Introduction
T 세포 수용체 절제 원 (TRECs) 및 K-삭제 재조합 절제 원 (KRECs)는 게놈 DNA 재조합 과정 T- 각각 B-세포의 비율로 절제되어 작은 원형으로 DNA 요소이다 선도 매우 다양한 레퍼토리의 T- 및 B- 세포 수용체의 형성. 이들은 어떤 기능이 없지만, 그들이 안정되고 복제 될 수 없기 때문에, 따라서 그들은 단지 두 개의 딸 세포 중 하나로 지속 각 세포 분열 후에 희석된다. 따라서, 말초 혈액에서의 수준은 흉선 및 골수의 출력 추정값으로서 가정 될 수있다.
TREC 분석은 주로 흉선 출력의 정도를 평가하기 위해 지난 15 년 동안 사용되었지만, 초기에 개발 된 1 KREC 분석은 B 세포의 증식 및 건강과 질환에서의 B 세포의 항상성에 기여 2 측정 최근 골 m의 마커로서 제안되었다출력 화살표. 3,4 여기, 우리는 우리가 TRECs과 KRECs 모두의 동시 정량을 위해 개발 된 방법을 설명합니다. (4)
이 조합 된 방법으로, 실시간 PCR에 의해 DNA 정량 연관된 가변성 TRECs, KRECs 및 T 세포 수용체 알파 상수의 단편을 함유하는 트리플 삽입 플라스미드를 희석 한 고유의 표준 곡선을 사용 (TCRAC)에 의해 제거된다 1 : 1 : 1 비율의 유전자. 이것은 TREC와 KREC 카피 수의 더 정확한 평가를 할 수있다. 또한, 동일한 반응에서 두 타겟의 동시 정량 시약 비용 감소를 허용한다.
제안 된 TREC / KREC 분석은 중증 복합 면역 결핍 (SCID), 4 공통 변수 면역 결핍, 5자가 면역 질환, 6-8과 HIV 감염 어린이 또는 성인의 T-의 범위와 B 세포 신 생산을 측정하기 위해 유용 할 수 있습니다 . (9) 또한,이 사용 가능환자 KREC 정량화를 사용하여 식별 될 수 agammaglobulinemia SCID 환자 근본적인 유전 적 결함에도 불구 TREC 분석법을 인식하고 있기 때문에, 최종적. 6-8, 조혈 줄기 세포 이식, 10 효소 대체 (11)와 바이러스 9 또는 면역 요법 후에 면역 회수를 모니터링하고, , TREC / KREC 분석은 또한 신생아 스크리닝 프로그램에서 immunodeficiencies를 검출하는데 사용될 수있다. (12)이 경우, 시험 혈액 도말의 작은 반점에서 추출한 DNA에 대해 수행하고 여과지상에서 건조되어야 고도로 민감하고 특이이어야 표적 질환뿐만 아니라 재현성이 높은 비용 효율적인.
위스콘신부터 소개하는 첫번째되었을 때 시험에 KREC 정량의 도입은 일상적으로 2008 미국 (WI, MA, CA)의 일부 지역에서 수행 된 immunodeficiencies에 대한 신생아 선별 검사의 성능을 개선한다그 산후 검진 프로그램에 TRECs의 전자 분석. (13)
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Protocol
참고 : 윤리 문 :이 프로토콜은 우리의 기관, Spedali Civili 디 브레시아의 지침을 다음과
"트리플 삽입"플라스미드 1. 준비
- 선택 및 적절한 출발 물질의 제조 :
- 이러한 EDTA 튜브에 수집 젊은 건강한 피사체의 말초 혈액으로 PCR에 의해 검출 TRECs과 KRECs을 발생할 가능성이 매우 높습니다 세포를 포함하는 샘플을 얻습니다.
주 : 원래 우리 KRECs위한 편도선 단편으로부터 TRECs 및 단핵 세포에 대한 흉선 세포를 이용하는 방법을 개발했지만, 정상인 보통 TRECs 및 PCR에 의해 그 검출을 허용하기에 충분한 양의 KRECs있다. 따라서, 말초 혈액 구하기과 함께 작동하도록 쉽게 유효한 대안이어야한다. 하지 않을 경우 TRECs는, 특히, 어린이, 젊은 성인에서 건강한 성인에서 연령, 말초 혈액으로 감소 점을 감안 좋습니다. - 별도의 말초 혈액 mononuc표준 밀도 구배 분리법에 의해 리어 세포 (PBMC).
