Introduction
T-celle-reseptor-excision sirkler (TRECs) og K-sletting rekombinasjon eksisjons- sirkler (KRECs) er små sirkularisert DNA-elementer som er skåret ut i en andel av T- og B-celler, henholdsvis, i løpet av et genomisk DNA-rekombinasjon fremgangsmåte, som fører til Dannelsen av et sterkt variert repertoar av T- og B-cellereseptorer. De har ingen funksjon, men fordi de er stabile og ikke kan bli kopiert, blir de fortynnet etter hver celledeling, således som vedvarer kun i en av de to dattercellene. Derfor kan deres nivåer i perifert blod antas som et estimat av thymus og benmarg utgang.
Mens TREC analysen stor grad har vært brukt de siste 15 årene for å vurdere omfanget av thymic utgang, til en den KREC analysen, som opprinnelig ble utviklet måle B-celleproliferasjon og dens bidrag til B-celle homeostase i helse og sykdom, to har nylig foreslått som en markør av bein marrow utgang. 3,4 Her beskriver vi metoden vi har utviklet for samtidig kvantifisering av både TRECs og KRECs. 4
Med denne kombinerte metode, er variasjonen forbundet til DNA kvantifisering av sanntids-PCR eliminert ved bruk av en unik standard kurve oppnådd ved å fortynne en trippel-insert-plasmid inneholdende fragmenter av TRECs, KRECs og T-celle-reseptor-alfa-konstant (TCRAC) gen i en 1: 1: 1-forhold. Dette gjør at en mer nøyaktig vurdering av TREC og KREC kopi nummer. Videre tillater den samtidige kvantifisering av de to mål i den samme reaksjons reagens kostnadsreduksjon.
Den foreslåtte TREC / KREC analysen kan være nyttig for å måle omfanget av T- og B-celle neo-produksjon hos barn eller voksne med alvorlig kombinert immunsvikt (SCID), 4 Common Variable Immunodeficiency, 5 autoimmune sykdommer, 6-8 og HIV-infeksjon Dess. 9, kan den brukes til åovervåke immun bedring etter stamcelletransplantasjon, 10 enzymerstatnings, 11 og antiviral 9 eller immunmodulerende behandling. 6-8 slutt, fordi SCID-pasienter er behandlet etter TREC analysen til tross for de underliggende genetiske defekter, og agammaglobulinemia pasienter kan identifiseres ved hjelp av KREC kvantifisering den TREC / KREC Målingen kan også brukes til å detektere immunsvikt hos nyfødte screeningprogrammer. 12 I dette tilfellet, må testen utføres på DNA ekstrahert fra små blodflekker blottet og tørket på filterpapir, må være meget følsom og spesifikk for mål-sykdommer, så vel som meget reproduserbar og kostnadseffektiv.
Innføringen av KREC kvantifisering i testen bør forbedre forestillinger av nyfødt screening for immunsvikt, som rutinemessig har blitt utført i de enkelte deler av USA (WI, MA, CA) siden 2008 da Wisconsin ble den første å introduksjonere analysen av TRECs i sin postnatal screening program. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Etikk uttalelse: Denne protokollen følger retningslinjene i vår institusjon, Spedali Civili di Brescia
1. Utarbeidelse av en "Triple-Insert" Plasmid
- Valg og utarbeidelse av hensiktsmessig utgangsmateriale:
- Skaff en prøve som inneholder celler svært sannsynlig å ha TRECs og KRECs påvises med PCR, som perifert blod av en ung, frisk person samlet inn EDTA-rør.
MERK: Opprinnelig hadde vi utviklet metoden bruker tymocytter for TRECs og mononukleære celler fra mandel fragmenter for KRECs, men friske personer har vanligvis en mengde TRECs og KRECs tilstrekkelig til å tillate at deres oppdagelse av PCR. Derfor bør perifert blod være et gyldig alternativ, lettere å få tak i og å jobbe med. Tatt i betraktning at TRECs, særlig reduseres med alderen hos friske voksne, perifert blod fra en ung voksen, om ikke fra barne, anbefales. - Separat perifert blod mononucLear celler (PBMC) fra en standard densitet gradient separasjonsmetode.
