימים לאתרי אנזים הגבלה, ואילו בכתב נטוי מוצגים הוסיפו איגוף נוקלאוטידים.
- לבצע PCR תגובות בנפח סופי של 25 μl, בהיקף של 1x הצפת השני, 1.5 מ"מ MgCl 2, תערובת dNTP (200 מיקרומטר כל אחד), פריימרים בריכוז הסופי של 900 ננומטר, AmpliTaq DNA פולימראז (2.5 U / 25 μl), ושל DNA 100 ng.
- השתמש בפרמטרים הבאים PCR: הצעד ראשון על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 60 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולבסוף 1 מחזור של 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אורכי מוצר ה- PCR צריכים להיות: 380 נ"ב לTRECs, 166 נ"ב לKRECs, 381 נ"ב לTCRAC.
- הכנס את מוצר ה- PCR של TREC-SJ באתר acceptor ת"א של וקטור pCR2.1-TOPO. להפוך את ה- DNA פלסמיד בתאים כימי מוסמכים כחולים-XL1 על ידי חום-הלם בעקבות הפרוטוקול שמצורף לתאים. בין המושבות לגדול כי בשל התנגדות אמפיצילין, לזהות את אלה שסוחבים את הכנס, אשר יופיע לבן בגלל שלמת β-galactosidase איבד, ולחסן אותם לתוך צלחת אדון. לבסוף, לזהות מושבות המכילות את קטע TREC על ידי PCR.
- להרחיב אחת מהמושבות המזוהות ולטהר את ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת miniprep פלסמיד ולעקוב אחר ההוראות של היצרן. לעכל את ה- DNA פלסמיד והמוצר המוגבר TCRAC עם אנזים הגבלת SpeI ולקשור את בר TCRAC לאתר הגבלת SpeI.
- להפוך את ה- DNA פלסמיד בתאים כחולים-XL1 ולזהות את המושבות המכילות את קטע TCRAC על ידי PCR. להרחיב אחת מהמושבות שזוהו ולטהר פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת miniprep פלסמיד.
- לעכל את ה- DNA פלסמיד ומוצר KREC המוגבר עם HindIII ולשכפל את בר KREC-ש"י באתר הגבלת HindIII. להפוך את ה- DNA פלסמיד בתאים כחולים-XL1 ולזהות את המושבות המכילות את הקטע השלישי על ידי PCR.
- ודא, על ידי רצף ישיר, נוכחותם של שלושה מוסיף והיעדרן של מוטציות. המפה של פלסמיד משולש להוסיף הסופי מיוצגת באיור 1.
איור 1. Triple-להכניס פלסמיד המפה. מפת פלסמיד Triple-להכניס מראה את המיקום של רצפי TREC, KREC, TCRAC ואתרי אנזים הגבלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- rt = "3">
- להרחיב אחת מהמושבות המזוהות, לטהר את ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת midiprep פלסמיד. קבע את ריכוז ה- DNA פלסמיד על ידי הערכת spectrophotometric ב260/280 ננומטר ואיכות DNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה. אחסן aliquots המתאים של פלסמיד ב -80 ° C (לדוגמא., 50 μl כל אחד).
2. תקן Curve הכנה
הערה: הכן את כל דילולים במאגר 0.1x TE במקום שתוכנן במיוחד לבלימה של לשאת על ה- DNA.
- לחשב את המסה של מספרי עותק פלסמיד של עניין (ראה טבלה 2), תוך לקיחה בחשבון כי גודל פלסמיד הוא 4846 נ"ב ושהמסה הממוצעת לנ"ב היא 1.096 x 10 -21 g / נ"ב, ולכן: דקות p = ( x 4846 נ"ב) (1.096 x 10 -21 g / נ"ב) = 5,311.216 x 10 -21 g = 5.311 x 10 -18 גר '.
| # העתקה | x 5.311 x 10 -18 g | מסה של DNA פלסמיד (ז) |
| 1 x 10 6 | 5.311 x 10 -12 | |
| 1 x 10 5 | 5.311 x 10 -13 | |
| 1 x 10 4 | 5.311 x 10 -14 | |
| 1 x 10 3 | 5.311 x 10 -15 | |
| 1 x 10 2 | 5.311 x 10 -16 |
Mass 2. הטבלה של פלסמיד הנדרש לכל נקודת דילול עקומה סטנדרטית.