- 이러한 EDTA 튜브에 수집 젊은 건강한 피사체의 말초 혈액으로 PCR에 의해 검출 TRECs과 KRECs을 발생할 가능성이 매우 높습니다 세포를 포함하는 샘플을 얻습니다.
- DNA 추출 :
- 상업 DNA 혈액 미니 키트를 사용 PBMC에서 DNA를 추출합니다. 아래에 설명 된 몇 가지 수정을 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 1,400 rpm에서 진탕 인큐베이터를 사용하여 10 분 동안 70 ° C (대신 56 ° C에서)에서 샘플을 품어.
- 70 ℃에서 5 분 동안 배양 및 제조 업체의 지침에 따라 원심 분리하여 DNA를 용출, 컬럼에 70 ° C로 가열 용출 버퍼를 추가합니다. 280 분의 260 nm에서 분광 추정에 의해 추출 된 DNA 농도를 결정합니다.
- 상업 DNA 혈액 미니 키트를 사용 PBMC에서 DNA를 추출합니다. 아래에 설명 된 몇 가지 수정을 제조업체의 지침을 따르십시오.
- TREC KREC 신호 및 관절 (SJ) 및 TCRAC 참조 유전자의 삽입을 함유하는 플라스미드의 제조 :
- TRECs, KRECs 및 TCRAC 특이 프라이머 (TREC-SJ, KREC-SJ 및 TCRAC 단편을 얻기 위해) PBMC에서 추출한 DNA를 증폭 (표 1 참조).
주 : 5 '말단에서 KREC- 및 TCRAC 특이 프라이머 (이탤릭체로 표시) 추가적인 뉴클레오타이드를 플 랭킹의 적절한 수의 (표 1에 도시 서열 낮은 경우)를 HindIII 및를 SpeI 제한 부위를 포함하고; 두 기능은 정식 KREC과 TCRAC 시퀀스에 존재하지 않습니다.
- TRECs, KRECs 및 TCRAC 특이 프라이머 (TREC-SJ, KREC-SJ 및 TCRAC 단편을 얻기 위해) PBMC에서 추출한 DNA를 증폭 (표 1 참조).
| TRECs | 앞으로 | 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 ' |
| 역 | 5'-GGC TGT CTG TCT TGA ACA TTT GC-3 ' | |
| KRECs | 앞으로 | 5'-CCC AAG CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 ' |
| 역 | 5'-CCC AAG CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 ' | |
| TCRAC | 앞으로 | 5'-G 교류 태그 문신 GAG ACC GTG의 ACTTGC CAG-3 ' |
| 역 | 5'-G 교류 태그 TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 ' |
표 1. 프라이머는 복제 과정에 사용됩니다. 5'-끝에, 소문자로 제한 효소 사이트에 해당하는 뉴클레오티드를 나타내, 이탤릭체 뉴클레오티드의 측면에 추가되어 표시되는 반면.
- 1X 버퍼 II로 구성된 25 ㎕의 최종 부피에서 PCR 반응을 수행가 1.5mm의 MgCl 2 (200 μM 각각), 프라이머 900 nM이었다의 AmpliTaq DNA 중합 효소 (2.5 U / 25 μL)의 최종 농도의 dNTP 혼합물, 및 DNA의 100 NG.
- 다음 PCR 매개 변수를 사용하여 10 분 동안 95 ° C에서 첫 번째 단계, 30 초 동안 95 ° C의 40주기 다음을; 30 초 동안 60 ° C; 30 초 동안 72 ° C, 10 분 동안 72 ° C의 마지막 1주기. PCR 제품 길이는 같아야합니다 TRECs 380 BP, K 166 bp의증권 (RECs), TCRAC 381 bp의.
- 을 pCR2.1-TOPO 벡터의 TA 수용체 사이트에서 TREC-SJ의 PCR 제품을 넣습니다. 세포 구비 프로토콜 다음 열 충격 XL1 블루 화학적 적격 세포의 플라스미드 DNA를 변형. 때문에 암피실린 내성의 성장 식민지 중에서 때문에 손실 β - 갈 락토시다 보완의 흰색 나타나고, 마스터 요리로 접종 할 삽입을 들고 사람들을 식별합니다. 마지막으로, PCR에 의해 TREC 단편을 함유하는 콜로니를 식별.
- 확인 된 식민지 중 하나를 확장하고 플라스미드 미니 프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 플라스미드 DNA를 SpeI와 제한 효소 증폭 산물을 TCRAC 다이제스트를 SpeI 제한 부위에 TCRAC 단편을 결찰.
