Introduction
Т-клеточный рецептор вырезания кругов (TRECs) и К-удаление рекомбинации вырезания кругов (KRECs) малы циклической ДНК-элементы, которые вырезают в количестве Т- и В-клеток, соответственно, в течение геномной ДНК процессе рекомбинации, что приводит к формирование высокой диверсификации репертуара Т- и В-клеточных рецепторов. Они не имеют функции, а потому, что они стабильны и не могут быть воспроизведены, они разбавляют после каждого деления клеток, таким образом, сохраняющиеся только в одной из двух дочерних клеток. Таким образом, их уровни в периферической крови можно предположить, в качестве оценки выхода тимуса и костного мозга.
В то время как анализ TREC был в значительной степени используются на протяжении последних 15 лет, чтобы оценить степень в тимусе, 1 анализ KREC, который был первоначально разработан для измерения пролиферации В-клеток и свой вклад в B-клеточного гомеостаза в норме и патологии, 2 был недавно предложена в качестве маркера костного мстрелка выход. 3,4 Здесь мы опишем метод было разработано для одновременного количественного обоих TRECs и KRECs. 4
С помощью этого комбинированного метода, изменчивость связана с количественной ДНК путем ПЦР в реальном времени устраняется за счет использования уникального стандартной кривой, полученной путем разбавления тройной вставки плазмиды, содержащей фрагменты TRECs, KRECs и Т-клеток постоянной рецептора альфа (TCRAC) Ген в соотношении 1: 1: 1. Это позволяет более точную оценку числа копий TREC и KREC. Более того, одновременное количественное определение двух целей в одной и той же реакции позволяет уменьшить затраты реагентов.
Предложил TREC / KREC анализ может быть полезен для определения степени Т- и В-клеток нео-производство у детей и взрослых с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), 4 общий вариабельный иммунодефицит, 5 аутоиммунных заболеваний, 6-8 и ВИЧ-инфекции . 9 Кроме того, могут быть использованы дляследить за восстановления иммунитета после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, 10 ферменто, 11 и противовирусное 9 или иммуномодулирующие терапии. 6-8 Наконец, поскольку SCID пациентов отражаются с использованием TREC анализа, несмотря на базовых генетических дефектов, и агаммаглобулинемия пациенты могут быть идентифицированы с использованием Krec количественное , анализ TREC / KREC также может быть использован для обнаружения иммунодефициты у новорожденных программ скрининга. 12 В этом случае, тест должен быть выполнен на ДНК, выделенной из малых пятен крови смыл и сушат на фильтровальной бумаге, должна быть высокой чувствительностью и специфичностью для целевые заболевания, а также высокую воспроизводимость и экономически эффективным.
Введение KREC количественного в тесте должно улучшить выступления обследование новорожденных на иммунодефициты, которая обычно была выполнена в некоторых районах США (Висконсин, MA, CA), начиная с 2008 года, когда штат Висконсин стал первым Вве анализ TRECs в послеродовой программы скрининга. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике:: Примечание Этот протокол следует руководству нашего вуза, в Spedali Civili ди Брешиа
1. Подготовка "Triple-Вставить" плазмиды
- Отбор и подготовка соответствующего исходного материала:
- Получение образца, содержащего клетки, скорее всего, имеют TRECs и KRECs обнаруживаемого с помощью ПЦР, такие как периферической крови молодых здоровых субъекта, собранной в ЭДТА пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально, мы разработали метод, используя тимоцитов для TRECs и мононуклеарных клеток из миндалин фрагментов для KRECs, но здоровых субъектов, как правило, количество TRECs и KRECs достаточно, чтобы позволить их обнаружение с помощью ПЦР. Таким образом, в периферической крови должна быть реальной альтернативой, легче получить и работать. Учитывая, что TRECs, в частности, уменьшается с возрастом у здоровых взрослых, периферической крови молодого человека, если не от детей, рекомендуется. - Отдельная периферической mononuc кровиЛир клетки (РВМС) методом разделения стандартного градиента плотности.