- לחשב את הריכוזים של DNA פלסמיד על ידי חלוקת המוני פלסמיד הנדרשים על ידי הנפח (μl 5) להיות pipetted לכל תגובה (ראה טבלה 3).
| מסה של DNA פלסמיד (ז) | ÷ 5 μl | ריכוז סופי של ה- DNA פלסמיד (ז / μl) |
| 5.311 x 10 -12 | 1.062 x 10 -12 | |
| 5.311 x 10 -13 | 1.062 x 10 -13 | |
| 5.311 x 10 -14 | 1.062 x 10 -14 | |
| 5.311 x 10 -15 | 1.062 x 10 -15 | |
| 5.311 x 10 -16 | 1.062 x 10 -16 |
חישוב 3. שולחן של ריכוזי פלסמיד הנדרשים לכל נקודת דילול.
- להפשיר aliquot של פלסמיד. Linearize 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד עם XhoI ולקבוע b הריכוז שלההערכת spectrophotometric y ב260/280 ננומטר.
- הכן דילול נכון של DNA פלסמיד לינארית על מנת להשיג פתרון מניות עובד נוח להתחיל מ( למשל, 100 ng / μl = 0.1 מיקרוגרם / μl = 1 x 10 -7 g / μl). אחסן את שארית DNA פלסמיד לינארית ב -80 ° C.
- לבצע מספר נוח של 1:10 או 1: 100 דילולים להביא פלסמיד בריכוז מעשי יותר של 1 x 10 -10 g / μl.
- השתמש בנוסחא C 1 V 1 = C 2 V 2 כדי לחשב את דילול הנפח (V 2 - V 1) לצורך להכין את נקודת עקומת הסטנדרט הראשונה בסדרה (1 x 10 6 עותקים, מתאים 1.062 x 10 -12 g / 5 μl; ראה טבלה 4).
| קונצרט כלשהו ראשוני. (ז / μl) | כרך פלסמיד דנ"א (μl) | Dilueכרך NT (μl) | כרך אחרון. (Μl) | קונצרט כלשהו סופי. (ז / μl) | מספר עותק הסופי של ה- DNA פלסמיד / 5μl |
| C 1 | V 1 | V 2 -V 1 | V 2 | C 2 | |
| 1 x 10 -7 | 5 μl | 45 μl | 50 μl | 1 x 10 -8 | N / A |
| 1 x 10 -8 | 5 μl | 495 μl | 500 μl | 1 x 10 -10 | N / A |
| 1 x 10 -10 | 5 μl | 465 μl | 470 μl | 1.062 x 10 -12 | 1 x 10 6 |
| 1.062 x 10 -12 | 50 μl | 450 μl | 500 μl | 1.062 x 10 -13 | 1 x 10 5 |
| 1.062 x 10 -13 | 50 μl | 450 μl | 500 μl | 1.062 x 10 -14 | 1 x 10 4 |
| 1.062 x 10 -14 | 50 μl | 450 μl | 500 μl | 1.062 x 10 -15 | 1 x 10 3 |
| 1.062 x 10 -15 | 50 μl | 450 μl | 500 μl | 1.062 x 10 16 | 1 x 10 2 |
לוח 4. חישובי דילול.
- להמשיך עם סדרה קבועה של דילולים 1:10 להשיג נקודות עקומת סטנדרט שנותרו.
הערה: אל תשכחי מערבולת דילול כל פלסמיד לזמן קצר לפני הביצוע הבא.
הערה: הדילול הגבוה ביותר של standard עקומה (10 עותקים / 5 μl) חייב להיות מוכן רק לפני ביצוע assay, כי כמות כה קטנה של DNA פלסמיד היא לא יציבה מספיק כדי להיות מאוחסן לשימוש עתידי. - אחסן את נקודות הדילול המשולש פלסמיד ב -80 ° C בצינורות נפרדים עד לשימוש. DNA המשולש פלסמיד המדולל הוא מאוד יציב במשך לפחות 6 חודשים.