- Skaff en prøve som inneholder celler svært sannsynlig å ha TRECs og KRECs påvises med PCR, som perifert blod av en ung, frisk person samlet inn EDTA-rør.
- DNA-ekstraksjon:
- Utdrag DNA fra PBMC bruker en kommersiell DNA Blood Mini Kit. Følg produsentens instruksjoner med de få unntak som er beskrevet nedenfor.
- Inkuber prøvene ved 70 ° C (i stedet for 56 ° C) i 10 minutter ved hjelp av en shaker-inkubator ved 1400 rpm.
- Legg elueringsbufferen oppvarmet ved 70 ° C til kolonnen, inkuber i 5 minutter ved 70 ° C og elueres DNA ved sentrifugering i henhold til produsentens instruksjoner. Bestem hentet DNA konsentrasjonen av spektrofotometrisk estimering på 260/280 nm.
- Utdrag DNA fra PBMC bruker en kommersiell DNA Blood Mini Kit. Følg produsentens instruksjoner med de få unntak som er beskrevet nedenfor.
- Utarbeidelse av et plasmid som inneholder innsatsene TREC og KREC signal ledd (SJ) og TCRAC referanse genet:
- Amplifisere DNA ekstrahert fra PBMC (for å oppnå den TREC-SJ, KREC-SJ, og TCRAC fragmenter) med primere som er spesifikke for TRECs, KRECs og TCRAC (se tabell 1).
MERK: På 5'-enden, de KREC- og TCRAC-spesifikke primere inneholde HindIII- og Spel restriksjonssetene (i små bokstaver i sekvensene vist Tabell 1) med et passende antall flankerer ekstra nukleotider (angitt i kursiv); begge funksjonene er ikke til stede i de kanoniske KREC og TCRAC sekvenser.
- Amplifisere DNA ekstrahert fra PBMC (for å oppnå den TREC-SJ, KREC-SJ, og TCRAC fragmenter) med primere som er spesifikke for TRECs, KRECs og TCRAC (se tabell 1).
| TRECs | forward | 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 ' |
| reversere | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 ' | |
| KRECs | forward | 5'- CCC aag ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 ' |
| reversere | 5'- CCC aag ctt GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 ' | |
| TCRAC | forward | 5'- G ac tag TAT GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 ' |
| reversere | 5'- G ac tag TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 ' |
Tabell 1. Primere benyttet for kloningsfremgangsmåter. Ved 5'-enden, med små bokstaver er vist nukleotider som tilsvarer restriksjonsenzymseter, mens i kursiv er vist lagt flankerende nukleotider.
- Utføre PCR-reaksjoner i et sluttvolum på 25 ul, bestående av 1 x buffer II, 1,5 mM MgCl2, dNTP-blanding (200 mM hver), primere ved sluttkonsentrasjon på 900 nM, AmpliTaq DNA-polymerase (2,5 U / 25 ul), og 100 ng av DNA.
- Bruke følgende PCR parametre: for det første trinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 30 sekunder; 60 ° C i 30 sekunder; 72 ° C i 30 sekunder, og til slutt en syklus på 72 ° C i 10 min. PCR lengdene skal være: 380 bp for TRECs, 166 bp for KRECs, 381 bp for TCRAC.
- Sett PCR-produkt av TREC-SJ i TA akseptorsete av pCR2.1-TOPO vektor. Transformering av plasmid-DNA i XL1 blue-kjemisk kompetente celler ved varmesjokk følge protokollen forsynt med cellene. Blant de kolonier som vokser på grunn av ampicillinresistens, identifisere de som bærer innsatsen, som vil vises hvitt på grunn av tapt β-galaktosidase complementation, og vaksinere dem inn i en master parabolen. Endelig identifisere koloniene som inneholder TREC fragment av PCR.
