Introduction
T-hücresi reseptör eksizyon daire (TREC) ve K-silme rekombinasyon eksizyon daire (KRECs), genomik bir DNA yeniden birleştirme işlemi sırasında T ve sırasıyla A, B-hücreleri, bir oranda kesilmiş küçük daireselleşmiş DNA elemanları vardır giden Bir çok çeşitlendirilmiş T- repertuarına ve B-hücre reseptörleri oluşumu. Onlar hiçbir işlevi var, ama onlar kararlı ve taklit edilemeyen, çünkü onlar, böylece sadece iki kızı hücrelerin birinde ısrar, her hücre bölünmesinde sonra sulandırılır. Bu nedenle, periferik kandaki düzeylerinin timus, kemik iliği çıkışı bir tahmini olarak kabul edilebilir.
TREC tahlil ölçüde timik çıktı kapsamını değerlendirmek için son 15 yılda kullanılmış olsa da, başlangıçta geliştirilen 1 Krec deneyi, B-hücresi çoğalmasını ve sağlık ve hastalık B-hücresi homeostasisin katkılarını, 2 ölçmek için ancak son zamanlarda kemik m marker olarak önerilmiştirçıktı ok. 3,4 Burada, biz TREC ve KRECs hem eşzamanlı ölçümü için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. 4
Bu kombine yöntem ile, gerçek zamanlı PCR ile DNA miktar ile ilişkili değişkenlik TREC, KRECs ve T-hücresi reseptörü alfa sabit fragmanlarını ihtiva eden bir üç-uç plazmid seyreltilmesi ile elde edilen eşsiz bir standart eğri kullanımı (TCRAC) ile ortadan kaldırılır 1: 1 oranında bir 1 geni. Bu TREC ve Krec kopya sayısında daha doğru bir değerlendirme sağlar. Ayrıca, aynı reaksiyonda iki hedef aynı anda miktar reaktif maliyet azalmasını sağlar.
Önerilen TREC / Krec tahlil Şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID), 4 Ortak Değişken İmmün Yetmezlik, 5 otoimmün hastalıklar, 6-8 ve HIV enfeksiyonu olan çocuklarda veya yetişkinlerde T- kapsamını ve B-hücresi neo-üretim ölçmek için yararlı olabilir . 9 Ayrıca, için kullanılabilirHastalar Krec kantifikasyonunu kullanılarak tespit edilebilir agamaglobülinemı SCID hastalarda altta yatan genetik bozukluklara rağmen TREC testi kullanılarak tanınan, çünkü Sonunda. 6-8 hematopoetik kök hücre nakli, 10 enzim replasmanı, 11 ve antiviral 9 veya bağışıklık tedaviler sonrasında bağışıklık ayilmanizi, ve , TREC / Krec deneyi de doğan tarama programlarına immün yetersizlikler tespit etmek için de kullanılabilir. Bu durumda, 12, test kan lekelenir küçük noktalar ekstre DNA üzerinde yapıldığında ve filtre kağıdı üzerinde kurutuldu gerekir, son derece hassas ve spesifik olmalıdır Hedef hastalıklar yanı sıra, oldukça üretilebilir ve maliyet-etkin bir.
Wisconsin introduc ilk olunca test Krec miktar giriş rutin 2008 yılından bu yana ABD (WI, MA, CA) bazı bölgelerinde yapılmıştır immün için yenidoğan tarama, performanslarını artırmak gerekironun doğum tarama programında TREC e analizi. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Etik bildirimi: Bu protokol, bizim kurum, Spedali Civili di Brescia yönergeleri takip
Bir "Üç-Ekle" Plasmidinin 1. Hazırlık
- Seçim ve uygun başlangıç malzemesinin hazırlanması:
- EDTA tüpleri içine toplanan bir genç, sağlıklı konunun periferik kan gibi PCR ile saptanabilir TREC ve KRECs olması çok muhtemel hücreleri içeren bir örnek alın.
NOT: Başlangıçta, biz KRECs için bademcik parçalardan TREC ve mononükleer hücreleri için timositleri kullanarak yöntemi geliştirmişti, ama sağlıklı denek genellikle TREC ve PCR ile kendi algılama sağlamak için yeterli KRECs bir miktar var. Bu nedenle, çevresel kan elde edilir ve daha kolay çalışmak için geçerli bir alternatif olması gerekir. Eğer TREC, özellikle bir çocuklar, genç yetişkin sağlıklı yetişkin yaş, periferik kan azaldığı göz önüne alındığında, tavsiye edilir. - Ayrı periferal kan mononucStandart bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemiyle emizle hücreleri (PBMC).