3. הפקת DNA מדוגמאות היעד
- PBMC הנפרד מהדם היקפי שנאסף לתוך צינורות EDTA בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות.
הערה: לחלופין, להשתמש בחומר המוצא מתאים אחר (לדוגמא, מסודרים על תת-אוכלוסיות לימפוציטים, כל דם) כמו לדוגמא היעד. - לחלץ את ה- DNA מPBMC של דגימות יעד כפי שדווח בשלב 1.2.
4. בזמן אמת PCR לכימות TRECs וKRECs
- הכנת צלחת וטעינה:
- לסדר צלחת PCR כולל לפחות שתי חזרות לכל דגימותלהיות מנותח: עקומת סטנדרט שליטה (→ F 1 → 4), חיובית (CTRL +; G1 → 4) ולא על תבנית שליטה (NTC; H 1 → 4).
הערה: שים לב לתכנית טיפוסית בטבלה 5, אבל יכולים להיות שנוצרו בפורמטים שונים. זכור כי TRECs וKRECs יהיו מוגבר יחד באותו בארות, שונות מאלה של TCRAC.
- לסדר צלחת PCR כולל לפחות שתי חזרות לכל דגימותלהיות מנותח: עקומת סטנדרט שליטה (→ F 1 → 4), חיובית (CTRL +; G1 → 4) ולא על תבנית שליטה (NTC; H 1 → 4).
| TRECs + KRECs | TCRAC ב | TRECs + KRECs | TCRAC | TRECs + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 10 6 עותקים | 10 6 עותקים | 10 6 עותקים | 10 6 עותקים | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 | |
| B | 10 5 עותקים | 10 5 עותקים | 10 5 עותקים | 10 5 עותקים | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 עותקים | 10 <sup> 4 עותקים | 10 4 עותקים | 10 4 עותקים | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | 10 3 עותקים | 10 3 עותקים | 10 3 עותקים | 10 3 עותקים | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| E | 10 2 עותקים | 10 2 עותקים | 10 2 עותקים | 10 2 עותקים | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 עותקים | 10 עותקים | 10 עותקים | 10 עותקים | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
צלחת טבלה 5. לדוגמא בזמן אמת PCR.
- לחשב את המספר הכולל של בארות צורך (כולל 1-2 בארות נוספות כדי להסביר שגיאות pipetting אפשריות) ולהכין את תערובת אב TRECs / KRECs וTCRAC בצינורות נפרדים (ראה לוח 6).
הערה:. ריכוזים סופיים פריימרים והבדיקות ספציפיים לTRECs, KRECs וTCRAC מוזכרים בלוח 7 פריימר ולחקור הם 900 ננומטר ו -200 ננומטר, בהתאמה.
- לחשב את המספר הכולל של בארות צורך (כולל 1-2 בארות נוספות כדי להסביר שגיאות pipetting אפשריות) ולהכין את תערובת אב TRECs / KRECs וTCRAC בצינורות נפרדים (ראה לוח 6).
| TRECs / KRECs | TCRAC | ||
| H 2 O | 2 μl | H 2 O | 4.75 μl |
| KRECs במשך 20 pmol / μl | 1.125 μl | TCRAC במשך 20 pmol / μl | 1.125 μl </ Td> |
| KRECs rev 20 pmol / μl | 1.125 μl | TCRAC rev 20 pmol / μl | 1.125 μl |
| 10 pmol / μl בדיקה KRECs | 0.5 μl | 10 pmol / μl בדיקה TCRAC | 0.5 μl |
| TRECs במשך 20 pmol / μl | 1.125 μl | 2x TaqMan יוניברסל PCR מיקס מאסטר | 12.5 μl |
| TRECs rev 20 pmol / μl | 1.125 μl | ||
| 10 pmol / μl בדיקה TRECs | 0.5 μl | ||
| 2x TaqMan יוניברסל PCR מיקס מאסטר | 12.5 μl | ||
כרך 6. טבלה של חומרים כימיים הדרושים לבארות מצויינים.
| TRECs | קדימה | 5'-CACCAT AAC TC CCT TTC GCT-3 " |
| הפוך | 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC-3 " | |
| בדיקה | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-טמרה-3 " | |
| KRECs | קדימה | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3 |
| הפוך | AGT-3 5'-AGG TAG AGC CAG CTC TTA CCC " | |
| בדיקה | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-טמרה-3 | |
| TCRAC | קדימה | 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 " |
| הפוך | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| בדיקה | 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-טמרה-3 " |
רצף 7. שולחן של פריימר ובדיקות למחשב בזמן אמתassay R.