- Utvide en av de identifiserte kolonier og rense plasmid DNA ved hjelp av et plasmid miniprep kit og følg produsentens anvisninger. Fordøye plasmid DNA og TCRAC amplifisert produkt med Spel-restriksjonsenzym, og ligere det TCRAC fragment inn i Spel-restriksjonssete.
- Transformering av plasmid-DNA i XL1-Blue-celler og identifisere kolonier som inneholdt TCRAC fragment ved hjelp av PCR. Utvide en av de identifiserte kolonier og renseplasmid-DNA ved bruk av plasmid miniprep kit.
- Fordøye plasmid DNA og KREC amplifiserte produkt med Hindlll og klone KREC-SJ-fragment inn i det Hindlll-restriksjonssete. Transformering av plasmid-DNA i XL1-Blue-celler og identifisere kolonier som inneholder det tredje fragment ved hjelp av PCR.
- Verifisere, ved direkte sekvensering av tilstedeværelsen av de tre innsatser og fravær av mutasjoner. Kartet over den siste trippel-insert plasmid er representert i figur 1.
Figur 1. Triple-insert plasmidkart. Triple-insert plasmid kart som viser plasseringen av TREC, KREC, TCRAC sekvenser og restriksjonsenzymseter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Utvide ett av de identifiserte koloniene, rense plasmid-DNA ved å bruke et plasmid midiprep kit. Bestem plasmid DNA-konsentrasjon ved spektrofotometrisk estimert ved 260/280 nm og DNA-kvalitet ved gelelektroforese. Lagre egnede alikvoter av plasmidet ved -80 ° C (f.eks., 50 ul hver).
2. Standard Curve Forberedelse
MERK: Klargjør alle fortynninger i 0.1x TE buffer på et sted spesialdesignet for oppsamling av DNA carry-over.
- Beregne massen av plasmid kopiantall av interesse (se tabell 2), idet det tas hensyn til at plasmidet størrelse er 4846 bp, og at den gjennomsnittlige masse pr bp er 1,096 x 10 -21 g / bp, og derfor: m p = ( 4846 bp) x (1,096 x 10 -21 g / bp) = 5,311.216 x 10 -21 g = 5,311 x 10 -18 g.
| Kopier # | x 5,311 x 10 -18 g | Masse av plasmid DNA (g) |
| 1 x 10 6 | 5,311 x 10 -12 |
| 1 x 10 5 | 5,311 x 10 -13 |
| 1 x 10 4 | 5,311 x 10 -14 |
| 1 x 10 3 | 5,311 x 10 -15 |
| 1 x 10 2 | 5,311 x 10 -16 |
Tabell 2. Masse av plasmid som er nødvendig for hver standardkurve fortynning punkt.
- Beregne konsentrasjonene av plasmid-DNA ved å dividere den nødvendige plasmid masser av volumet (5 mL) for å bli pipettert over i hver reaksjon (se tabell 3).
| Masse av plasmid DNA (g) | ÷ 5 pl | Sluttkonsentrasjonen av plasmid DNA (g / mL) |
| 5,311 x 10 -12 | 1,062 x 10 -12 | |
| 5,311 x 10 -13 | 1,062 x 10 -13 | |
| 5,311 x 10 -14 | 1,062 x 10 -14 | |
| 5,311 x 10 -15 | 1,062 x 10 -15 | |
| 5,311 x 10 -16 | 1,062 x 10 -16 |
Tabell 3. Beregning av plasmid konsentrasjoner som trengs for hver fortynning punkt.
- Tine en delmengde av plasmidet. Linear 2 pg av plasmid DNA med Xhol og bestemme dens konsentrasjon by spektrofotometrisk estimering på 260/280 nm.
- Tilbered en passende fortynning av det lineariserte plasmid-DNA for å oppnå et praktisk arbeidsstamløsning for å starte fra (f.eks, 100 ng / mL = 0,1 ug / mL = 1 x 10 -7 g / mL). Oppbevar det gjenværende av den lineariserte plasmid-DNA ved -80 ° C.