- EDTA tüpleri içine toplanan bir genç, sağlıklı konunun periferik kan gibi PCR ile saptanabilir TREC ve KRECs olması çok muhtemel hücreleri içeren bir örnek alın.
- DNA ekstraksiyon:
- Ticari DNA Kan Mini Kit kullanılarak PBMC'den DNA ayıklayın. Aşağıda açıklanan birkaç değişiklik ile üreticinin talimatlarına uyun.
- 1400 rpm'de bir çalkalama-inkübatör kullanılarak 10 dakika boyunca 70 ° C (yerine 56 ° C) inkübe edin.
- 70 ° C'de 5 dakika inkübe edilir ve üreticinin talimatlarına uygun olarak santrifüj ile DNA Zehir, sütun 70 ° C sıcaklıkta ısıtıldı elüsyon tamponu ekleyin. 260/280 nm spektrofotometrik tahmin tarafından çıkarılan DNA konsantrasyonu belirleyin.
- Ticari DNA Kan Mini Kit kullanılarak PBMC'den DNA ayıklayın. Aşağıda açıklanan birkaç değişiklik ile üreticinin talimatlarına uyun.
- TREC ve Krec sinyal eklemler (SJ) ve TCRAC referans gen oranında ek içeren bir plazmidin hazırlanması:
- TREC, KRECs ve TCRAC için özel primerler ile (TREC-SJ, Krec-SJ ve TCRAC fragmanlarını elde etmek için) PBMC'den elde edilen DNA'yı çoğaltmak (Tablo 1 e bakınız).
Not: 5'-sonunda KREC- ve TCRAC özgü primerler (italik olarak gösterilen) ilave yan nükleotidlerini uygun bir sayısı ile (Tablo 1 gösterilen dizilerin alt-durumunda) Hindlll ve Spel kısıtlama siteleri içeren; Her iki özellik de kanonik Krec ve TCRAC dizilerinde mevcut değildir.
- TREC, KRECs ve TCRAC için özel primerler ile (TREC-SJ, Krec-SJ ve TCRAC fragmanlarını elde etmek için) PBMC'den elde edilen DNA'yı çoğaltmak (Tablo 1 e bakınız).
| TREC | ileri | 5'-AAA GAG GGC AGC SKK CTC CAA GGC-3 ' |
| ters | 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 ' | |
| KRECs | ileri | 5'CCC aag CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 ' |
| ters | 5'CCC aag CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 ' | |
| TCRAC | ileri | 5'G ac etiketi Tat GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 ' |
| ters | 5'G ac etiketi TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 ' |
Tablo 1. primerler, klonlama işlemleri için de kullanılır. 5'-sonunda daha düşük durumda restriksiyon enzim sahalarına karşılık gelen nükleotidler gösterilmiştir, italik olarak yan nükleotidlerini ilave olarak gösterilmektedir, oysa.
- 1x Tampon II, aşağıdakilerden oluşan, 25 ul'lik bir nihai hacim içinde, PCR reaksiyonları gerçekleştirmek 1.5 mM MgCl2, (200 uM her biri), astar 900 nM, AmpliTaq DNA Polymerase (2.5 U / 25 ul) nihai konsantrasyonda dNTP karışımı, DNA 100 ng.
- Aşağıdaki PCR parametreleri kullanın: 10 dakika boyunca 95 ° C de ilk adım, 30 saniye için 95 ° C 40 döngü, ardından; 30 saniye için 60 ° C; 30 saniye için 72 ° C ve 10 dakika için 72 ° C ve son olarak 1 döngü. PCR ürünü, uzunlukları olmalıdır: TREC için 380 bp, K 166 bp'likRECs, TCRAC 381 bp'lik.
- PCR2.1-TOPO Vektör TA alıcı sitesinde TREC-SJ PCR ürünü yerleştirin. Hücreler birlikte verilen protokol takip edilerek ısı şoku ile XL1-mavi kimyasal yetkili hücreleri plazmid DNA dönüşümü. Çünkü ampisilin direnç büyür koloniler arasında, çünkü kaybedilen β-galaktosidaz tamamlama beyaz görünmesini ve bir ana yemek onları aşılamak olacak eki taşıyan kişileri belirlemek. Son olarak, PCR ile, TREC fragmanını içeren koloni belirler.