- XL1 블루 세포에서의 플라스미드 DNA를 PCR에 의해 변화시키고 TCRAC 단편을 함유하는 콜로니를 식별. 확인 된 식민지 중 하나를 확장하고 정화플라스미드 미니 프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA.
- 플라스미드 DNA를 HindⅢ와 함께 KREC 증폭 산물을 HindIII로 소화하고 제한 부위로 KREC-SJ 단편을 클로닝. XL1 블루 세포에서의 플라스미드 DNA를 PCR에 의해 변화시키고 제 단편을 함유하는 콜로니를 식별.
- 염기 서열 분석에 의해 확인, 세 개의 인서트의 존재 및 돌연변이의 부재. 마지막 트리플 삽입 플라스미드의 맵은 그림 1에 표시됩니다.
그림 1. 트리플 삽입 플라스미드지도. TREC, KREC, TCRAC 시퀀스 및 제한 효소 사이트의 위치를 나타내는 트리플 삽입 플라스미드지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 식별 된 콜로니 중 하나를 확대 midiprep 플라스미드 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제. 260/280 nm에서 분광 광도법에 의해 추정 플라스미드 DNA 농도 및 겔 전기 영동에 의해 DNA의 품질을 결정한다. -80 ° C에서 플라스미드의 적절한 분량을 저장 (예. 50 μL 각).
2. 표준 곡선 준비
참고 : 특별히 DNA 이월의 봉쇄를 위해 설계된 장소에서 0.1X TE 버퍼에 모든 희석을 준비합니다.
- (m p = : 관심 플라스미드 카피 수의 질량을 계산 플라스미드 크기는 4,846 bp의가 있음을 고려하여, (표 2 참조)과 BP 당 평균 질량은 1.096 × 10 -21 g / BP, 따라서인지 4846 BP) × (1.096 × 10 -21 g / BP) = 5,311.216 × 10 -21 g = 5.311 × 10 -18 g.
| 복사 # | X 5.311 × 10 -18 g | 플라스미드 DNA의 질량 (g) |
| 1 × 10 (6) | 5.311 × 10 -12 |
| 1 × 10 5 | 5.311 × 10 -13 |
| 1 × 4 | 5.311 × 10 -14 |
| 1 × 3 | 5.311 × 10 -15 |
| 1 × 2 | 5.311 × 10 -16 |
각각의 표준 곡선 희석 지점에 필요한 플라스미드 표 2. 질량.
- 각 반응에 피펫 될 볼륨 (5 μL)에 의해 필요한 플라스미드 질량을 나눔으로써 플라스미드 DNA의 농도를 계산한다 (표 3 참조).
| 플라스미드 DNA의 질량 (g) | ÷ 5 μL | 플라스미드 DNA의 최종 농도 (g / μL) |
| 5.311 × 10 -12 | 1.062 × 10 -12 | |
| 5.311 × 10 -13 | 1.062 × 10 -13 | |
| 5.311 × 10 -14 | 1.062 × 10 -14 | |
| 5.311 × 10 -15 | 1.062 × 10 -15 | |
| 5.311 × 10 -16 | 1.062 × 10 -16 |
각 희석 지점에 필요한 플라스미드 농도 표 3. 계산.
- 플라스미드의 나누어지는을 녹여. 효소 XhoI으로 플라스미드 DNA의 2 μg의 선형화와 B 농도를 결정280 분의 260 nm에서 Y 분광 추정.
- (예, 100 NG / μL = 0.1 ㎍ / μL = 1 × 10-7 g / μL)에서 시작하도록 편리한 작업 원액을 달성하기 위해 선형화 된 플라스미드 DNA의 적절한 희석액을 준비한다. C ° -80에서 선형화 된 플라스미드 DNA의 나머지를 저장합니다.
- 1 × 10 -10 g / μL의 더 가능한 농도에서 플라스미드를 가지고 100 희석 : 1:10 1의 편리한 번호를 수행합니다.