- Utføre en praktisk antall 1:10 eller 1: 100 fortynninger for å gi plasmidet på mer gjennomførbar konsentrasjon på 1 x 10 -10 g / mL.
- Bruke formelen C 1 V 1 = C 2 V 2 for å beregne fortynning volum (V 2 - V 1) som er nødvendig for å fremstille den første standardkurve punktet av serien (1 x 10 6 kopier, tilsvarende 1,062 x 10 -12 g 5 / ul; se tabell 4).
| Initial kons. (G / mL) | Plasmid DNA vol (pl) | Diluent vol (pl) | Endelige vol. (Pl) | Endelig kons. (G / mL) | Sluttkopiantallet av plasmidet DNA / 5 ul |
| C 1 | V 1 | V 2 -V 1 | V 2 | C 2 | |
| 1 x 10 -7 | 5 mL | 45 mL | 50 pl | 1 x 10 -8 | N / A |
| 1 x 10 -8 | 5 mL | 495 mikroliter | 500 mL | 1 x 10 -10 | N / A |
| 1 x 10 -10 | 5 mL | 465 mikroliter | 470 mikroliter | 1,062 x 10 -12 | 1 x 10 6 |
| 1,062 x 10 -12 | 50 pl | 450 mikroliter | 500 mL | 1.062 x 10 -13 | 1 x 10 5 |
| 1,062 x 10 -13 | 50 pl | 450 mikroliter | 500 mL | 1,062 x 10 -14 | 1 x 10 4 |
| 1,062 x 10 -14 | 50 pl | 450 mikroliter | 500 mL | 1,062 x 10 -15 | 1 x 10 3 |
| 1,062 x 10 -15 | 50 pl | 450 mikroliter | 500 mL | 1,062 x 10- 16 | 1 x 10 2 |
Tabell 4. beregninger fortynning.
- Fortsett med en vanlig serie av 1:10 fortynninger for å få tak i de gjenværende standardkurvepunkter.
MERK: Ikke glem å vortex hvert plasmid fortynning kort før du utfører neste.
MERK: Den høyeste fortynning av stAndard kurven (10 kopier / 5 pl) må fremstilles like før utførelse av analysen, fordi en så liten mengde av plasmid DNA ikke er stabil nok til å bli lagret for fremtidig bruk. - Lagre trippel-plasmid fortynning punkter ved -80 ° C i separate rør inntil bruk. Den fortynnede trippel-plasmid-DNA er meget stabil i minst 6 måneder.
3. DNA Extraction fra Target Samples
- Separat PBMC fra perifert blod oppsamlet i EDTA-rør ved hjelp av densitetsgradient separasjonsmetode.
MERK: Alternativt kan du bruke annen egnet startmateriale (f.eks sortert lymfocytsubpopulasjoner, fullblod) som mål prøven. - Pakk ut DNA fra PBMC av målet prøver som rapportert i trinn 1.2.
4. Real-time PCR for Kvantifisering av TRECs og KRECs
- Plate forberedelse og lasting:
- Arrangere en PCR-plate som innbefatter minst to replikater for hver prøvenesom skal analyseres: standardkurve (A → F 1 → 4), positiv kontroll (CTRL +; G1 → 4) og ingen mal kontroll (NTC, H 1 → 4).
MERK: Følg en typisk ordning i tabell 5, men forskjellige formater kan opprettes. Husk at TRECs og KRECs blir amplifisert sammen i de samme brønnene, forskjellige fra de av TCRAC.
- Arrangere en PCR-plate som innbefatter minst to replikater for hver prøvenesom skal analyseres: standardkurve (A → F 1 → 4), positiv kontroll (CTRL +; G1 → 4) og ingen mal kontroll (NTC, H 1 → 4).
| TRECs + KRECs en | TCRAC b | TRECs + KRECs | TCRAC | TRECs + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 10 6 eksemplarer | 10 6 eksemplarer | 10 6 eksemplarer | 10 6 eksemplarer | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| B | 10 5 eksemplarer | 10 5 eksemplarer | 10 5 eksemplarer | 10 5 eksemplarer | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 eksemplarer | 10 <sup> 4 eksemplarer | 10 4 eksemplarer | 10 4 eksemplarer | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | 10 3 eksemplarer | 10 3 eksemplarer | 10 3 eksemplarer | 10 3 eksemplarer | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| E | 10 2 eksemplarer | 10 2 eksemplarer | 10 2 eksemplarer | 10 2 eksemplarer | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 kopier | 10 kopier | 10 kopier | 10 kopier | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
Tabell 5. Eksempel på real-time PCR plate.