- Получение образца, содержащего клетки, скорее всего, имеют TRECs и KRECs обнаруживаемого с помощью ПЦР, такие как периферической крови молодых здоровых субъекта, собранной в ЭДТА пробирки.
- Выделение ДНК:
- Извлечение ДНК из МКПК, используя коммерческий ДНК крови Mini Kit. Следуйте инструкциям производителя с небольшими модификациями, описанными ниже.
- Инкубируйте образцы при 70 ° C (вместо 56 ° С) в течение 10 мин с использованием шейкер на 1400 оборотов в минуту.
- Добавить элюирующего буфера нагревали при 70 ° С в колонну, инкубировать в течение 5 мин при 70 ° С и элюируют ДНК центрифугированием в соответствии с инструкциями изготовителя. Определить извлеченный концентрацию ДНК спектрофотометрически оценки на 260/280 нм.
- Извлечение ДНК из МКПК, используя коммерческий ДНК крови Mini Kit. Следуйте инструкциям производителя с небольшими модификациями, описанными ниже.
- Получение плазмиды, содержащей вставки TREC и KRec сигнала суставов (SJ) и опорной TCRAC гена:
- Усилить ДНК, извлеченную из РВМС (для получения TREC-SJ, Krec-SJ и TCRAC фрагменты) с праймерами, специфичными для TRECs, KRECs и TCRAC (см таблицу 1).
Примечание: В 5'-конце, праймеры KREC- и TCRAC-специфические содержит HindIII и SpeI сайты рестрикции (в нижнем регистре в последовательностями, представленными в таблице 1) с соответствующим количеством фланкирующих дополнительные нуклеотиды (указано курсивом); Обе функции нет в канонических последовательностей Krec и TCRAC.
- Усилить ДНК, извлеченную из РВМС (для получения TREC-SJ, Krec-SJ и TCRAC фрагменты) с праймерами, специфичными для TRECs, KRECs и TCRAC (см таблицу 1).
| TRECs | вперед | 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 ' |
| обратный | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA ТТТ GC-3 ' | |
| KRECs | вперед | 5'-ССС AAG СТТ TCA GCG CCC ATT ACG ТТТ CT-3 " |
| обратный | 5'-ССС AAG СТТ GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 " | |
| TCRAC | вперед | 5'-G AC тег ТАТ GAG ACC GTG ACTТГК CAG-3 " |
| обратный | 5'-G AC тег ТГК TGT TGT TGA AGG ВКТ ТТГ C-3 " |
Таблица 1. Праймеры, используемые для процедуры клонирования. В 5'-конце, в нижнем регистре показаны нуклеотиды, соответствующие сайты рестрикции, а курсивом добавили фланкирующих нуклеотидов.
- Выполнение реакции ПЦР в конечном объеме 25 мкл, состоящий из 1x-буфера II, 1,5 мМ MgCl 2, дНТФ смесь (200 мкМ каждого праймера), в конечной концентрации 900 нМ, AmpliTaq ДНК-полимеразы (2,5 ед / 25 мкл), и 100 нг ДНК.
- Используйте следующие параметры ПЦР: первый шаг при 95 ° С в течение 10 мин, а затем 40 циклов 95 ° С в течение 30 сек; 60 ° С в течение 30 сек; 72 ° С в течение 30 сек, и, наконец, один цикл при 72 ° С в течение 10 мин. Длина продукта ПЦР должны быть: 380 б.п. TRECs, 166 б.п. КРЭЦ, 381 б.п. TCRAC.
- Вставьте ПЦР-продукт TREC-SJ в акцепторного сайта Т.А. pCR2.1-ТОРО вектора. Преобразование плазмидной ДНК в XL1-Blue компетентные клетки химически путем теплового шока в соответствии с протоколом, снабженной клеток. Среди колоний, которые растут из-за устойчивости к ампициллину, указываются лица, вставку, которая появится белый из-за потери β-галактозидазы дополнения и привить их в мастер-Петри. И, наконец, идентификации колоний, содержащих фрагмент TREC с помощью ПЦР.