- 일련의 제 표준 커브 점을 준비하는 데 필요한 (1 × 106 복사본 대응 1.062 행 × 10 -12 g - 화학식 C 1 V 1 = 희석 량을 계산하는 C 2 V 2 (V 1 V 2)을 사용하여 / 5 μL, 표 4 참조).
| 초기 진한. (g / μL) | 플라스미드 DNA의 부피 (μL) | DilueNT를 권 (μL) | 최종 권. (μL) | 최종 진한. (g / μL) | 플라스미드 DNA의 최종 카피 수 / 5μL |
| C 1 | V (1) | V 2 -V (1) | V 2 | C 2 | |
| 1 × 10-7 | 5 μL | 45 μL | 50 μL | 1 × 10 -8 | N / A |
| 1 × 10 -8 | 5 μL | 495 μL | 500 μL | 1 × 10 -10 | N / A |
| 1 × 10 -10 | 5 μL | 465 μL | 470 μL | 1.062 × 10 -12 | 1 × 10 (6) |
| 1.062 × 10 -12 | 50 μL | 450 μL | 500 μL | 1.062 × 10 -13 | 1 × 10 5 |
| 1.062 × 10 -13 | 50 μL | 450 μL | 500 μL | 1.062 × 10 -14 | 1 × 4 |
| 1.062 × 10 -14 | 50 μL | 450 μL | 500 μL | 1.062 × 10 -15 | 1 × 3 |
| 1.062 × 10 -15 | 50 μL | 450 μL | 500 μL | 1.062 X 10 (16) | 1 × 2 |
표 4. 희석 계산.
- 나머지 표준 곡선의 점수를 획득 1:10 희석의 정규 시리즈를 진행합니다.
참고 : 다음을 수행하기 전에 간단히 각각의 플라스미드 희석 와동하는 것을 잊지 마십시오.
참고 : 보안 목표 명세서의 가장 높은 희석플라스미드 DNA의 같은 작은 양이 충분히 안정된 미래 사용을 위해 저장 될 수 없기 때문에 andard 곡선 (10 복사 / 5 μL)를, 단지 분석을 수행하기 전에 준비해야합니다. - 사용할 때까지 별도의 튜브에서 -80 ° C에서 트리플 플라스미드 희석 포인트를 저장합니다. 희석 트리플 플라스미드 DNA는 적어도 6 개월 이상에 매우 안정하다.
대상 샘플 3. DNA 추출
- 말초 혈액으로부터 PBMC 분리는 밀도 구배 분리 방법을 이용하여 EDTA 튜브로 모았다.
주 : 대안 적으로, 다른 적절한 출발 물질을 사용 (예, 림프구 아 집단, 전혈 정렬) 대상 시료로한다. - 단계 1.2에보고 된 대상 시료의 PBMC에서 DNA를 추출합니다.
TRECs 및 KRECs의 정량화 4. 실시간 PCR
- 플레이트 준비 및로드 :
- 각 샘플에 대한 적어도 두개의 복제물을 포함하는 PCR 플레이트 정렬분석 대상 : 표준 곡선 (A → F 1 → 4), 양성 대조군 (CTRL +, G1 → 4)없이 템플릿 컨트롤 (NTC; H 1 → 4).
주 : 표 5에 전형적인 방식을 관찰하지만, 다른 형식으로 만들 수 있습니다. TRECs 및 KRECs가 TCRAC과는 별개의 같은 우물에서 함께 증폭되는 것을 기억하십시오.
- 각 샘플에 대한 적어도 두개의 복제물을 포함하는 PCR 플레이트 정렬분석 대상 : 표준 곡선 (A → F 1 → 4), 양성 대조군 (CTRL +, G1 → 4)없이 템플릿 컨트롤 (NTC; H 1 → 4).
| TRECs + KRECs의 | TCRAC의 B | TRECs + KRECs | TCRAC | TRECs + KRECs | TCRAC | |||||||
| (1) | 이 | 3 | 4 | (5) | (6) | 7 | 8 | 9 | (10) | (11) | (12) | |
| 10 6 복사 | 10 6 복사 | 10 6 복사 | 10 6 복사 | (1) | (1) | (1) | (1) | 9 | 9 | 9 | 9 | |
| B | 105 복제본 | 105 복제본 | 105 복제본 | 105 복제본 | 이 | 이 | 이 | 이 | (10) | (10) | (10) | (10) |
| C | 10 4 복사 | 10 <SUP> 4 복사 | 10 4 복사 | 10 4 복사 | 3 | 3 | 3 | 3 | (11) | (11) | (11) | (11) |
| 디 | (10) 3 부 | (10) 3 부 | (10) 3 부 | (10) 3 부 | 4 | 4 | 4 | 4 | (12) | (12) | (12) | (12) |
| E | (10) 2 부 | (10) 2 부 | (10) 2 부 | (10) 2 부 | (5) | (5) | (5) | (13) | (13) | (13) | (13) | |
| F | 10 복사 | 10 복사 | 10 복사 | 10 복사 | (6) | (6) | (6) | (6) | (14) | (14) | (14) | (14) |
| G | CTRL + | CTRL + | CTRL + | CTRL + | 7 | 7 | 7 | 7 | (15) | (15) | (15) | (15) |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | 8 | 8 | 8 | 8 | (16) | (16) | (16) | (16) |
표 5. 샘플 실시간 PCR 플레이트.