- Belirlenen kolonilerin birini genişletin ve bir plazmid miniprep kiti kullanılarak plazmid DNA arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun. Plazmid DNA ve Spel kısıtlama enzimi ile TCRAC büyütülmüş ürün Digest ve Spel kısıtlama sitesine TCRAC fragmanını ligate.
- XL1-Blue hücrelerinin plazmid DNA Dönüşümü ve PCR ile TCRAC fragmanını içeren koloni belirler. Belirlenen kolonilerin birini genişletin ve arındırmakplazmid miniprep kiti kullanılarak plazma DNA.
- Plazmid DNA ve HindIII ile Krec büyütülmüş ürün Digest ve Hind III kısıtlama sitesine Krec-SJ parçacığın klonlanması. XL1-Blue hücrelerinin plazmid DNA Dönüşümü ve PCR ile, üçüncü fragmanını içeren koloni belirler.
- Doğrudan dizileme ile, doğrulayın, üç ekler varlığı ve mutasyonların olmaması. Son üç-insert plazmid haritası Şekil 1'de temsil edilir.
Şekil 1. Üç-insert plazmid haritası. TREC, Krec, TCRAC dizileri ve sınırlama enzimi siteleri konumunu gösteren Triple-insert plazmid haritası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Tespit kolonilerin birini aç bir plazmid midiprep kiti kullanılarak plazmid DNA arındırmak. 260/280 nm'de spektrofotometrik tahmin plazmid DNA konsantrasyonu ve jel elektroforezi ile DNA kalitesini belirler. -80 ° C de plazmidin uygun alikotları saklayın (örn., 50 ul) ekstrakte edildi.
2. Standart Eğri Hazırlık
NOT: Özel olarak DNA taşıma-over altına için tasarlanmış bir yerde 0.1x TE tamponunda tüm dilüsyonları hazırlayın.
- (M p =: ilgi plazmid kopya sayılarının kütlesini hesaplayın plazmid boyutu 4846 bp olduğunu dikkate alarak, (Tablo 2) ve bp başına ortalama kütle 1,096 x 10 -21 gr / bp ve bu nedenle bu 4846 bp), X (1,096 x 10 -21 gr / bp) = 5,311.216 x 10 -21 gr = 5,311 x 10 -18 gr.
| Kopya # | X 5,311 x 10 -18 gr | Plazmid DNA kütlesi (g) |
| 1 x 10 6 | 5,311 x 10 -12 |
| 1 x 10 5 | 5,311 x 10 -13 |
| 1 x 10 4 | 5,311 x 10 -14 |
| 1 x 10 3 | 5,311 x 10 -15 |
| 1 x 10 2 | 5,311 x 10 -16 |
Her bir standart eğri dilüzyon noktası için gereken plazmid Tablo 2. Mass.
- Her reaksiyon pipetle gereken hacmi (5 ul) ile gerekli olan plazma kitleleri bölünmesiyle plazmid DNA konsantrasyonları hesaplayın (bakınız Tablo 3).
| Plazmid DNA kütlesi (g) | ÷ 5 ul | Plazmid DNA 'nın nihai konsantrasyonu (g / ml) |
| 5,311 x 10 -12 | 1,062 x 10 -12 | |
| 5,311 x 10 -13 | 1.062 x 10 -13 | |
| 5,311 x 10 -14 | 1.062 x 10 -14 | |
| 5,311 x 10 -15 | 1,062 x 10 -15 | |
| 5,311 x 10 -16 | 1.062 x 10 -16 |
Her seyreltme noktası için gerekli plazmid konsantrasyonları Tablo 3. Hesaplama.
- Plazmidin bir kısım çözülme. Xhol ile plazmid DNA 2 ug linearize ve konsantrasyonu b belirlemek260/280 nm y spektrofotometrik tahmin.
- (Örneğin, 100 ng / ml = 0.1 ug / ml = 1 x 10 -7 g / ul) başlatmak için uygun bir çalışma stok solüsyonu elde etmek için linearize plazmid DNA uygun bir seyreltme hazırlayın. -80 ° C'de linearize plazmid DNA kalan saklayın.
- 1 x 10 ~ 10 g / ul daha uygulanabilir konsantrasyonda plazmid getirmek için 100 dilüsyon: 1:10 veya 1 'uygun bir sayıda yapın.