- Beregn det totale antall brønner som trengs (inkluderer 1 - 2 ekstra brønner for å redegjøre for mulige pipettering feil) og forberede master mix for TRECs / KRECs og TCRAC i separate rør (se tabell 6).
MERK:. De primere og prober spesifikke for TRECs, KRECs og TCRAC er nevnt i tabell 7 primer og sonden sluttkonsentrasjoner er 900 nM og 200 nM.
- Beregn det totale antall brønner som trengs (inkluderer 1 - 2 ekstra brønner for å redegjøre for mulige pipettering feil) og forberede master mix for TRECs / KRECs og TCRAC i separate rør (se tabell 6).
| TRECs / KRECs | TCRAC | ||
| H 2 O | 2 pl | H 2 O | 4.75 mL |
| KRECs for 20 pmol / mikroliter | 1,125 mL | TCRAC for 20 pmol / mikroliter | 1,125 mL </ Td> |
| KRECs rev 20 pmol / ul | 1,125 mL | TCRAC rev 20 pmol / ul | 1,125 mL |
| KRECs sonde 10 pmol / mikroliter | 0,5 pl | TCRAC sonde 10 pmol / mikroliter | 0,5 pl |
| TRECs for 20 pmol / mikroliter | 1,125 mL | 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12,5 mL |
| TRECs rev 20 pmol / mikroliter | 1,125 mL | ||
| TRECs sonde 10 pmol / mikroliter | 0,5 pl | ||
| 2x TaqMan Universal PCR Master Mix | 12,5 mL | ||
Tabell 6. Volum av reagenser som trengs for de angitte brønner.
| TRECs | forward | 5'-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3 ' |
| reversere | 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 ' | |
| probe | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 ' | |
| KRECs | forward | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3 |
| reversere | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC AGT TAG-3 ' | |
| probe | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | forward | 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 ' |
| reversere | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| probe | 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 ' |
Tabell 7. Sekvens av primer og sonder for sanntids PCR-analysen.
- Tilsett 20 mL av hver mix (TRECs / KRECs og TCRAC). Før du forlater reagensklargjøring rom, forsegle reaksjonsplaten med en optisk lim dekselet.
- I en nukleinsyre utvinning rom, løft limet dekselet og legge 5 mL av genomisk DNA-prøve (fra 400 - 500 ng) til brønnene. Tilsett 5 mL av genomisk DNA (dvs. forberedt fra PBMC hentet fra navlestrengsblod) til ctrl + brønner.
MERK: Som et alternativ til navlestrengsblod, bruke DNA fra den samme kjente, positivt perifer blodprøve eller basseng av prøver, eller fremstille en "kunstig" positiv standard ved å blande en bestemt mengde av trippel-insert plasmid med genomisk DNA fra TREC- og KREC-negative cellelinjer. - Tilsett 5 ul av vann til NTC-brønner. Forsegle reaksjonsplaten på nytt med den optiske klebende dekke.
- Flytte til et sted som sikrer oppsamling av plasmid DNA carry-over; tine hver fortynning pet av plasmid DNA standardkurve bare før bruk og forberede den høyeste fortynning (10 kopier / 5 mL). Løft opp limet dekselet bare fra A → H 1 → 4 brønner og legge til 5 mL av hvert punkt fortynning av plasmid DNA standardkurve. Forsegle limet dekselet igjen.
- Bekrefte fravær av bobler på bunnen av brønnene, og dermed sikre at reagensene er plassert på bunnen.