- 별도의 튜브에 TRECs / KRECs 및 TCRAC (표 6 참조)에 대한 마스터 믹스를 제조 - 필요한 웰의 총 수를 계산한다 (가능한 피펫 팅의 오차를 고려하기 위해이 여분의 한 웰 포함).
참고 :. TRECs, KRECs 및 TCRAC에 대한 특정 프라이머 및 프로브를 표 7에 언급 된 프라이머 및 프로브 최종 농도는 각각 900 nm의 200 nm의입니다.
- 별도의 튜브에 TRECs / KRECs 및 TCRAC (표 6 참조)에 대한 마스터 믹스를 제조 - 필요한 웰의 총 수를 계산한다 (가능한 피펫 팅의 오차를 고려하기 위해이 여분의 한 웰 포함).
| TRECs / KRECs | TCRAC | ||
| H 2 O | 2 μL | H 2 O | 4.75 μL |
| 20 pmol의 / μL에 대한 KRECs | 1.125 μL | 20 pmol의 / μL에 대한 TCRAC | 1.125 μL </ TD> |
| KRECs 20 pmol의 / μl를 레브 | 1.125 μL | TCRAC 20 pmol의 / μl를 레브 | 1.125 μL |
| KRECs 프로브 10 pmol의 / μL | 0.5 μL | TCRAC 프로브 10 pmol의 / μL | 0.5 μL |
| 20 pmol의 / μL에 대한 TRECs | 1.125 μL | 배의 TaqMan 범용 PCR 마스터 믹스 | 12.5 μL |
| TRECs 20 pmol의 / μl를 레브 | 1.125 μL | ||
| TRECs 프로브 10 pmol의 / μL | 0.5 μL | ||
| 배의 TaqMan 범용 PCR 마스터 믹스 | 12.5 μL | ||
표시된 우물에 필요한 시약의 표 6 권.
| TRECs | 앞으로 | 5'-CACTC CCT TTC의 AAC 고양이 GCT-3 ' |
| 역 | 5'-AGG TGC TGC CTA ATC TGC A-3 ' | |
| 조사 | 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 ' | |
| KRECs | 앞으로 | 5'-TCC CTT AGT GGC ATT AT & T TGT ATC의 ACT-3 |
| 역 | 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC 태그 AGT-3 ' | |
| 조사 | 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3 | |
| TCRAC | 앞으로 | 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 ' |
| 역 | 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3 | |
| 조사 | 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 ' |
실시간 PC 용 프라이머 및 프로브의 서열 표 7.R 분석.
- 각 믹스 (TRECs / KRECs 및 TCRAC)의 20 μl를 추가합니다. 시약 준비실을 떠나기 전에, 광학 접착제 커버와 반응 판을 밀봉.
- 핵산 추출 방에서, 접착 커버를 들어 올려 게놈 DNA 샘플의 5 μL 추가 - 웰 (400 NG를 500). CTRL + 우물 (탯줄 혈액에서 얻은 PBMC에서 준비 즉,) 게놈 DNA의 5 μl를 추가합니다.
주 : 제대혈에 대한 대안으로서, 시료의 동일한 공지 양성 말초 혈 샘플 또는 풀로부터 DNA를 사용하거나 TREC-로부터 게놈 DNA 트리플 인서트 플라스미드의 결정된 양을 혼합하여 "인공"포지티브 표준을 준비 및 KREC 음성 세포주. - NTC 우물에 물 5 μl를 추가합니다. 광학 접착제 커버 다시 반응 판을 봉쇄.
- 플라스미드 DNA 이월 봉쇄을 보장하는 장소로 이동; 각 희석 Poin입니다 해동사용 전에 단지 플라스미드 DNA 표준 곡선의 t와 최고 희석액을 제조 (10 카피 / 5 μL). 만 →의 H 1 → 4 우물에서 접착 덮개를 들어 올려 플라스미드 DNA 표준 곡선의 각 점 희석의 5 μl를 추가합니다. 다시 접착 커버를 밀봉합니다.
- 따라서 시약 아래쪽에 위치하는 것을 보장 웰의 바닥에 기포의 유무를 확인한다.