- Serinin ilk standart eğri noktasını hazırlamak için gerekli (1 x 10 6 kopya, ilgili 1.062 x 10 -12 gr - formül C 1 V 1 = seyreltme hacmini hesaplamak C 2 V 2 (V 1 V 2) kullanın / 5 ul; bakınız Tablo 4).
| İlk kons. (G / ml) | Plazmid DNA, hacim (ul) | Diluent hacim (ul) | Nihai Vol. (Ul) | Nihai kons. (G / ml) | Plazmid DNA Final kopya sayısı / 5ul |
| C1- | V1 | V 2 -V 1 | V 2 | C2- | |
| 1 x 10 -7 | 5 ul | 45 ul | 50 ul | 1 x 10 -8 | Kullanılamaz |
| 1 x 10 -8 | 5 ul | 495 ul | 500 ul | 1 x 10 -10 | Kullanılamaz |
| 1 x 10 -10 | 5 ul | 465 ul | 470 ul | 1,062 x 10 -12 | 1 x 10 6 |
| 1,062 x 10 -12 | 50 ul | 450 ul | 500 ul | 1.062 x 10 -13 | 1 x 10 5 |
| 1.062 x 10 -13 | 50 ul | 450 ul | 500 ul | 1.062 x 10 -14 | 1 x 10 4 |
| 1.062 x 10 -14 | 50 ul | 450 ul | 500 ul | 1,062 x 10 -15 | 1 x 10 3 |
| 1,062 x 10 -15 | 50 ul | 450 ul | 500 ul | 1,062 x 10- 16 | 1 x 10 2 |
Tablo 4. Sulandırma hesapları.
- Kalan standart eğri puan elde etmek 01:10 dilüsyonlarının düzenli bir dizi ile devam edin.
NOT: Bir sonraki yapmadan önce kısaca her plazmid seyreltme vorteks unutmayın.
NOT: st en yüksek seyreltmePlazmid DNA 'nın bu gibi küçük bir miktar kadar stabil ileride kullanım için saklanabilir olmadığından, andard eğrisi (10 kopya / 5 ul), hemen tahlil yapmak önce hazırlanmalıdır. - Kullanım kadar bir diğerinden ayrı tüplerde -80 ° C 'de üç-plazmid seyreltme kredi saklayın. seyreltilmiş üç plazmid DNA, en az 6 ay için son derece stabildir.
Hedef Örneklerden 3. DNA Ekstraksiyon
- Periferik kandan ayrı PBMC yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak, EDTA tüpleri içine toplandı.
NOT: Alternatif olarak, diğer uygun başlangıç malzemesi kullanın (örneğin, lenfosit subpopülasyonunun, tam kan sıralı) hedef numune olarak. - Adım 1.2'de belirtildiği gibi hedef numune PBMC'den DNA ekstrakte edin.
TREC ve KRECs Miktarlarının 4. Real-time PCR
- Plaka hazırlama ve yükleme:
- Her bir numune için en az iki kez tekrarlanmış içeren bir PCR plakası düzenlemekanaliz edilecek: standart eğri (A → F 1 → 4), pozitif kontrol (CTRL +; G1 → 4) ve hiçbir şablon kontrolü (NTC H 1 → 4).
NOT: Tablo 5 tipik bir düzeni gözlemleyin, ancak farklı biçimleri oluşturulabilir. TREC ve KRECs TCRAC olanlardan farklı, aynı kuyulardan, birlikte amplifiye edilecek unutmayın.
- Her bir numune için en az iki kez tekrarlanmış içeren bir PCR plakası düzenlemekanaliz edilecek: standart eğri (A → F 1 → 4), pozitif kontrol (CTRL +; G1 → 4) ve hiçbir şablon kontrolü (NTC H 1 → 4).
| TREC + KRECs bir | TCRAC b | TREC + KRECs | TCRAC | TREC + KRECs | TCRAC | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Bir | 10 6 kopya | 10 6 kopya | 10 6 kopya | 10 6 kopya | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| B | 10 5 kopya | 10 5 kopya | 10 5 kopya | 10 5 kopya | 2 | 2 | 2 | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| C | 10 4 kopya | 10 <sup> 4 nüsha | 10 4 kopya | 10 4 kopya | 3 | 3 | 3 | 3 | 11 | 11 | 11 | 11 |
| D | 10 3 kopya | 10 3 kopya | 10 3 kopya | 10 3 kopya | 4 | 4 | 4 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| E | 10 2 nüsha | 10 2 nüsha | 10 2 nüsha | 10 2 nüsha | 5 | 5 | 5 | 13 | 13 | 13 | 13 | |
| F | 10 kopya | 10 kopya | 10 kopya | 10 kopya | 6 | 6 | 6 | 6 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 16 | 16 | 16 |
Tablo 5. Numune real-time PCR plaka.