- Развернуть одной из приоритетных колоний и очистить ДНК плазмиды с использованием минипрепаративного набора плазмиды и следуйте инструкциям изготовителя. Дайджест плазмидной ДНК и TCRAC амплифицированного продукта с рестриктазой SpeI и лигируют фрагмент TCRAC в сайте рестрикции SpeI.
- Преобразование ДНК плазмиды в XL1-Blue клеток и определить колонии, содержащие фрагмент TCRAC с помощью ПЦР. Развернуть одной из приоритетных колоний и очиститьплазмидной ДНК с использованием набора плазмиду минипрепаративную.
- Дайджест плазмидной ДНК и KREC продукта амплификации с Hind III, и клонировать KREC-SJ фрагмент в HindIII сайт рестрикции. Преобразование ДНК плазмиды в XL1-Blue клеток и определить колонии, содержащие третий фрагмент с помощью ПЦР.
- Проверка, путем прямого секвенирования, наличие трех вставок и отсутствие мутаций. Карта конечном тройной вставки плазмиды представлена на фигуре 1.
Рисунок 1. Triple-вставка карта плазмиды. Triple-вставка плазмиды карта, показывающая положение TREC, Krec, TCRAC последовательностей и сайты рестрикции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
- Развернуть одной из приоритетных колоний, очистить плазмиды ДНК с использованием набора плазмиды midiprep. Определить концентрацию плазмидной ДНК методом спектрофотометрического оценки на 260/280 нм и качество ДНК с помощью гель-электрофореза. Хранить соответствующие аликвоты плазмиды при -80 ° С (напр., 50 мкл каждый).
2. Стандартный Подготовка Curve
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка всех разведений в 0,1 x ТЕ-буфера в месте, специально разработанной для сдерживания ДНК переносимых.
- Вычислить массу чисел копий плазмиды, представляющих интерес (таблица 2), принимая во внимание, что размер плазмида 4846 п.н. и что средняя масса на BP является 1,096 х 10 -21 г / ВР, и, следовательно: т р = ( 4846 б.п.) х (1,096 х 10 -21 г / BP) = 5,311.216 х 10 -21 г = 5,311 х 10 -18 г.
| Копировать # | х 5,311 х 10 -18 г | Масс-плазмидной ДНК (г) |
| 1 х 10 6 | 5,311 х 10 -12 |
| 1 × 10 5 | 5,311 х 10 -13 |
| 1 х 10 4 | 5,311 х 10 -14 |
| 1 х 10 3 | 5,311 х 10 -15 |
| 1 х 10 2 | 5,311 х 10 -16 |
Таблица 2. Масса плазмиды, необходимый для каждой стандартной точки разбавления кривой.
- Рассчитать концентрации плазмидной ДНК путем деления необходимые плазмиды массы на объем (5 мкл), чтобы быть пипеткой в каждой реакции (таблица 3).
| Масс-плазмидной ДНК (г) | ÷ 5 мкл | Конечная концентрация плазмидной ДНК (г / мкл) |
| 5,311 х 10 -12 | 1,062 х 10 -12 | |
| 5,311 х 10 -13 | 1,062 х 10 -13 | |
| 5,311 х 10 -14 | 1,062 х 10 -14 | |
| 5,311 х 10 -15 | 1,062 х 10 -15 | |
| 5,311 х 10 -16 | 1,062 х 10 -16 |
Таблица 3. Расчет концентраций плазмид, необходимых для каждой точки разбавления.
- Оттепель аликвоту плазмиды. Линеаризации 2 мкг плазмидной ДНК с помощью XhoI и определить его концентрацию бу спектрофотометрический оценка на 260/280 нм.
- Подготовка надлежащего разбавление линеаризованной плазмидной ДНК с целью достижения более удобной работы маточного раствора, чтобы начать с (например, 100 нг / мкл = 0,1 мкг / мкл = 1 х 10 -7 г / мкл). Хранить остаток линеаризованной плазмидной ДНК при -80 ° С.
- Выполнение удобным количество 1:10 или 1: 100 разбавлении довести плазмиды в более работоспособным концентрации 1 х 10 -10 г / мкл.