- 실시간 PCR 시스템의 분석을 실행합니다. 표준 프로토콜은 2 내지 15 초 동안 95 ℃에서 변성, 45 회 반복 분, 10 분 동안 95 ° C에서 초기 가열, 및 결합 된 프라이머 / 프로브 어닐링 및 신장에서 50 ℃에서 첫 번째 단계로 구성 1 분 60 ° C에서.
- PCR 프로그램의 끝에서 데이터를 저장한다.
참고 : 핵산 추출을위한 별도의 영역 / 객실을 사용, DNA의 교차 오염을 방지 기억하려면 다음 정량 PCR에 대한 일반적인 좋은 실험실 연습 권장 사항을 따라 PCR 분석 실제 시간을 설정할 때시약 제조, 플라스미드 조작, 증폭 반응; 별도의 피펫 세트를 사용; 적절한 장갑 / 코트를 변경합니다.
- 결과 및 계산 :
참고 : 다음 단계는 일반적으로 실시간 PCR 용 재료 표에 언급 악기하지만, 구비 소프트웨어를 사용하여 우리의 경험에 기초하여, 그들은 다른 실시간 PCR 분석 플랫폼 및 소프트웨어에 적용한다. 동일한 소프트웨어를 사용하는 경우에도 일반적으로 요구되는 명령어 (예를 들어, 아이콘, 바로 가기)을 실행하는 하나 이상의 방법이있다, 명심하십시오.- 소프트웨어에 저장된 결과 파일을 열고 "결과"탭을 클릭합니다. 창의 상단에서 "분석"메뉴를 클릭하고 "분석 설정"을 선택합니다. 소프트웨어가 "모두"탐지기 "자동 코네티컷"(CT = 임계 사이클을 선택하여 임계 값을 자동으로 결정하자. 보자 소프트웨어 설정 "자동 기준"; 기본적으로 배경 제거합니다.
- 해당 드롭 다운 메뉴에서 세 "감지기"중 하나를 선택, 윈도우의 오른쪽 부분에 "증폭 플롯"라는 탭을 클릭하고 (TRECs 시작 예). 그냥 아래, 수동으로 임계 값을 설정하기 위해 "수동 코네티컷"를 선택하고, 윈도우의 하부로 이동하여 증폭 플롯을 보여 선택된 검출기의 표준 곡선 희석 포인트에 대응하는 우물을 선택한다. 이렇게하려면 그냥 클릭하고 테이블의 해당 셀 위에 마우스를 드래그합니다.
- 클릭 한 후, 수동으로 임계 값을 조정 위아래로 빨간색 임계 선을 끌어하기 위해 결과를 재분석하는 "분석". 임계 값을 설정하는 것은 결과에 미치는 영향을 확인하려면 "보고서"탭을 선택하고 각각의 표준 곡선 희석 포인트의 결과 코네티컷을 참조하십시오. 임계 값을 이동할 때, 최적의 배치를 얻기 위해 다음과 같은 권장 사항을 준수하려고합니다.
- "증폭 플롯"탭으로 돌아가서 임계 값이 충분히 배경 잡음 위와 같지만, 고원 단계 아래 기하 급수적으로 증폭의 영역에 있는지 확인하십시오. 증폭 플롯이 로그 스케일에 표시되지 않는 경우, "그래프 설정"과, "로그"의 선형 부분에 임계 값 절반 방법을 기술 한 바와 같이 후 실행 Y 축 설정 설정을 호출 할 음모를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 플롯 관찰 증폭 곡선은 대략 서로 평행.
- 코네티컷 결과를 확인하기 위해 "보고서"탭을 클릭합니다. 상기 임계 위치는 각 표준 곡선 희석 점의 반복에의 정밀을 최대화 결과를 생성하는지 확인.
- 임계 값이 가장 표준 곡선 희석 포인트 (최적의 감도)의 크기의 극단적 인 주문을 반영하는 지점에 배치되어 있는지 확인합니다. 나머지 두 검출기 (KRECs 및 T 단계를 반복 4.2.2 나머지 하위 단계CRAC).
- 보고서 탭으로 이동하여 모든 감지기 (TRECs, KRECs, TCRAC)에 대한 표준 곡선의 우물에 해당하는 셀을 선택하기 위해 윈도우의 하부에 테이블에 다시 마우스를 드래그합니다. 세 대상의 결과 코네티컷이 같은 희석 점에서 매우 유사하다는 것을 확인합니다 (예를 들어, 차이 이상 0.5 코네티컷). 필요한 경우 임계 값을 다시 조정하고 다시 확인합니다.