- הוסף 20 μl של כל ערבוב (TRECs / KRECs וTCRAC). לפני שעזבתי את חדר הכנת המגיב, לאטום את צלחת התגובה עם כיסוי דבק אופטי.
- בחדר חילוץ חומצות גרעין, הרם את כיסוי הדבק ולהוסיף 5 μl של מדגם הגנומי DNA (400 - 500 ng) לבארות. הוסף 5 μl של הדנ"א הגנומי (כלומר, שהוכן מPBMC מתקבל מהדם חבל טבור) לבארות CTRL +.
הערה: כחלופה לדם טבורי, להשתמש DNA מאותו, המדגם הידוע החיובי הדם ההיקפי או הבריכה של דגימות, או להכין סטנדרטי חיובי "מלאכותי" על ידי ערבוב סכום קצוב פלסמיד משולש להכניס את עם הדנ"א הגנומי מTREC- ושורות תאי KREC-שליליות. - הוסף 5 μl מים לבארות NTC. חותם את צלחת התגובה שוב עם כיסוי הדבק האופטי.
- לעבור למקום להבטיח בלימה של לשאת על פלסמיד דנ"א; להפשיר כל poin דילולt של העקומה סטנדרטי פלסמיד דנ"א לפני השימוש בלבד ולהכין את הדילול הגבוה ביותר (10 עותקים / 5 μl). הרם את מכסה הדבק רק מ1 → 4 בארות H → ולהוסיף 5 μl של דילול כל נקודה של עקומה סטנדרטית פלסמיד דנ"א. לאטום את מכסה הדבק שוב.
- ודא היעדר בועות על החלק התחתון של הבארות, ובכך להבטיח שהחומרים הכימיים ממוקמים בתחתית.
- הפעל את assay במערכת PCR בזמן אמת. הפרוטוקול הסטנדרטי מורכב מהצעד הראשון על 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, חימום ראשוני על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 45 מחזורים של denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ופריימר / חישול בשילוב בדיקה והתארכות ב C ° 60 דקות 1.
- לשמור את הנתונים בסוף תכנית ה- PCR.
הערה: כדי למנוע זיהום צולב DNA, לזכור: לבצע את ההמלצות בפועל מעבדה טובות הרגילות לPCR כמו בעת ההגדרה זמן אמת assay PCR: להשתמש באזורים / חדרים נפרדים להפקת חומצות גרעין,הכנת מגיב, מניפולציה פלסמיד, תגובת הגברה; משתמש סטי פיפטה נפרדים; לשנות כפפות / מעילים כמתאימים.
- תוצאות וחישוב:
הערה: השלבים הבאים מבוססים על הניסיון שלנו באמצעות התוכנה המסופקת עם המכשיר בזמן אמת PCR מוזכר בלוח חומרים, אבל, באופן כללי, הם צריכים לפנות לפלטפורמות אחרות בזמן אמת ניתוח PCR ותוכנות. זכור כי, גם אם משתמש באותה תוכנה, בדרך כלל יש יותר מדרך אחת לבצע את הפקודות הנדרשות (לדוגמא, סמלים, קיצורי דרך).- פתח את קובץ התוצאה שנשמר בתוכנה ולחץ על הלשונית "תוצאות". בחלק העליון של החלון, לחץ על תפריט "ניתוח" ובחר באפשרות "הגדרות ניתוח". בוא התוכנה לקבוע את הסף באופן אוטומטי על ידי בחירה "הכל" הגלאים ו( המחזור = סף Ct "Auto Ct". בואו סט התוכנה "האוטומטי Baseline"; לחיסול רקע כברירת מחדל.