- Ve ayrı tüplerde TREC / KRECs ve TCRAC (Tablo 6) için ana karışımı hazırlamak - gerekli kuyuların toplam sayısını hesaplayın (olası pipetleme hataları hesaba 2 ekstra kuyu 1 dahil).
Not:. TREC, KRECs ve TCRAC özgü primerleri ve probları, Tablo 7'de belirtilen astar ve sonda son konsantrasyonlar sırasıyla 900 nM ve 200 nM.
- Ve ayrı tüplerde TREC / KRECs ve TCRAC (Tablo 6) için ana karışımı hazırlamak - gerekli kuyuların toplam sayısını hesaplayın (olası pipetleme hataları hesaba 2 ekstra kuyu 1 dahil).
| TREC / KRECs | TCRAC | ||
| H2O | 2 ul | H2O | 4.75 ul |
| 20 pmol / ul için KRECs | 1.125 ul | 20 pmol / ul için TCRAC | 1.125 ul </ Td> |
| KRECs 20 pmol / ul devir | 1.125 ul | TCRAC 20 pmol / ul devir | 1.125 ul |
| KRECs probu 10 pmol / ul | 0.5 ul | TCRAC probu 10 pmol / ul | 0.5 ul |
| 20 pmol / ul için TREC | 1.125 ul | 2x TaqMan Evrensel PCR Master Mix | 12.5 ul |
| TREC 20 pmol / ul devir | 1.125 ul | ||
| TREC probu 10 pmol / ul | 0.5 ul | ||
| 2x TaqMan Evrensel PCR Master Mix | 12.5 ul | ||
Belirtilen Kuyular için gerekli reaktiflerin Tablo 6. Cilt.
| TREC | ileri | 5'-CAC ATC SKK TTC AAC CAT GCT-3 ' |
| ters | 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC-3 ' | |
| sonda | 5'-FAM-ACA SKK CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 ' | |
| KRECs | ileri | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3 |
| ters | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 ' | |
| sonda | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | ileri | 5'-TGG SKK AAC SKK GAT SKK CTT-3 ' |
| ters | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| sonda | 5'-FAM-TTK CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 ' |
Gerçek zamanlı PC için astar ve sondalar Tablo 7. SıraR, deneyi.
- Her bir karışımı (TREC / KRECs ve TCRAC) 20 ul ekle. Reaktif hazırlama odası ayrılmadan önce, bir optik yapıştırıcı kapağı ile reaksiyon plaka mühür.
- Bir nükleik asit ekstraksiyon odasında, yapışkan kapağını kaldırın ve genomik DNA örneği 5 ul ekleyin - kuyulara (400 500 ng). CTRL + oyuklara (göbek bağı kanından elde edilen PBMC den hazırlandı, yani,), genomik DNA 5 ul ekle.
Not: göbek kordonu kanı bir alternatif olarak, numunelerin aynı bilinen, pozitif çevresel kan numunesi ya da havuz DNA kullanmak veya TREC- genomik DNA ile üç uç plazmid önceden saptanmış bir miktarının karıştırılması ile, bir "yapay" pozitif standardı hazırlamak ve Krec-negatif hücre çizgileri dahildir. - NTC oyuklara suyun 5 ul ekleyin. Optik yapıştırıcı kapağı ile tekrar reaksiyon plaka Seal.
- Plazmid DNA taşıma-over içte sağlayan bir yere taşıyın; Her seyreltme poin çözülmeSadece Kullanmadan önce plazmid DNA standart eğri t ve yüksek seyreltme hazırlamak (10 kopya / 5 ul). Sadece bir → H 1 → 4 kuyudan yapışkan kapağını yukarı kaldırın ve plazmid DNA standart eğrinin her noktası seyreltme 5 ul ekleyin. Tekrar yapışkan kapağını Seal.
- Böylece reaktifler altta konumlandırılmış sağlanması, kuyu dibinde kabarcıkların yokluğunu doğrulayın.
- Gerçek-zamanlı PCR sistemi üzerinde tahlil çalıştırın. Standart Protokol 2 15 saniye boyunca 95 ° C 'de denatürasyon, 45 döngü, ardından dakikada, 10 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk ısıtma, ve bir araya getirilen primer / prob tavlama ve uzama için 50 ° C' de, ilk aşamada elde edilen oluşmaktadır 1 dakika için 60 ° C.
- PCR programın sonunda verileri kaydetmek.