- Используйте формулу C 1 V 1 = C 2 V 2 для расчета объема разбавления (V 2 - V 1), необходимых для подготовки первой точки серии стандартной кривой (1 х 10 6 копий, соответствующих 1,062 х 10 -12 г / 5 мкл, см таблицу 4).
| Начальная конц. (Г / мкл) | Т ДНК плазмиды (мкл) | DilueNT VOL (мкл) | Заключительный Vol. (Мкл) | Заключительный конц. (Г / мкл) | Заключительный количество копий ДНК плазмиды / 5 мкл |
| С 1 | V 1 | V 2 -V 1 | V 2 | С 2 | |
| 1 х 10 -7 | 5 мкл | 45 мкл | 50 мкл | 1 х 10 -8 | НЕТ ДАННЫХ |
| 1 х 10 -8 | 5 мкл | 495 мкл | 500 мкл | 1 х 10 -10 | НЕТ ДАННЫХ |
| 1 х 10 -10 | 5 мкл | 465 мкл | 470 мкл | 1,062 х 10 -12 | 1 х 10 6 |
| 1,062 х 10 -12 | 50 мкл | 450 мкл | 500 мкл | 1,062 х 10 -13 | 1 × 10 5 |
| 1,062 х 10 -13 | 50 мкл | 450 мкл | 500 мкл | 1,062 х 10 -14 | 1 х 10 4 |
| 1,062 х 10 -14 | 50 мкл | 450 мкл | 500 мкл | 1,062 х 10 -15 | 1 х 10 3 |
| 1,062 х 10 -15 | 50 мкл | 450 мкл | 500 мкл | 1,062 х 10- 16 | 1 х 10 2 |
Таблица 4. Разведение расчеты.
- Продолжайте серии регулярных 1:10 разведения, чтобы получить оставшиеся стандартные точки кривой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте вихрь каждого разведения плазмиды кратко перед выполнением следующего.
ПРИМЕЧАНИЕ: высокий титр Санкт-andard кривой (10 копий / мкл 5) должны быть получены непосредственно перед выполнением анализа, потому что, например небольшое количество плазмидной ДНК не достаточно стабильна, чтобы быть сохранены для использования в будущем. - Хранить точки разбавления тройной плазмиды при -80 ° С в отдельные пробирки до использования. Разбавляют тройным ДНК плазмиды очень стабильным в течение по крайней мере 6 месяцев.
3. ДНК Извлечение из целевых образцов
- Отдельная PBMC из периферической крови, собранной в ЭДТА пробирки с использованием метода разделения градиент плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте другой соответствующий исходный материал (например, сортируются субпопуляции лимфоцитов крови, цельная кровь) как целевой выборки. - Извлечение ДНК из МКПК целевых образцов, как сообщается в шаге 1.2.
4. ПЦР в реальном времени для количественного определения TRECs и KRECs
- Подготовка Плиты и нагрузка:
- Устройте ПЦР пластины, включая по крайней мере двух повторах для каждого образцовдолжны быть проанализированы: стандартная кривая (→ F 1 → 4), положительный контроль (CTRL +; G1 → 4) и не-шаблон элемента управления (NTC; H 1 → 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте типичную схему в таблице 5, но разные форматы могут быть созданы. Помните, что TRECs и KRECs будет усиливаться вместе в одних и тех же скважин, отличных от тех, TCRAC.
- Устройте ПЦР пластины, включая по крайней мере двух повторах для каждого образцовдолжны быть проанализированы: стандартная кривая (→ F 1 → 4), положительный контроль (CTRL +; G1 → 4) и не-шаблон элемента управления (NTC; H 1 → 4).
| TRECs + KRECs | TCRAC б | TRECs + KRECs | TCRAC | TRECs + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 10 6 копий | 10 6 копий | 10 6 копий | 10 6 копий | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 | |
| В | 10 5 копий | 10 5 копий | 10 5 копий | 10 5 копий | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 копий | 10 <SUP> 4 копии | 10 4 копий | 10 4 копий | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | 10 3 копии | 10 3 копии | 10 3 копии | 10 3 копии | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Е | 10 2-х экземплярах | 10 2-х экземплярах | 10 2-х экземплярах | 10 2-х экземплярах | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 копий | 10 копий | 10 копий | 10 копий | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
Таблица 5. Пример ПЦР в реальном времени пластина.