- לחץ על הלשונית בשם "עלילת הגברה" ו, בחלק הימני ביותר של החלון, בחר באחד מהשלושה "הגלאים" בתפריט הנפתח המתאים (למשל, להתחיל עם TRECs). רק בהמשך, בחר "Ct הידני" כדי להגדיר באופן ידני סף; ללכת לחלק התחתון של החלון ובחר את הבארות מקבילות לנקודות דילול עקומה סטנדרטי של הגלאי בחר להציג את חלקות ההגברה. כדי לעשות זאת פשוט לחץ וגרור את העכבר מעל התאים המתאימים בטבלה.
- כדי להתאים את הסף באופן ידני, לגרור למעלה ולמטה את קו הסף האדום, ולאחר מכן לחץ על "נתח" לנתח מחדש את תוצאות. כדי לבדוק כיצד קביעת הסף משפיעה על התוצאות, בחר בכרטיסייה "הדוח", ולראות את ה- CT וכתוצאה מנקודות דילול עקומה סטנדרטית בהתאמה. בעת מעבר לסף, מנסה לעמוד בהמלצות הבאות כדי לקבל מיקום אופטימלי.
- חזור אל הכרטיסייה "עלילת הגברה" ולוודא כי הסף הוא באזור של הגברה מעריכי מספיק מעל רעש הרקע, אבל מתחת לשלב המפנה. אם עלילת ההגברה אינה מוצגת בקנה מידת לוגריתמים, לחץ לחיצה ימנית על המגרש להיזכר "הגדרות הגרף" ולקבוע את הגדרת ציר Y-לרוץ הודעה כמו "יומן", הגדר את חצי דרך הסף בחלק יניארי של העלילה, ולבחון את קימורי ההגברה כ מקבילים זה לזה.
- לחץ על הכרטיסייה "הדוח" כדי לראות את תוצאות ה- CT. ודא שמיקום הסף הניב תוצאות כי למקסם את הדיוק של שתי חזרות של כל נקודות דילול עקומה סטנדרטית.
- בדוק כי הסף ממוקם בנקודה שהכי טוב משקפת את ההזמנות הקיצוניות בסדר גודל של נקודות סטנדרטי דילול עקומה (רגישות אופטימלית). חזור על שלב 4.2.2 וsubsteps שנותר לשתי גלאים שנותרו (KRECs וTCRAC).
- עבור לכרטיסייה הדוחה, לגרור את העכבר שוב בטבלה בחלק התחתון של החלון כדי לבחור את התאים המתאימים לבארות של העקומה סטנדרטית לכל הגלאים (TRECs, KRECs, TCRAC). ודא שCT של שלוש המטרות וכתוצאה מכך הוא דומה מאוד באותו נקודות דילול (לדוגמא, הבדל לא יותר מ -0.5 CT). להתקין מחדש ספים במידת הצורך ולבדוק מחדש.
הערה: מאחר פלסמיד המשולש להוסיף מכיל עותק יחיד של כל יעד, ולכן יחס ההגברה אמור באופן תיאורטי להיות קרוב ל -1: 1: 1. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להתאים ידני גם בסיס לאחד או יותר מהגלאים כדי לקבל תוצאות טובות יותר. רק להיזכר בחלון "הגדרות ניתוח", בחר את הגלאי לאשר נדרש ההתאמה, ולאחר מכן קבע "Baseline הידני", ולהכניס את ערכים מותאמים אישית עבור התחל ומחזורי סיום (3-15 בדרך כלל). לאחר מכן לחץ על "אישור ולנתח מחדש" ולבדוק נקודות קודמות. - קבל הפגישה הניסויית רק אחרי שאימתי את הדברים הבאים:
- לחץ על הכרטיסייה "הדוח", ללכת לחלק התחתון של החלון, בחר בארות NTC ולבדוק שCt המתאים הוא "מתחת לכול" (כלומר, לא הגברה נמצאת בבארות NTC).