참고 : 트리플 삽입 플라스미드 각 대상 따라서 단일 카피가 포함되어 있기 때문에 증폭 비는 이론적으로 1에 가까워 야 : 1 : 1. 어떤 경우에는 수동으로 더 좋은 결과를 얻기 위해 감지기 중 하나 이상과 같은 기준을 조정할 필요가있다. 그때 "수동 기준"으로 설정, 조정이 필요한되는 검출기를 선택하고 시작 및 종료 사이클 (일반적으로 3-15)에 대한 사용자 지정 값을 삽입, "분석 설정"창을 기억합니다. 그런 다음 "OK & 다시 분석"을 클릭하고 이전 점을 다시 확인합니다. - 다음 항목 만 확인 후 실험 세션을 수락 :
- , "보고서"탭을 클릭 윈도우의 하부로 이동 NTC 우물을 선택하고 해당 코네티컷은 "Undet"인지 확인합니다 (즉, 더 증폭 NTC 우물에 없습니다).
- "표준 곡선"탭을 선택하고 플롯 윈도우의 오른쪽에 보면; 드롭 다운 메뉴에서 선택 감지기 및보고 표준 곡선의 기울기는 -3.55과 -3.32 사이의 범위 여부 (91의 효율성 PCR에 해당 - 100 %) 참조
- 결정 (R 2)의 계수 (각 검출기를 선택한 후, 동일한 "표준 곡선"탭)을 마우스 오른쪽 기울기와 절편 아래에 그 값을 읽고, 0.998 (그림 2)보다 더 높은 있는지 확인합니다.
그들은 높은 "LEVE이 (자신의 오정렬 기울기에 영향을 미칠 수 있기 때문에보다 쉽게 극단적 인 희석 점에 주목 : 주회귀선에 분노 "효과). 특히, 가장 높은 플라스미드 희석이 예상보다 빨리 저하 될 수 있음을 유의하십시오. 그러나 가능하면 그것은 합리적 접근법 정량적 검출 한계로 (100)를 고려할 수 있기 때문에, 그것들을 폐기하지 유용하다 : 10에서 100 사이의 샘플, 즉, 주행 용, 결과는 <100 "을 정으로보고 될 수있다 하지만, 정량화되지 "탐지", 곡선 범위 (<10) 외부에서 0으로보고 또는 수있는 경우는 동안 ".
주 : 각 희석 포인트에 대한 평균 값을 계산하기 위해, 이전의 표준 곡선 희석액 코네티컷 값들의 아카이브를 유지하는 것이 유용 할 수는 장래의 실험에 대한 최적의 "참조"영역 또는 내부 품질 검사의 정렬로 유지되어야 (예를 들어, Shewhart 컨트롤 차트를 구축 평균과 SD 계산). 유사하게, 그것은 양성 대조군의 과거 코네티컷의 아카이브를 유지하는 것이 도움이 될 수있다.
TRECs, KRECs 및 TCRAC 그림 2. 표준 곡선. 표준 곡선 점의 플롯 및 로그 회귀 라인이 TRECs (A)에 대한 추정 KRECs (B), 및 TCRAC (C)은 이상적인 지수 준수를 확인하기 위해 구축 100 %의 효율에 대응할 것이다 증폭률 (기울기 = 3.32). CT : 임계주기; R 2 :. 결정의 회귀 계수 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.- "보고서 '탭을 클릭하고 (차트 아래에있는 테이블의 해당 세포에서 발견) 양성 대조군의 코네티컷은 SA의 이전 분석의 결과와 일치하는지 확인나 양성 대조군을 알려져 있습니다.
주 : "보고서"탭 TRECs, KRECs 및 샘플 TCRAC의 양을 나타낸다는 소프트웨어가 적절하게 설정되어있는 임계 값과 기준선 후의 형 Ct 값을 사용하여, 각각의 표준 곡선으로부터 보간에 의해 계산되었는지 테스트되고 ( 새 임계 /베이스 라인과 새로운 분석) 결과를 변경합니다. 보간 표준 곡선에 일어난 위치를 확인하려면 다음 원하는 우물을 선택, "표준 곡선"탭을 선택하고 회귀선에 나타나는 검은 "X"를 찾습니다. 이들의 Y 축 값은 보간 된 양이다. 항상 동일한 양의 제어를 사용하는 경우, 적절한 기준 범위 및 / 또는 품질 제어 차트는 양성 대조군 이전에 결정된 값에 기초하여 구축 될 수있다.