- Рассчитать общее количество скважин, необходимых (в том числе 1 - 2 дополнительные скважины для учета возможных ошибок пипеток) и подготовить мастер смеси для TRECs / KRECs и TCRAC в отдельные пробирки (таблица 6).
. Примечание: праймеры и зонды, специфичные для TRECs, KRECs и TCRAC упоминаются в таблице 7 праймеров и зондов окончательные концентрации 900 нМ и 200 нМ, соответственно.
- Рассчитать общее количество скважин, необходимых (в том числе 1 - 2 дополнительные скважины для учета возможных ошибок пипеток) и подготовить мастер смеси для TRECs / KRECs и TCRAC в отдельные пробирки (таблица 6).
| TRECs / KRECs | TCRAC | ||
| H 2 O | 2 мкл | H 2 O | 4,75 мкл |
| KRECs для 20 пмоль / мкл | 1,125 мкл | TCRAC для 20 пмоль / мкл | 1,125 мкл </ TD> |
| KRECs оборотов 20 пмоль / мкл | 1,125 мкл | TCRAC оборотов 20 пмоль / мкл | 1,125 мкл |
| KRECs зонд 10 пмоль / мкл | 0,5 мкл | TCRAC зонд 10 пмоль / мкл | 0,5 мкл |
| TRECs для 20 пмоль / мкл | 1,125 мкл | 2x TaqMan Всеобщая PCR Master Mix | 12,5 мкл |
| TRECs оборотов 20 пмоль / мкл | 1,125 мкл | ||
| TRECs зонд 10 пмоль / мкл | 0,5 мкл | ||
| 2x TaqMan Всеобщая PCR Master Mix | 12,5 мкл | ||
Таблица 6. Объем реагентов, необходимых для указанных скважин.
| TRECs | вперед | 5'-CACTC CCT TTC AAC CAT GCT-3 " |
| обратный | 5'-AGG ТГК ТГК СТА ТГК АТС-3 ' | |
| зонд | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT ТТТ GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 " | |
| KRECs | вперед | 5'-TCC СТТ AGT GGC ATT ATT TGT УВД ACT-3 |
| обратный | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG АГТ-3 " | |
| зонд | 5'-HEX-TCT ГПК CGG ГПК ГПК GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | вперед | 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT СТТ-3 " |
| обратный | 5'-GGA ТТТ AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| зонд | 5'-FAM-TCC CAC AGA ТАТ CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 " |
Таблица 7. Последовательность праймера и зондов для реального времени ПКR тест.
- Добавить 20 мкл каждой смеси (TRECs / KRECs и TCRAC). Перед тем как покинуть комнату подготовки реагентов, печать реакционного планшета с оптическим клейкой крышкой.
- В комнате экстракции нуклеиновой кислоты, поднять клейкую крышку и добавить 5 мкл геномной ДНК образца (400 - 500 нг) в лунки. Добавить 5 мкл геномной ДНК (т.е., приготовленного из РВМС, полученных из пуповинной крови) в лунки CTRL +.
Примечание: В качестве альтернативы пуповинной крови, используют ДНК из одной и той же известно, положительной пробе крови периферической или пула образцов, или подготовить "искусственный" положительный стандарт смешиванием определенного количества тройной вставки плазмиды с геномной ДНК из TREC- и KREC-отрицательных клеточных линий. - Добавить 5 мкл воды к NTC скважин. Уплотнение реактивную пластину снова оптического адгезионного покрытия.