- Kjør analysen på en Real-time PCR system. Standard protokollen består av første trinn ved 50 ° C i 2 minutter, en innledende oppvarming ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sek, og en kombinert primer / probe gløding og forlengelse ved 60 ° C i 1 min.
- Lagre dataene ved slutten av PCR-programmet.
MERK: For å unngå DNA krysskontaminering, husk: å følge de vanlige god laboratoriepraksis anbefalinger for kvantitativ PCR når du setter opp real time PCR-analyse: bruk separate områder / rom for nukleinsyre utvinning,reagensklargjøring, plasmid manipulasjon, amplifikasjonsreaksjon; bruke separate pipettes sett; endre hansker / jakker som passer.
- Resultater og beregning:
MERK: Følgende trinn er basert på vår erfaring med bruk av programvaren som følger med real-time PCR instrument nevnt i Materialer Table, men generelt bør de gjelde andre real-time PCR-analyse plattformer og programvare. Husk at selv om du bruker den samme programvaren, vanligvis er det mer enn én måte å utføre de nødvendige kommandoer (f.eks, ikoner, snarveier).- Åpne den lagrede resultatfilen i programvaren og klikk på "Resultater" -kategorien. På toppen av vinduet, klikk på "Analyse" -menyen og velg "Analyse innstillinger". La programvaren bestemme terskelen automatisk ved å velge "Alle" detektorer og "Auto Ct" (Ct = terskel syklus. La programvaren sett "Automatic Baseline"; for bakgrunns eliminering som standard.
- Klikk på fanen som heter "Amplification Plot", og på den høyre delen av vinduet, velg en av de tre "detektorer" i den tilsvarende rullegardinmenyen (for eksempel starte med TRECs). Like nedenfor, velg "Manuell Ct" for å sette en terskel manuelt; gå til den nedre del av vinduet og velger brønnene svarende til de standard kurve fortynning punkter i den valgte detektor for å vise forsterknings plott. For å gjøre dette bare klikk og dra musen over de tilsvarende cellene i tabellen.
- Å justere terskelen manuelt, drar den røde terskel linje opp og ned, og klikk deretter på "Analyze" for å Analyser på nytt resultater. For å sjekke hvordan du setter terskelen påvirker resultatene, velg "Report" -kategorien, og se den resulterende Ct av de respektive standardkurve utvannings poeng. Når du flytter terskelen, prøv å overholde følgende anbefalinger for å få en optimal plassering.
- Gå tilbake til "Amplification Plot" -fanen og verifisere at terskelen er i en region av eksponentiell forsterkning tilstrekkelig over bakgrunnsstøyen, men under platåfasen. Hvis amplifikasjonsplot ikke er vist i logaritmisk skala, høyreklikk på tomten for å minnes de "Graf Innstillinger" og satt etter kjøre Y-aksen innstilling som "log", satt terskelen halvveis i den lineære delen av tomt, og observerer forsterker kurvene er tilnærmet parallelle med hverandre.
- Klikk på "Report" kategori for å se Ct resultater. Sørg for at terskelen plassering gitt resultater som maksimerer presisjonen av de to replikater av hver standard kurve utvannings poeng.
- Sjekk at terskelen er plassert på det punktet som best reflekterer de ekstreme størrelsesordener av standardkurve utvannings poeng (optimal sensitivitet). Gjenta trinn 4.2.2 og øvrige undertrinnene for de resterende to detektorer (KRECs og TCRAC).
- Gå til fanen Rapport, dra musen igjen i tabellen i den nedre delen av vinduet for å velge cellene tilsvarende brønnene av standardkurven for alle detektorer (TRECs, KRECs, TCRAC). Verifisere at den resulterende Ct av de tre målene er svært likt på de samme fortynningstrinn punktene (f.eks forskjellen ikke mer enn 0,5 Ct). Omstille terskler hvis nødvendig og re-sjekk.