NOT: nükleik asit ekstraksiyon için ayrı alanlar / odaları kullanın: DNA çapraz bulaşmayı önlemek hatırlamak için: kantitatif PCR için her zamanki gibi iyi laboratuar uygulamaları öneriler takip PCR testi gerçek zamanlı kurarkenreaktif hazırlama, plazmid manipülasyon, amplifikasyon reaksiyonu; Ayrı pipet setleri kullanmak; uygun eldiven / kat değiştirin.
- Bulgular ve hesaplama:
Not: Aşağıdaki adımlar genel olarak gerçek-zamanlı PCR Malzemeler Tablo belirtilen alet, ancak, birlikte verilen yazılımı kullanarak deneyime dayalı, diğer gerçek zamanlı PCR analizi platformları ve yazılımlar için de geçerli olmalıdır. Aynı yazılımı kullanarak bile, genellikle gerekli komutları (örneğin, simgeler, kısayollar) yürütmek için birden fazla yolu var, unutmayın.- Yazılım kaydedilen sonuç dosyasını açın ve "Sonuçlar" sekmesine tıklayın. Pencerenin üst kısmında, "Analiz" menüsüne tıklayın ve "Analiz ayarları" seçeneğini seçin. Yazılım "Tümü" dedektörleri ve "Otomatik Ct" (Ct = eşik döngüsünü seçerek eşiği otomatik tespit edelim. Edelim yazılım seti "Otomatik Baseline"; Varsayılan olarak arka ortadan kaldırılması için.
- Ilgili açılan menüde üç "dedektörlerin" birini seçin, pencerenin en sağdaki kısmında, "Abartma Plot" adlı sekmesine tıklayın ve (TREC ile başlayan örn). Sadece aşağıdaki el bir eşiği ayarlamak için "Manuel Ct" seçin; Pencerenin alt kısmına gidin ve büyütme araziler göstermek için seçilen dedektör standart eğri seyreltme noktalarına gelen kuyu seçin. Bunu yapmak için sadece tıklayın ve tablonun ilgili hücreler üzerinde fareyi sürükleyin.
- Tıklatın, elle eşiği ayarlamak yukarı ve aşağı kırmızı eşik çizgisini sürükleyin ve sonuçları yeniden analiz için "Analiz". Eşiği ayarı sonuçlarını nasıl etkilediğini kontrol etmek için, "Rapor" sekmesini seçin ve ilgili standart eğri seyreltme noktaları ortaya çıkan Ct bkz. Eşiği taşırken, optimal sıralarda yer almak için aşağıdaki önerilere uymak için deneyin.
- "Amplifikasyon Plot" sekmesine geri dönün ve eşik yeterince arka plan gürültü üzerinde ama plato fazı altında üstel amplifikasyon bir bölgede olduğunu doğrulayın. Amplifikasyon arsa logaritmik ölçekte gösterilir değilse, "Grafik Ayarları" ve "log" lineer bölümünde eşik yarım set gibi post-run Y ekseni ayarlarının çağırmak için arsa üzerinde sağ tıklayın arsa ve gözlemlemek amplifikasyon eğrileri yaklaşık birbirine paralel.
- Ct sonuçlarını görmek için "Raporu" sekmesine tıklayın. Eşik yerleştirme her bir standart eğri seyreltme noktalarının iki çoğaltır hassasiyeti en üst düzeye sonuçlar emin olun.
- Eşik en iyi standart eğri seyreltme noktaları (optimum hassasiyet) büyüklüğü aşırı siparişleri yansıtan noktada yer olup olmadığını kontrol edin. Kalan iki dedektör (KRECs ve T adımı yineleyin 4.2.2 ve kalan alt basamaklarıKerek).
- Rapor sekmesine gidin tüm dedektörleri (TREC, KRECs, TCRAC) için standart eğrinin kuyulara gelen hücreleri seçmek için pencerenin alt kısmındaki tabloda tekrar fareyi sürükleyin. Üç hedeflerin elde edilen Ct aynı seyreltme noktalarda çok benzer olduğundan emin olun (örneğin, fark en fazla 0,5 Ct). Gerekirse eşikleri yeniden ayarlayın ve tekrar kontrol edin.