- Перемещение к месту, обеспечивая удержание плазмиды ДНК переносимых; оттепель каждого разведения POINт стандартного ДНК плазмиды кривой непосредственно перед использованием и подготовить наибольшее разведение (10 копий / 5 мкл). Поднимите клея крышку только с → H 1 → 4 скважин и добавить 5 мкл каждого разведения точки стандартного ДНК плазмиды кривой. Печать клейкую крышку снова.
- Проверить отсутствие пузырьков на дне лунки, тем самым обеспечивая, что реагенты расположены в нижней части.
- Запустите анализа в режиме реального времени системы ПЦР. Стандартный протокол состоит из первой стадии при 50 ° С в течение 2 мин, начальной нагревания при 95 ° С в течение 10 мин, а затем 45 циклов денатурации при 95 ° С в течение 15 сек, и в сочетании праймеров / зондов отжига и удлинения при 60 ° С в течение 1 мин.
- Сохранение данных в конце программы PCR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать ДНК перекрестного загрязнения, помните: чтобы следовать обычной хорошие рекомендации лабораторной практике для количественного ПЦР при настройке в режиме реального времени ПЦР: использовать отдельные районы / помещения для выделения нуклеиновых кислот,Подготовка реагентов, плазмиды манипуляции, реакция амплификации; использовать отдельные наборы пипеток; изменить перчатки / пальто по мере необходимости.
- Результаты и расчет:
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги основаны на нашем опыте использования программного обеспечения, поставляемого с ПЦР в реальном времени инструментам, упомянутым в таблице материалов, но, в целом, они должны применяться к другим в режиме реального времени платформ анализа ПЦР и программного обеспечения. Имейте в виду, что даже при использовании того же программного обеспечения, как правило, есть больше чем один способ выполнить необходимые команды (например, иконки, ярлыки).- Откройте сохраненный файл результатов в программном обеспечении и перейдите на вкладку "Результаты". В верхней части окна нажмите на меню "Анализ" и выберите "Параметры анализа". Пусть программа автоматически определяет порог, выбрав "Все" детекторы и "Auto CT" (КТ = пороговый цикл. Пусть набор программ "Автоматическая Базовый"; для фоновой ликвидации по умолчанию.
- Перейдите на вкладку под названием "Усиление земля", а в правую часть окна, выберите один из трех «детекторов» в соответствующем раскрывающемся меню (например, начать с TRECs). Чуть ниже, выберите "Manual Ct" вручную установить порог; перейти к нижней части окна и выбрать соответствующие лунки стандартных точек кривой разведения выбранного детектора, чтобы показать амплификации участков. Для этого просто нажмите и перетащите курсор мыши на соответствующие ячейки таблицы.
- Чтобы настроить порог вручную, перетащите красный пороговую линию вверх и вниз, а затем нажмите кнопку "Анализ", чтобы повторно проанализировать результаты. Чтобы проверить, как установка порога влияет на результаты, выберите вкладку "Отчет", и увидеть результат Ct соответствующих стандартных точек разбавления кривой. При перемещении порог, попробуйте выполнить следующие рекомендации для получения оптимального размещения.
- Вернуться к вкладке "Усиление заговор" и убедитесь, что порог находится в области экспоненциального усиления достаточно выше фонового шума, но ниже фазе плато. Если усиление участка не отображается в логарифмической шкале, щелкните правой кнопкой мыши на участке, чтобы вспомнить "График Настройки" и установить после запуска установки Y-ось, как "войти", установите порог на полпути в линейной части участок, и наблюдать кривые амплификации приблизительно параллельно друг другу.
- Перейдите на вкладку "Отчет", чтобы увидеть результаты КТ. Убедитесь, что порог размещение результаты, которые максимизируют точность двух повторах каждого стандарта точек разбавления кривой.
- Убедитесь, что порог находится в точке, которая наилучшим образом отражает крайние порядков стандартных точек разбавления кривой (оптимальная чувствительность). Повторите шаг 4.2.2 и остальные подшагов для оставшихся двух детекторов (KRECs и ТCRAC).