- "보고서 '탭을 클릭하고 (차트 아래에있는 테이블의 해당 세포에서 발견) 양성 대조군의 코네티컷은 SA의 이전 분석의 결과와 일치하는지 확인나 양성 대조군을 알려져 있습니다.
- , '파일'메뉴에서 '저장'을 클릭 한 다음 .csv 파일을 "수출"테의 모든 우물의 양을 수출쉼표로 구분 된 값을 포함 XT 파일.
- 스프레드 시트 소프트웨어에서 the.csv 파일을 가져 적절하게 다음 수식을 설정하여 10 6 PBMC 당 TRECs의 번호 또는 KRECs를 계산 : [(TRECs 또는 KRECs의 양을 의미) / (TCRAC / 2의 양을 의미)] (10) (6) X
참고 : 각 셀의 예를 들어 두 TCRAC 유전자 사본, 각 염색체 하나가 있기 때문에 TCRAC의 평균 수량은 2로 나누어 져 있습니다.
참고 : TRECs 및 양성 대조군의 KRECs의 마지막 번호의 일관성은 인정하지만, 값이 완벽하기 때문에 표준 곡선 희석 포인트의 추가 변동 일치하지 않습니다 염두에 두어야 할 수있다. 총 차이가있는 경우에, 실험은 반복 될 필요가있을 수있다. 다시 말하지만, 관리도 적절한 기준 범위를 설정 구축 할 수있다. - 일반 혈액 검사의 결과를 사용할 수있는 경우, 다음과 같은 공식을 사용하여 혈액 1 ㎖ 당 TRECs 또는 KRECs을 계산 (선택 사항이지만 권장) :
TRECs 또는 1 × 106) × (림프구 + 단핵 세포 당 KRECs는 혈액 1 ㎖) / 10 (6) = 복사 / ml의 계산합니다.
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Representative Results
분석은 87 건강한 대조군의 대표 샘플에서 수행 하였다 : (42) 어린이는 0 세 - 17 (남성 / 여성 : 17분의 25)와 24 세 (45) 성인 - 60 (남성 / 여성 : 16분의 29)을. 결과를 계산 하였다 TRECs 10 6 PBMC 당 KRECs 후 혈액 1 ㎖ 당과 TRECs KRECs로서 수득 하였다.
4 년 - TRECs의 수는 인해 0-3 매우 날카로운 방식으로 특히 흉선 퇴화, 4 세 감소한다. 그것은 여성보다 남성에게 더 빠르게 감소하기 때문 성인에서, TREC 번호도 성별에 의존한다. (5)이, 연령 및 가능 성별에 기초하여 차별화 매우 정밀한 경우되어야 적절한 참고 범위를 설정하는 문제를 생성 할 수있다 정상의 추정이 필요하다.
건강한 DO 그림 3. TREC 정량 nors. TRECs의 양은 TRECs / 건강한 소아 10 (A)와 동일한 피험자 (C, D)에서 TRECs / ㎖로 계산 한 다음 성인 (B) 및 6 개의 세포로 하였다. 클리어 원 : 여성; 채워진 원 : 남성. 선은 로그 변환 데이터를 사용하여 선형 회귀에 의해 수득 하였다. 어린이, 두 회귀 라인은 더 나이 TREC 감소의 가변 속도를 표현하기 위해 설치되었다. 성인의 경우, 점선은 남성 (연속 선)에서보다 느린 여성에서 볼 TRECs의 나이가 감소 추세를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
성인의 골수 출력 수명 동안 비교적 안정하고, 성별에 의존하지 않는 반면 KRECs의 수는 단지 아이들 TRECs 유사한 패턴 나이 감소한다.
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도 4 :. 건강한 기증자 KREC 정량화 KRECs의 양은 건강한 소아 (A)와 동일한 피험자 (C, D)에서 KRECs / ㎖로 계산 한 다음 성인 (B)과의 KRECs / 106 개 세포로 하였다. 클리어 원 : 여성; 채워진 원 : 남성. 선은 로그 변환 데이터를 사용하여 선형 회귀에 의해 수득 하였다. 어린이, 두 회귀 라인이 더 나이 KREC 감소의 가변 속도를 표현하기 위해 설치되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대표적인 목적을 위해, 간단한 로그 - 선형 회귀 모델은 연령 TREC / KREC 감소의 패턴을 묘사에 장착했지만,보다 정제 비선형 모델 I가 끼워 질 수있다N 시도가 더 나이가 겉으로는 지수 KREC / TREC 감소를 예측합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
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