MERK: På grunn av at trippel-insert plasmid inneholder et enkelt-kopi av hvert mål og dermed forsterkningen forholdet bør teoretisk være nær 1: 1: 1. I noen tilfeller kan det være nødvendig å manuelt justere også grunnlinjen for en eller flere av detektorene for å oppnå bedre resultater. Bare husker "Analysis innstillinger" vinduet velger detektoren der justering er nødvendig, deretter stiller du "Manual Baseline", og sette inn egendefinerte verdier for Start og End Cycles (vanligvis 3 til 15). Deretter klikker du "OK & Analyser på nytt" og kontroller tidligere punkter. - Godta den eksperimentelle økten etter å ha kontrollert følgende:
- Klikk på "Report" fanen, gå til den nedre delen av vinduet, velg NTC brønner og sjekk at den tilsvarende Ct er "undet" (dvs. er ingen forsterkning til stede i NTC brønner).
- Velg "Standard Curve" -fanen og se til høyre av tomten vinduet; velg detektorer fra rullegardinmenyen, og se om den rapporterte standardkurve skråningen varierer mellom -3,55 og -3,32 (tilsvarende PCR-effektiviteten av 91 - 100%)
- Sørg for at koeffisienten (R2) er høyere enn 0,998 (figur 2), ved å lese sin verdi rett nedenfor skråningen og skjæringspunktet (i samme "Standard Curve" -kategorien, etter å ha valgt hver detektor).
MERK: Vær oppmerksom på de ekstreme utvannings poeng fordi deres feiljustering kan påvirke skråningen lettere (de har en høy "leveraseri "effekt på regresjonslinjen). Spesielt huske på at den høyeste plasmid fortynning kan degradere raskere enn forventet. Men når det er mulig det er nyttig ikke å forkaste dem, fordi en rasjonell tilnærming kan være å vurdere 100 som grense for kvantitativ deteksjon: med andre ord, for prøver mellom 10 og 100, kan resultatet bli rapportert som <100 eller "positive , men ikke målbare ", mens hvis utenfor kurven rekkevidde (<10) kan det bli rapportert som 0 eller" usynlige ".
MERK: Det kan være nyttig å holde et arkiv av Ct-verdier av tidligere standardkurve fortynninger, for å beregne en gjennomsnittsverdi for hver fortynning punktet å bli holdt som en slags optimal "referanse" range eller intern kvalitetssjekk for fremtidige eksperimenter (for eksempel beregne middelverdien og SD å bygge Shewhart kontroll diagrammer). Analogt, kan det være nyttig å holde et arkiv av fortiden Ct av den positive kontrollen.
Figur 2. Standard kurver for TRECs, KRECs, og TCRAC. Tomter av standardkurven poeng og logge regresjonslinjen anslår for TRECs (A), er KRECs (B), og TCRAC (C) bygget for å verifisere samsvar med den ideelle eksponentiell forsterkning hastighet (helling = 3,32) som vil tilsvare en virkningsgrad på 100%. Ct: terskel syklus; R2:. Regresjon koeffisienten Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.- Klikk på "Report" -fanen og kontroller at Ct av den positive kontrollen (finnes i de tilsvarende cellene i tabellen under diagrammet) er i tråd med resultatene av tidligere analyser på sameg kjente positive kontroll.
MERK: "Report" -kategorien viser mengden TRECs, KRECs og TCRAC av prøvene blir testet at programvaren har beregnet ved interpolasjon fra de respektive standardkurven, ved hjelp av Ct-verdier oppnådd etter terskelen og baseline er riktig stilt (en ny analyse med en ny terskel / baseline ville endre disse resultatene). For å se hvor interpole foregår på standardkurven, velger du "Standard Curve" -kategorien, og velg deretter de ønskede brønner, og se etter svart "X" vises på regresjonslinjen. Sin y-aksen verdi er interpolert mengde. Hvis du bruker alltid den samme positive kontrollen, kan aktuelle referanseområder og / eller kvalitetskontroll diagrammer bygges, basert på tidligere verdier bestemt på positiv kontroll.