- Перейти к закладке Отчет, перетащите мышью снова в таблице в нижней части окна, чтобы выбрать ячейки, соответствующие лунки стандартной кривой для всех извещателей (TRECs, KRECs, TCRAC). Убедитесь, что в результате Ct из трех целей очень похожа на тех же точках разбавления (например, разница не более 0,5 Ct). Отрегулируйте порог в случае необходимости и повторно проверить.
Примечание: Из-за тройной вставка плазмида содержит одно- копию каждого целевого и, следовательно, отношение усиления теоретически должна быть близко к 1: 1: 1. В некоторых случаях это может быть необходимо, чтобы вручную регулировать также основу для одного или более детекторов, чтобы получить лучшие результаты. Достаточно вспомнить окно "Параметры анализа", выберите детектор, для которых требуется регулировка, а затем установите «Manual Базовый уровень", а затем вставьте пользовательские значения для конечных циклов (как правило, от 3 до 15) Начало и. Затем нажмите "OK & повторный анализ" и проверьте предыдущие пункты. - Примите экспериментальный сеанс только после проверки следующее:
- Перейдите на вкладку "Отчет", перейдите к нижней части окна, выберите NTC скважин и убедитесь, что соответствующие КТ "Undet" (то есть, амплификации не присутствует в NTC скважин).
- Выберите вкладку "стандартной кривой" и смотреть в правой части окна участка; выберите детекторы из выпадающего меню и посмотреть, колеблется ли сообщил стандарт наклон кривой между -3,55 и -3,32 (что соответствует ПЦР КПД 91 - 100%)
- Убедитесь, что коэффициент детерминации (R 2) выше, чем 0,998 (рис 2), читая его значение прямо под наклоном и перехвата (в той же вкладке "Стандартный кривой", после выбора каждого детектора).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на крайних точек разбавления, потому что их смещение может повлиять на наклон легче (они имеют высокий «Левеярость "эффект на линии регрессии). В частности, имейте в виду, что наибольшее разведение плазмиды могут ухудшить раньше, чем ожидалось. Тем не менее, всякий раз, когда это возможно, полезно, чтобы не отказаться от них, потому что рациональный подход может заключаться в рассмотрении 100 как предел количественного определения: иными словами, для образцов между 10 и 100, результат может быть представлены как <100 или "положительный , но не количественно ", а если вне диапазона (<10) кривой, могут быть отправлены в 0 или" обнаружить ".
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно сохранить архив значений Ct предыдущих стандартных разведений кривой, для того, чтобы рассчитать среднее значение для каждой точки разбавления должны храниться как своего рода оптимального "ссылка" диапазона или внутренней проверки качества для будущих экспериментов (например, вычислить среднее и SD построить контрольные карты Шухарта). Аналогично, это может быть полезно, чтобы сохранить архив прошлом Ct положительного контроля.
Рисунок 2. Стандартные кривые для TRECs, KRECs и TCRAC. Земельные стандартных точек кривой и лог-линия регрессии оценки для TRECs (а), KRECs (B), и TCRAC (C) строятся для проверки соответствия с идеальным экспоненциальный величина прироста (наклон = 3.32), что соответствовало бы эффективность 100%. Ct: пороговый цикл; R 2:. Коэффициент регрессии определения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.- Перейдите на вкладку "Отчет" и убедитесь, что Ct положительного контроля (находится в соответствующих ячейках таблицы под графиком) согласуется с результатами предыдущих анализов на самне известно, положительный контроль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладка "Отчет" показывает количество TRECs, KRECs и TCRAC образцов проходит испытания, что программное обеспечение рассчитывается путем интерполяции из соответствующего стандартной кривой, используя значения Ct, полученные после порога и базового установлены надлежащим образом ( Новый анализ с новой пороговой / основные бы изменить эти результаты). Чтобы увидеть, где интерполяция происходит на стандартной кривой, выберите вкладку "Стандартная кривая", а затем выберите нужные скважин, и смотреть на черном "X" появляется на регрессионной линии. Их стоимость у-ось с интерполяцией количество. При использовании всегда один и тот же положительный контроль, соответствующие референсные значения и / или таблицы контроля качества может быть построена на основе предыдущих значений, определенных на положительной контроля.