NOT: Üç eklemek plazmid her hedef ve bu nedenle bir tek kopyasını içerdiğinden büyütme oranı teorik olarak 1'e yakın olmalıdır: 1: 1. Bazı durumlarda, el ile daha iyi sonuçlar elde etmek için detektör bir ya da daha fazla, aynı zamanda taban çizgisi ayarlamak gerekli olabilir. Sadece o "Manuel Baseline" ayarlamak, ayar gerekli olduğu dedektör seçin ve Başlangıç ve Bitiş Cycles (genellikle 3 ila 15) için özel değerler eklemek, "Analiz ayarları" penceresini çağırmak. Ardından "Tamam & yeniden Çözümle yi" linkine tıklayın ve önceki noktaları tekrar kontrol edin. - Sadece aşağıdaki doğruladıktan sonra deneysel oturumu Kabul:
- "Rapor" sekmesine tıklayın pencerenin alt kısmına gidin, NTC kuyu seçin ve ilgili Ct "Undet" olduğunu kontrol edin (yani, hiçbir amplifikasyon NTC kuyularda mevcut).
- "Standart Eğrisi" sekmesini seçin ve arsa penceresinin sağa bak; Açılan menüden seçin dedektörleri ve rapor standart eğrisi eğimi -3,55 -3,32 ile arasında değişmektedir olsun (91 verimlilik PCR tekabül - 100%) bkz
- Belirlenmesi (R 2) katsayısı (her dedektör seçtikten sonra, aynı "Standart Eğrisi" sekmesinde) sağ yamacında ve kesişim altına değerini okuyarak, 0.998 (Şekil 2) daha yüksek olduğundan emin olun.
Onlar bir yüksek "leve sahip (onların hiza eğimi etkileyebilir, çünkü daha kolay aşırı seyreltme noktalara dikkat edin: NOTregresyon hattı üzerinde öfke "etkisi). Özellikle, yüksek plazmid seyreltme beklenenden daha erken düşebilir unutmayın. Ancak, mümkün bir akılcı bir yaklaşım kantitatif tespit limiti olarak 100 düşünün olabilir, çünkü onları atmak değil yararlıdır: 10 ile 100 arasında örnekler için diğer bir deyişle, sonuç <100 veya "pozitif olarak rapor edilebilir ama ölçülebilir değil "saptanamaz", eğri aralığında (<10) dışında 0 olarak bildirilen veya eğer ise ".
NOT: Her seyreltme noktası için ortalama bir değer hesaplamak için, önceki standart eğri seyreltmelerinden Ct değerleri bir arşiv tutmak yararlı olabilir gelecekte deneyler için en uygun "referans" aralık veya iç kalite kontrol bir tür olarak tutulması (örneğin, Shewhart kontrol grafikleri oluşturmak için ortalama ve SD hesaplamak). Benzer şekilde, pozitif kontrol geçmiş Ct bir arşiv tutmak yararlı olabilir.
TREC, KRECs ve TCRAC Şekil 2. Standart eğriler. Standart eğri noktalarının Arsalar ve log-regresyon hattı TREC (A) tahminleri, KRECs (B), ve TCRAC (C) İdeal üstel uyumu doğrulamak için inşa edilmiştir % 100 bir verim tekabül edecektir amplifikasyon oranı (eğim = 3.32). Ct: Eşik döngüsü; R2:. Determinasyon regresyon katsayısı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.- "Rapor" sekmesine tıklayın ve (grafik altında tablonun ilgili hücrelerde bulunan) pozitif kontrol Ct sa önceki analizlerin sonuçları ile tutarlı olduğunu doğrulamakBeni pozitif kontrol bilinen.
NOT: "Rapor" sekmesine TREC, KRECs ve örneklerin TCRAC miktarını gösteren yazılım düzgün ayarlanmış eşik ve başlangıç sonra elde edilen Ct değerleri kullanılarak, ilgili standart eğriden interpolasyonla hesaplanan olduğu test edilen (bir Yeni bir eşik / başlangıca yeni analiz) bu sonuçları değiştirmek istiyorum. Interpolasyon standart eğri üzerinde yer alır nerede görmek için, ardından istediğiniz kuyu seçin, "Standart Eğrisi" sekmesini seçin ve regresyon hattı üzerinde görünen siyah "X" için bak. Onların y ekseni değeri interpolasyon miktarıdır. Hep aynı pozitif kontrol kullanıyorsanız, uygun referans aralıkları ve / veya kalite kontrol grafikleri pozitif kontrol belirlenir önceki değerlere dayalı, inşa edilebilir.
- "Rapor" sekmesine tıklayın ve (grafik altında tablonun ilgili hücrelerde bulunan) pozitif kontrol Ct sa önceki analizlerin sonuçları ile tutarlı olduğunu doğrulamakBeni pozitif kontrol bilinen.