- Klikk på "Report" -fanen og kontroller at Ct av den positive kontrollen (finnes i de tilsvarende cellene i tabellen under diagrammet) er i tråd med resultatene av tidligere analyser på sameg kjente positive kontroll.
- Klikk på "File" -menyen, "Lagre", og deretter "Export" til en CSV-fil for å eksportere mengder av alle brønnene i en text fil som inneholder kommadelte verdier.
- Importere the.csv fil i et regneark programvare og beregne antall TRECs eller KRECs per 10 6 PBMC ved å sette følgende formel riktig: [(gjennomsnittlig mengde TRECs eller KRECs) / (gjennomsnittlig mengde TCRAC / 2)] x 10 6
NB: Den midlere mengde av TCRAC divideres med to, fordi i hver celle er det to TCRAC genkopier, f.eks, en for hvert kromosom.
MERK: Konsistensen på det endelige antall TRECs og KRECs av positiv kontroll kan betraktes, men husk at verdier ikke vil passer perfekt på grunn av den ekstra variasjon av standardkurve utvannings poeng. I tilfelle av grov divergens, kan eksperimentet må gjentas. Igjen, kan kontroll diagrammer bygges for å sette en passende referanseområdet. - (Valgfritt, men anbefales) Dersom resultatene av komplett blodprosent er tilgjengelige, beregne TRECs eller KRECs per ml blod ved hjelp av følgende formel:
TRECs eller KRECs per 1 x 10 6) x (lymfocytter + monocyte telle i 1 ml blod) / 10 6 = kopier / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen ble utført i et representativt utvalg av 87 friske kontroller: 42 barn i alderen 0-17 (mann / kvinner: 25/17) og 45 voksne i alderen 24-60 (menn / kvinner: 29/16). Resultatene ble oppnådd som TRECs og KRECs per 10 6 PBMC, og deretter blir TRECs og KRECs per ml blod ble beregnet.
Antallet TRECs avtar med alderen på grunn av thymus involusjon, 4 spesielt i en meget skarp mote fra 0 til 3 - 4 år. Hos voksne, avhenger TREC nummer også på kjønn, fordi det minsker raskere hos menn enn hos kvinner. 5 Dette kan skape problemer i å sette riktige referanseområder, som bør være differensiert på grunnlag av alder og muligens kjønn, om en meget presis estimering av normalitet er nødvendig.
Figur 3. TREC kvantifisering i sunn do Nors. Mengden av TRECs ble bestemt som TRECs / 10 6 celler i friske barn (A) og voksne (B) og deretter beregnet som TRECs / ml i de samme fagene (C, D). Klare sirkler: kvinner; fylte sirkler: hanner. Linjer ble oppnådd ved lineær regresjon ved bruk av log-transformerte data. Hos barn, ble to regresjonslinjer montert bedre representerer variabel hastighet på TREC nedgang med alderen. Hos voksne, stiplede linjer representerer trenden med nedgang med alderen av TRECs sett hos kvinner, som er tregere enn hos menn (sammenhengende strek). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Antallet KRECs avtar med alder med et mønster som ligner på TRECs bare hos barn, mens det i de voksne benmargen utgang er ganske stabil gjennom hele livet, og er ikke avhengig av kjønn.
_content "fo: keep-together.within-side =" always ">
Figur 4:. KREC kvantifisering hos friske donorer Mengden KRECs ble bestemt som KRECs / 10 6 celler hos friske barn (A) og voksne (B) og deretter beregnet som KRECs / ml i de samme fagene (C, D). Klare sirkler: kvinner; fylte sirkler: hanner. Linjer ble oppnådd ved lineær regresjon ved bruk av log-transformerte data. Hos barn, ble to regresjonslinjer montert bedre representerer variabel hastighet på KREC nedgang med alderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For representative formål, enkle log-lineære regresjonsmodeller var montert for å skildre mønsteret av TREC / KREC nedgang med alderen, men mer raffinerte ikke-lineære modeller kan monteres in et forsøk på å bedre forutsi tilsynelatende eksponentiell KREC / TREC nedgang med alderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