- Перейдите на вкладку "Отчет" и убедитесь, что Ct положительного контроля (находится в соответствующих ячейках таблицы под графиком) согласуется с результатами предыдущих анализов на самне известно, положительный контроль.
- Нажмите на меню "Файл", "Сохранить", а затем "Экспорт" в файл .csv для экспорта количества всех скважин в ТЕXT-файл, содержащий значения, разделенные запятыми.
- Импорт the.csv файл в редакторе электронных таблиц и подсчитать количество TRECs или KRECs на 10 6 РВМС, установив следующую формулу соответствующим образом: [(среднее количество TRECs или KRECs) / (среднее количество TCRAC / 2)] х 10 6
ПРИМЕЧАНИЕ: среднее количество TCRAC делится на 2, потому что в каждой клетке есть два гена TCRAC копии, например, один для каждой хромосомы.
ПРИМЕЧАНИЕ: консистенция конечного числа TRECs и KRECs положительного контроля можно рассматривать, но имейте в виду, что значения не будут идеально соответствовать, потому что добавленной изменчивости стандартных точек разбавления кривой. В случае грубого расхождения, эксперимент, возможно, потребуется повторить. Опять же, контрольные карты могут быть построены для установки соответствующего диапазона задания. - (Необязательно, но рекомендуется) Если результаты полного анализа крови имеются, рассчитать TRECs или KRECs на мл крови, используя следующую формулу:
TRECs или KRECs в 1 × 10 6) X (+ лимфоцитов моноцитов рассчитывать в 1 мл крови) / 10 = 6 копий / мл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ проводили в репрезентативной выборке 87 здоровых: 42 детей в возрасте от 0 - 17 (мужчины / женщины: 25/17) и 45 взрослых в возрасте 24 - 60 (мужчины / женщины: 29/16). Результаты были получены в TRECs и KRECs на 10 6 РВМС, а затем TRECs и KRECs на мл крови были рассчитаны.
Количество TRECs уменьшается с возрастом из-за инволюции тимуса, 4, в частности, в очень резкой манере от 0 до 3 - 4 лет. У взрослых, количество TREC также зависит от пола, потому что уменьшается быстрее, у мужчин, чем у женщин. 5 Это может создать проблемы в установлении соответствующих референтные значения, которые должны быть дифференцированы на основе возраста и, возможно, пола, если это очень точное Оценка нормальности необходимо.
Рисунок 3. TREC количественное в себя здоровыми, НОРС. количество TRECs была определена как TRECs / 10 6 клеток у здоровых детей (А) и взрослых (B), а затем вычисляется как TRECs / мл в тех же субъектов (C, D). Очистить круги: женщины; черные кружки: у мужчин. Линии были получены с использованием данных журнала-трансформированных с помощью линейной регрессии. У детей, две линии регрессии были установлены, чтобы лучше представить переменную скорость TREC снижение с возрастом. У взрослых, пунктирные линии представляют собой тенденцию снижения с возрастом TRECs видели у женщин, которые медленнее, чем у мужчин (сплошная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Число KRECs уменьшается с возрастом с рисунком, аналогичным TRECs только у детей, в то время как у взрослых выход костного мозга является достаточно стабильной в течение всей жизни и не зависит от пола.
_content "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 4:. KREC количественное у здоровых доноров количество KRECs была определена как KRECs / 10 6 клеток у здоровых детей (А) и взрослых (B), а затем вычисляется как KRECs / мл в тех же субъектов (C, D). Очистить круги: женщины; черные кружки: у мужчин. Линии были получены с использованием данных журнала-трансформированных с помощью линейной регрессии. У детей, две линии регрессии были установлены, чтобы лучше представить переменную скорость KREC уменьшается с возрастом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Для представительских целей, простые модели регрессии Логлинейный были установлены, чтобы изобразить картину TREC / KREC уменьшается с возрастом, но более тонкие нелинейные модели могут быть оснащены Iп попытка лучше прогнозировать, казалось бы, экспоненциальное падение KREC / TREC с возрастом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