- בחר בכרטיסייה "Curve התקן" ולחפש בצד הימין של חלון העלילה; גלאים בחרו מהתפריט הנפתח ולראות אם מדרון העקומה הסטנדרטי דיווח נע בין -3.55 ו-3.32 (המקביל ל PCR יעילות של 91 - 100%)
- ודא כי המקדם של נחישות (R 2) גבוה יותר מ.998 (איור 2), על ידי קריאת הערך שלה ממש מתחת למדרון וליירט (באותה הלשונית "Curve התקן", לאחר בחירת כל גלאי).
הערה: שים לב לנקודות הדילול הקיצוניים בגלל חוסר התיאום שלהם עשוי להשפיע על המדרון בקלות רבה יותר (יש להם leve גבוה "השפעת זעם "על הקו הרגרסיה). בפרט, יש לזכור כי דילול פלסמיד הגבוה ביותר עלול לבזות מוקדם מהצפוי. עם זאת, בכל הזדמנות האפשרית הוא שימושי לא כדי לבטל אותם, משום שגישה רציונלית עשויה להיות לשקול 100 כגבול של גילוי כמותי: במילים אחרות, עבור דגימות בין 10 ל 100, התוצאה עלולה להיות כפי שדווחה <100 או "חיובי , אך לא לכימות ", בעוד שאם מחוץ לטווח העקום (<10) זה יכול להיות כפי שדווח 0 או" בלתי ניתן לגילוי ".
הערה: זה עשוי להיות שימושי כדי לשמור ארכיון של ערכי ה- CT של דילולים עקומת תקן קודמים, על מנת לחשב ערך ממוצע לכל נקודת דילול להישמר כסוג של טווח האופטימלי "התייחסות" או בדיקת איכות פנימית לניסויים עתידיים (למשל, לחשב ממוצע וSD לבנות תרשים בקרת Shewhart). בדומה לכך, זה עשוי להיות מועיל כדי לשמור ארכיון של Ct העבר של הבקרה החיובית.
2. עקומות איור תקן לTRECs, KRECs, וTCRAC. מגרשים של נקודות עקומה סטנדרטי וקו יומן רגרסיה מעריכה לTRECs (), KRECs (B), וTCRAC (C) בנוי כדי לוודא עמידה במעריכים אידיאליים שיעור הגברה (שיפוע = 3.32) שהיה מתאים ליעילות של 100%. Ct: מחזור סף; R 2:. מקדם הרגרסיה של נחישות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.- לחץ על הכרטיסייה "הדוח" ולוודא שCT של הבקרה החיובית (שנמצאה בתאים המתאימים בטבלה מתחת לתרשים) עולה בקנה אחד עם התוצאות של מבחני הקודמים על saלי ידוע בקרה חיובית.
הערה: הכרטיסייה "הדוח" מציגה את כמות TRECs, KRECs וTCRAC של הדגימות שנבדקה שהתוכנה חישבה על ידי ביון מהעקומה סטנדרטית המתאימה, באמצעות ערכי ה- CT שהושגו לאחר הסף והבסיס הוגדר כראוי ( ניתוח חדש עם סף / תחילת המחקר חדש ישנה את התוצאות הללו). כדי לראות היכן אינטרפולציה מתרחשת על העקומה סטנדרטית, בחר בכרטיסייה "רגיל Curve", לאחר מכן בחר את הבארות הרצויות, ולחפש את "X" השחור המופיע בקו הרגרסיה. ערך ציר y שלהם הוא כמות אינטרפולציה. אם אתה משתמש תמיד באותה שליטה חיובית, ניתן לבנות טווחי התייחסות מתאימים ו / או תרשימי בקרת איכות, המבוססים על הערכים קודמים נקבעו על הביקורת החיובית.
- לחץ על הכרטיסייה "הדוח" ולוודא שCT של הבקרה החיובית (שנמצאה בתאים המתאימים בטבלה מתחת לתרשים) עולה בקנה אחד עם התוצאות של מבחני הקודמים על saלי ידוע בקרה חיובית.
- לחץ על תפריט "קובץ", "שמור", ולאחר מכן "יצוא" לקובץ csv לייצא כמויות של כל הבארות בteקובץ xt מכיל ערכים מופרדים בפסיקים.