- "Dosya" menüsünden tıklayın "Kaydet", ve sonra bir .csv dosyasına "İhracat" bir te tüm kuyuların miktarlarda ihracatvirgülle ayrılmış değerler içeren xt dosyası.
- Bir elektronik tablo yazılımı the.csv dosyayı içe ve uygun aşağıdaki formül ayarlayarak 10 6 PBMC başına TREC sayısını veya KRECs hesaplamak: [(TREC veya KRECs miktarı ortalama) / (TCRAC / 2 miktarı ortalama)] 10 6 x
NOT: Her hücrede örneğin iki TCRAC gen kopyaları, her kromozom için bir olduğundan TCRAC ortalama miktarı 2 ile bölünür.
NOT: TREC ve pozitif kontrol KRECs son sayısının tutarlılık kabul, ama değerler mükemmel çünkü standart eğri seyreltme puan ilave değişkenlik maç olmayacak akılda tutmak olabilir. Brüt sapma durumunda, deney tekrar edilmesi gerekebilir. Yine, kontrol grafikleri uygun bir referans aralığı ayarlamak için inşa edilebilir. - Tam kan sayımı sonuçları varsa, aşağıdaki formül kullanılarak kan ml başına TREC veya KRECs hesaplamak (isteğe bağlı, ancak önerilir):
TREC veya 1 x 10 6) X (lenfosit + monosit başına KRECs kan, 1 ml) / 10 6 = kopya / ml sayılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tahlil 87 sağlıklı kontrol temsili örneklemde gerçekleştirilmiştir: 42 çocuk 0 yaş - 17 (erkek / kadın: 25/17) ve 24 yaş 45 yetişkin - 60 (erkek / kadın: 29/16). Sonuçlar hesaplandı TREC 10 6 PBMC başına KRECs ve daha sonra kan ml'si başına TREC ve KRECs olarak elde edildi.
- 4 yıl TREC sayısı nedeniyle 0-3 çok keskin bir şekilde, özellikle de timus involüsyon, 4 yaşla birlikte azalmaktadır. Kadınlarda erkeklere göre daha hızla azalır, çünkü erişkinlerde, TREC sayısı da cinsiyet bağlıdır. 5 Bu, yaş ve cinsiyet muhtemelen temelinde farklılaştırılmış bir çok hassas eğer gereken uygun referans aralıkları, ayar sorunlar yaratabilir normallik tahmini gereklidir.
Sağlıklı do Şekil 3. TREC miktar NOR. TREC miktarı TREC / 10 sağlıklı çocuklar (A) ve aynı konularda (C, D) 'de TREC / ml olarak hesaplanmıştır sonra yetişkin (B) ve 6 hücreler tespit edilmiştir. Temizle daireler: kadın; dolu daireler: erkek. Çizgiler log dönüştürülmüş veriler kullanılarak lineer regresyon analizi ile elde edilmiştir. Çocuklarda, iki regresyon çizgileri daha iyi yaş TREC azalma değişken bir oranı temsil yerleştirilmiştir. Yetişkinlerde, kesik çizgiler erkeklerde (sürekli çizgi) daha yavaş kadınlarda görülen TREC, yaşla birlikte azalma eğilimi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yetişkinlerde kemik iliği çıkış ömrü boyunca oldukça kararlı olan ve cinsiyet bağlı değildir, oysa KRECs sayısı, sadece çocuklarda TREC benzer bir desene sahip yaşla birlikte azalmaktadır.
Her zaman ">:" tutmak-together.within-sayfa = fo "_content
Şekil 4:. Sağlıklı donorlarda Krec miktar KRECs miktarı sağlıklı çocuklar için (A) ve aynı konularda (C, D) 'de KRECs / ml olarak hesaplanmıştır sonra yetişkin (B) ve KRECs / 10 6 hücre olarak belirlenmiştir. Temizle daireler: kadın; dolu daireler: erkek. Çizgiler log dönüştürülmüş veriler kullanılarak lineer regresyon analizi ile elde edilmiştir. Çocuklarda, iki regresyon çizgileri daha iyi yaşla birlikte azalma Krec değişken oranı temsil etmek takıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Temsili amaçlar için, basit log-lineer regresyon modelleri yaş TREC / Krec azalma desen tasvir etmek monte edildi, ama daha rafine doğrusal olmayan modeller i monte edilebilirn bir girişim daha yaşla birlikte görünüşte üstel Krec / TREC azalma tahmin etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