- לייבא the.csv קובץ בתוכנת גיליון אלקטרוני ולחשב את מספר TRECs או KRECs לכל 10 6 PBMC ידי קביעת הנוסחה הבאה כראוי: [(כלומר כמות TRECs או KRECs) / (כלומר כמות TCRAC / 2)] x 10 6
הערה: הכמות הממוצעת של TCRAC מחולקת על ידי 2 כי בכל תא יש שני עותקים של גן TCRAC, למשל, אחד לכל כרומוזום.
הערה: העקביות של המספר הסופי של TRECs וKRECs שליטה חיובית ניתן לראות, אך יש לזכור שערכים לא יתאימו בצורה מושלמת בגלל ההשתנות הנוספת של נקודות דילול עקומה סטנדרטית. במקרה של הבדלי ברוטו, הניסוי ייתכן שיהיה הצורך חוזר ונשנה. שוב, תרשימי שליטה עשויים להיות בנויים כדי להגדיר טווח התייחסות מתאים. - (לא חובה, אבל מומלץ) אם התוצאות של ספירת דם המלאה זמינות, לחשב את TRECs או KRECs לכל מיליליטר של דם באמצעות הנוסחא הבאה:
TRECs או KRECs לכל 1 x 10 6) x (הלימפוציטים + מונוציטים לספור ב 1 מיליליטר של דם) / 10 = 6 עותקים / מיליליטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay בוצע במדגם מייצג של 87 נבדקים בריאים: 42 ילדים בגילי 0-17 (זכר / נקבה: 25/17) ו -45 מבוגרים בגילי 24-60 (גברים / נשים: 29/16). תוצאות התקבלו כTRECs וKRECs לכל 10 6 PBMC, ולאחר מכן TRECs וKRECs לכל מיליליטר של דם חושבו.
מספר TRECs יורד עם גיל בשל פוף הרתי, 4 בפרט בצורה חדה מאוד 0-3 - 4 שנים. במבוגרים, מספר TREC גם תלוי במין, כי זה מקטין במהירות רבה יותר בגברים מאשר בנשים. 5 זה עלול ליצור בעיות בקביעת טווחי התייחסות מתאימות, שאמור להיות מובחן על בסיס הגיל ואולי המין, אם מאוד מדויק יש צורך בהערכה של נורמליות.
איור 3. כימות TREC במטלות בריאים nors. כמות TRECs נקבעה כTRECs / 10 6 תאים בילדים בריאים () ומבוגרים (B) ולאחר מכן מחושבים כ/ TRECs מ"ל באותם נושאים (C, D). חוגים ברורים: נשים; עיגולים מלאים: זכרים. קווים התקבלו על ידי רגרסיה ליניארית באמצעות הנתונים הפכו יומן. בילדים, שני קווי רגרסיה הותאמו כדי לייצג את השיעור המשתנה של ירידת TREC עם גיל טוב יותר. במבוגרים, קווים מקווקווים מייצגים את המגמה של ירידה בגיל TRECs ראה בנשים, שהוא איטי יותר מאשר בגברים (קו רציף). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מספר KRECs יורד עם הגיל עם דפוס דומה לTRECs רק בילדים, ואילו במבוגרי פלט מח העצם הוא יציב למדי לאורך כל חיים ואינו תלוי במין.
_content "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 4:. כימות KREC בתורמים בריאים הסכום של KRECs נקבע כKRECs / 10 6 תאים בילדים בריאים () ומבוגרים (B) ולאחר מכן מחושבים כ/ KRECs מ"ל באותם נושאים (C, D). חוגים ברורים: נשים; עיגולים מלאים: זכרים. קווים התקבלו על ידי רגרסיה ליניארית באמצעות הנתונים הפכו יומן. בילדים, שני קווי רגרסיה הותאמו כדי לייצג את השיעור המשתנה של ירידת KREC עם גיל טוב יותר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
למטרות נציג, מודלים של רגרסיה ליניארית יומן פשוטים היו מצוידים לתאר את הדפוס של ירידת TREC / KREC עם גיל, אבל דגמים שאינם ליניארי מעודנים יותר עשויים להיות מצוידים in ניסיון לחזות טוב יותר את ירידת KREC / TREC לכאורה מעריכי עם גיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
